Filtres de leucodeplétion Des cellules CD34+ dérivées comme source cellulaire pour étudier la différenciation des mégacaryocytes et la formation de plaquettes

Résumé

Ce protocole décrit en détail toutes les étapes impliquées dans l’obtention de progéniteurs hématopoïétiques CD34+ dérivés de leucofiltres et leur différenciation et maturation in vitro en mégacaryocytes proplaquettaires capables de libérer des plaquettes dans le milieu de culture. Cette procédure est utile pour l’analyse approfondie des mécanismes cellulaires et moléculaires contrôlant la mégacaryopoïèse.

Résumé

L’expansion et la différenciation in vitro des progéniteurs hématopoïétiques humains en mégacaryocytes capables d’allonger les proplaquettaires et de libérer des plaquettes permettent une étude approfondie des mécanismes sous-jacents à la biogenèse plaquettaire. Les protocoles de culture disponibles sont principalement basés sur des progéniteurs hématopoïétiques dérivés de la moelle osseuse ou du sang de cordon ombilical soulevant un certain nombre de préoccupations éthiques, techniques et économiques. S’il existe déjà des protocoles disponibles pour obtenir des cellules CD34 à partir du sang périphérique, ce manuscrit propose un protocole simple et optimisé pour obtenir des cellules CD34+ à partir de filtres leucodéplétion facilement disponibles dans les centres sanguins. Ces cellules sont isolées à partir de filtres de leucodeplétion utilisés dans la préparation de produits de transfusion sanguine, correspondant à huit dons de sang. Ces filtres sont destinés à être jetés. Une procédure détaillée pour recueillir les progéniteurs hématopoïétiques identifiés comme des cellules CD34+ à partir de ces filtres est décrite. La méthode pour obtenir des mégacaryocytes matures prolongeant les proplaquettaires tout en discutant de leur évolution phénotypique est également détaillée. Enfin, le protocole présente une méthode de pipetage calibrée, pour libérer efficacement des plaquettes morphologiquement et fonctionnellement similaires aux plaquettes natives. Ce protocole peut servir de base à l’évaluation des composés pharmacologiques agissant à différentes étapes du processus pour disséquer les mécanismes sous-jacents et approcher les rendements plaquettaires in vivo.

Introduction

Les plaquettes sanguines proviennent de grandes cellules polyploïdes spécialisées, les mégacaryocytes (MK), qui proviennent d’un processus de production constant et affiné connu sous le nom de mégacarylopoïèse (MKP). Au sommet de ce processus se trouvent les cellules souches hématopoïétiques qui, au contact de l’environnement de la moelle osseuse (cytokines, facteurs de transcription, niche hématopoïétique), seront capables de proliférer et de se différencier en progéniteurs hématopoïétiques (HP) capables de s’engager vers la voie mégacaryocytaire, donnant naissance à des MK immatures¹. Sous l’influence de diverses cytokines, et en particulier de la thrombopoïétine (TPO), qui est la cytokine majeure de MKP; le MK subira alors deux grandes étapes de maturation : l’endomitose et le développement de membranes de démarcation (DMS). Ce MK complètement mature apparaît alors à proximité d’un vaisseau sinusoïdal dans lequel il peut émettre des extensions cytoplasmiques, les proplaquettaires, qui seront libérées sous le flux sanguin puis remodelées en plaquettes fonctionnelles^2. Le clonage du TPO en 1994³ a donné un coup de pouce à l’étude du MKP en accélérant le développement de techniques de culture in vitro permettant la différenciation HP et la maturation du MK.

Il existe de nombreuses pathologies affectant les plaquettes sanguines, à la fois en termes de nombre de plaquettes (augmentation ou diminution) et de fonction^4,5. Être capable de récapituler la MKP in vitro à partir de HP humaine pourrait améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents à ce processus et, en fin de compte, la prise en charge thérapeutique des patients.

Diverses sources de HP humaine conviennent: sang de cordon, moelle osseuse et sang périphérique^6,7,8. La récolte de HP dans le sang périphérique soulève moins de problèmes logistiques et éthiques que leur récupération du sang de cordon ombilical ou de la moelle osseuse. HP peut être récupéré de la leucaphérèse ou du pelage bouffant, mais ces sources sont coûteuses et pas toujours disponibles dans les centres de transfusion sanguine. D’autres protocoles, moins coûteux et plus faciles à réaliser, permettent la récupération directe des cellules mononucléaires du sang périphérique humain (PBMC) sans qu’il soit nécessaire de s’isoler préalablement par CD34^4,8. Cependant, la pureté des mégacaryocytes n’est pas satisfaisante avec cette méthode et une sélection de cellules CD34+ de PBMC est recommandée pour une différenciation optimale en MK. Cela nous a amenés à mettre en œuvre une purification HP à partir de filtres de leucoréduction (LRF), couramment utilisés dans les banques de sang pour éliminer les globules blancs et ainsi éviter les réactions immunologiques indésirables⁹. En effet, depuis 1998, les concentrés de plaquettes sont automatiquement leucodés en France. À la fin de ce processus, les LRF sont jetés et toutes les cellules retenues dans le LRF sont détruites. Les cellules des LRF sont donc facilement disponibles sans frais supplémentaires. Les LRF ont un contenu cellulaire proche de celui obtenu par leucaphérèse ou dans des couches bouffantes, notamment dans leur composition en CD34+ HP ce qui en fait une source remarquablement attrayante^10. Il a déjà été démontré que le LRF en tant que source HP humaine fournit aux cellules des capacités fonctionnelles intactes¹¹. Cette source a l’avantage d’être abondante et abordable pour la recherche en laboratoire. Dans ce contexte, cet article décrit successivement : i) l’extraction et la sélection de CD34⁺ HP à partir de LRF ; ii) une culture optimisée en deux phases, qui récapitule l’engagement de HP dans la voie mégacaryocytaire et la maturation de MK capable d’émettre des proplaquettaires; iii) une méthode pour libérer efficacement les plaquettes de ces MK; et iv) une procédure de phénotypage de MK et de plaquettes cultivées.

Protocole

Des échantillons humains témoins ont été obtenus auprès de donneurs de sang volontaires qui ont donné leur consentement éclairé écrit recruté par le centre de transfusion sanguine où la recherche a été effectuée (Etablissement Français du Sang-Grand Est). Toutes les procédures ont été enregistrées et approuvées par le ministère Français de l’Enseignement supérieur et de la Recherche et enregistrées sous le numéro AC_2015_2371.Les donneurs ont donné leur approbation dans le formulaire de consentement CODHECO numéro AC- 2008 - 562, afin que les échantillons soient utilisés à des fins de recherche. Des études humaines ont été réalisées conformément à la déclaration d’Helsinki.

1. Extraction et sélection des cellules CD34+ (HP) de LRF

1. Préparation du réactif (pour un LRF)
   1. Préparer 25 mL de tampon d’élution filtré : 21,25 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), 2,5 mL d’acide-citrate-dextrose (ACD) et 1,25 mL de sérum fœtal bovin (FBS) décomplémenté. Filtrer à 0,22 μm et placer à 37 °C.
   2. Préparer 500 mL de PBS avec 2 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA).
   3. Disposer de 25 mL de milieu de gradient de densité (DGM) (1,077 g/mL) dans deux tubes de 50 mL.
2. Modalités de rinçage à contre-courant LRF (Figure 1)
   REMARQUE: Cette étape nécessite une machine de soudage de tubes stériles, permettant la connexion stérile de tubes thermoplastiques.
   1. Tout d’abord, connectez le LRF à un sac de transfert vide de 600 mL et le LRF à un jeu de tubes (Figure 1A). Sous l’armoire de biosécurité, injecter le volume total de tampon d’élution filtré et préparé correspondant au nombre de LRF manipulés (xLRF x 25 mL) dans le sac vide. Ensuite, à l’aide d’une seringue de 30 mL pour aspirer doucement tout le contenu du sac à travers le LRF, rinçez à nouveau et transférez les cellules dans un nouveau tube de 50 mL(Figure 1B).
   2. Pour la sédimentation des globules rouges, diluer la suspension cellulaire de moitié avec Duxtran 2% et bien mélanger pour agréger les globules rouges. Attendez 30 min à température ambiante (RT).

Figure 1: Modalités de rinçage arrière du LRF. (A) Schéma représentatif de (i) la connexion stérile du sac de transfert au LRF et (ii) le jeu de tubes au LRF. (B) Schéma représentatif de la connexion des seringues pour la collecte des cellules. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Collection PBMC
   1. Après la sédimentation des globules rouges, retirez et transférez le surnageant dans un tube de 50 mL et remplissez-le de PBS-EDTA 2 mM. Superposez doucement le surnageant sur le DGM préparé ci-dessus. Laissez le surnageant s’écouler doucement sans casser le plan de surface du gradient de densité. Centrifuger à 400 x g à RT pendant 30 min en mode arrêt des freins.
   2. Collectez la couche PBMC à l’éventrante à l’éventreuse. Transférez les cellules de chaque tube DGM dans un nouveau tube stérile de 50 mL. Remplissez chaque tube avec PBS-EDTA 2 mM et lavez deux fois en 50 mL de PBS-EDTA 2 mM à 200 x g pendant 10 min à RT en mode freinage.
   3. Pipette et mise en commun de la pastille de cellule avec 50 mL PBS-EDTA 2 mM.
      REMARQUE: Il est possible d’arrêter la procédure en maintenant les cellules collectées sous agitation à 4 ° C pendant la nuit. Ensuite, filtrez la suspension avec une passoire cellulaire de 40 μm pour éliminer les agrégats formés.
4. Sélection des cellules CD34+
   1. Déterminez le nombre de cellules et centrifugez à 400 x g à température ambiante pendant 10 minutes avec la pause activée.
   2. Aspirer complètement le surnageant et le remise en caisse dans le volume approprié de PBS-EDTA 2 mM détaillé par le fabricant du kit de sélection CD34 (300 μL de PBS-EDTA pour 10⁸ cellules). Ajouter le réactif bloquant fcR et les microbilles CD34 à la concentration appropriée (50 μL pour 10⁸ cellules).
   3. Après 30 min à 4 °C, laver la suspension de la cellule et la remise en suspension dans le volume approprié de PBS-EDTA 2 mM détaillé par le fabricant du kit de sélection CD34 (500 μL pour 10⁸ cellules).
      REMARQUE: La sélection est faite sur les colonnes de tri pour le passage de maximum 2 x 10⁹ cellules par colonne.
   4. Passez l’échantillon sur la colonne humide de l’aimant. Laver deux fois avec 3 mL de PBS-EDTA 2 mM et éluer les cellules avec 5 mL de PBS-EDTA 2 mM. Une deuxième exécution sur une nouvelle colonne suivant la même procédure est nécessaire pour améliorer la pureté de l’échantillon.
      REMARQUE : Nombre prévu de 6,1 x 10⁵ cellules/LRF (Figure 2A). Pour des nombres de LRF plus élevés, augmentez les réactifs et les méthodes en conséquence.
5. Évaluation de la pureté des cellules CD34+
   1. Ajouter à une aliquote de 100 μL de suspension obtenue après la sélection^CD34+, 2 μL d’anticorps CD34-PE humain ou 2 μL d’IgG-PE (témoin). Bien mélanger et incuber pendant 15 min à 4 °C.
   2. Lavez les cellules en ajoutant 2 mL de PBS et centrifugez à 400 x g pendant 5 min. Aspirer complètement le surnageant et le rétablir dans 200 μL de PBS.
   3. Analyser la pureté par cytométrie en flux comme le montre la figure 2A et la discussion.
      REMARQUE: Une pureté des cellules CD34+ supérieure à 90% est attendue (Figure 2Bii).
   4. Utilisez les cellules CD34+ directement ou congelez-les pour une utilisation ultérieure.
6. Congélation de cellules CD34+
   REMARQUE: La congélation des cellules CD34+ se fait à une densité de 10⁶ cellules par mL.
   1. Après la détermination du nombre de cellules CD34+, préparer les milieux de cryoconservation suivants : (1) 60 % Stemspan + 40 % FBS, (2) 40 % Stemspan + 40 % FBS + 20 % Dimethyl Sulfoxide (DMSO) et permettre le refroidissement à 4 °C.
   2. Centrifuger les cellules CD34+ à 400 x g à température ambiante pendant 5 min et resuspender la pastille dans une solution froide 1 puis l’ajouter immédiatement à la solution froide 2 (v/v).
   3. Placez immédiatement les cryotubes dans un congélateur à -80 °C pendant 24 h, puis transférez les cryotubes dans le réservoir d’azote liquide.

2. Culture et différenciation de cellules CD34+ pour produire des mégacaryocytes matures porteurs de proplaquettaires

REMARQUE: Le protocole de culture cellulaire(Figure 3A),schéma représentatif de la procédure de culture cellulaire sont détaillés dans cette section.

1. Décongélation des cellules CD34+ (si nécessaire)
   1. Préparer la solution de décongélation : 13 mL de PBS-20 % FBS et placer à 37 °C pendant 15 min. Transférez rapidement les cryotubes dans un bain-marie à 37 °C jusqu’à un seul petit cristal de glace. Sous l’armoire de culture biologique, pipetter tout le contenu et transférer lentement dans 13 mL de solution de décongélation pré-avertie.
   2. Déterminez le nombre de cellules et la viabilité des cellules.
2. Protocole culturel, étape 1 : du jour 0 au jour 7
   NOTE: Habituellement, les cultures sont faites dans des plaques de 24 puits avec 1 mL de milieu par puits à une densité de 40 000 cellules viables / mL, correspondant à 20 000 cellules viables / cm². Il est crucial de respecter cette densité si une mise à l’échelle est prévue.
   1. Préparation du milieu de croissance : Dans les milieux d’expansion des cellules hématopoïétiques sans sérum (préalablement chauffés à 37 °C), ajouter la pénicilline-streptomycine-glutamine (PSG) 1x, la lipoprotéine de basse densité humaine (hLDL) à 20 μg/mL, le cocktail de cytokines d’expansion mégacarytaire 1x et la stemrégénine 1 (SR1) à 1 μM.
   2. Ensemencement cellulaire : Centrifuger les cellules CD34+ décongelées à 400 x g à température ambiante pendant 5 min. Retirez soigneusement le surnageant et ressuspendez la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu de culture et effectuez une numération cellulaire et une viabilité pour déterminer le volume approprié pour ensemencer les cellules.
   3. Centrifuger les cellules 400 x g à température ambiante pendant 5 min et ressuspender la pastille dans le volume approprié du milieu de croissance chaud. Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 7 jours.
3. Protocole de culture, étape 2 : du jour 7 au jour 13(Figure 3B,images représentatives au jour 13)
   NOTE: Habituellement, les cultures sont faites dans des plaques de 24 puits avec 1 mL de milieu par puits à une densité de 50 000 cellules viables / mL, correspondant à 25 000 cellules viables / cm². Il est crucial de respecter cette densité si une mise à l’échelle est prévue.
   1. Préparation du milieu de maturation : Dans les milieux d’expansion des cellules hématopoïétiques sans sérum (préalablement chauffés à 37 °C), ajouter PSG 1x, hLDL à 20 μg/mL, TPO à 50 ng/mL et SR1 à 1 μM.
   2. Examinez les cellules au microscope. Au jour 7, les cellules présentent un aspect rond et homogène en remplissant les puits ou les flacons sans être trop confluentes.
   3. Sous une armoire de biosécurité, transférez doucement les cellules dans un tube de 15 mL. Lavez les puits avec PBS. Ensuite, déterminez le nombre de cellules et leur viabilité pour calculer le volume approprié pour ensemencer les cellules.
   4. Centrifuger les cellules à 400 x g à température ambiante pendant 5 min. Retirez le surnageant et ressuspendez les cellules dans le volume approprié de milieu chaud calculé à l’étape précédente. Incuber les cellules à 37 °C, 5% de CO₂ pendant 6 jours.
4. Libération plaquettaire cultivée au jour 13
   1. Ajouter 0,5 μM de prostaglandine_I2 (IGP₂₎ et 0,02 U/mL d’apyrase à la culture et effectuer cinq fois le pipetage successif avec une pipette de 1 mL.
      REMARQUE: Les plaquettes sont maintenant libérées dans le milieu.

3. Analyse par cytométrie en flux (phénotypage MK et numération plaquettaire cultivée)

REMARQUE: Ce protocole peut être appliqué au phénotypage des cellules les jours de culture sélectionnés. Il permet également de déterminer le nombre de la libération plaquettaire cultivée (Figure 4A,B).

1. Préparation à l’analyse MK
   1. Étiquetez quatre ensembles de tubes de microcentrifugation comme suit : Cellules non étiquetées comme témoin, cellules + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488, Cellules + 5 μL CD34 - PECy7, Cellules + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488 + 5 μL CD34 - PECy7. Utilisez un minimum de 1,10⁵ cellules par tube, ne dépassez pas 1,10⁶ cellules par tube. Ajouter à 100 μL de suspension cellulaire par tube de cytométrie et les différents anticorps. Incuber dans l’obscurité pendant 30 min à 4 °C.
   2. Ensuite, ajoutez 2 mL de PBS-EDTA 2 mM par tube et centrifugez à 400 x g pendant 5 min à température ambiante. Pendant la centrifugation, préparer une solution de PBS-EDTA 2 mM + 7-Aminoactinomycine-D (7AAD) (1/100), prévoir une solution de 300 μL par tube.
   3. Retirez le surnageant et prenez la pastille dans 300 μL de PBS-EDTA 2 mM avec 7AAD. Faire passer les échantillons dans le cytomètre en flux dans les 30 minutes.
      REMARQUE : La stratégie d’analyse de la cytométrie en flux est illustrée à la figure 3C et dans la discussion.
2. Préparation de tubes pour l’analyse plaquettaire en culture
   1. Étiquetez quatre ensembles de tubes de microcentrifugation comme suit : Cellules non étiquetées comme témoin, Cellules + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488, Cellules + 20 μL CD42a - PE, Cellules + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488 + 20 μL CD42a - PE. Après cinq pipetages successifs dans un puits de culture, transférer 300 μL de la suspension dans un tube pour cytométrie contenant un nombre étalonné de billes fluorescentes.
   2. Ajouter les anticorps et incuber dans l’obscurité à TA pendant 30 min.
   3. Passez les échantillons à travers le cytomètre en flux dans les 30 minutes et réglez l’acquisition pour le passage de 5 000 perles.
      REMARQUE : La stratégie d’analyse de la cytométrie en flux est illustrée à la figure 4B et dans la discussion.

Résultats

Extraction et sélection de cellules CD34+ à partir de LRF
Ici, la méthode, dérivée de Peytour et al.⁹, décrit l’extraction et la sélection de cellules CD34⁺ à partir de LRF rejetées disponibles dans les banques de sang après l’élimination des leucocytes. À la suite de la procédure de rinçage arrière, habituellement 1,03 x^{10 9} ± 2,45 x^{10 8} cellules/LRF (Moyenne±SEM; n = 155) sont récupérés avec une viabilité de 94,88 ± 0...

Discussion

Ce protocole décrit une méthode de production de MK capable d’émettre des proplaquettaires à partir de HP d’origine sanguine et de libérer des plaquettes du milieu de culture. Les HP sont obtenus à partir de LRF, un sous-produit des banques de sang, utilisé pour éliminer les leucocytes contaminants des produits sanguins cellulaires et éviter les effets indésirables. Bien que cette méthode soit relativement simple, quelques points méritent une attention particulière.

Le dépôt...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-AAD	Biolegend	558819
ACD	EFS-Alsace	NA
Anti-CD34-PE	Miltenyi biotec	130-081-002
Anti-CD34-PECy7	eBioscience	25-0349-42
Anti-CD41-Alexa Fluor 488	Biolegend	303724
Anti-CD42a-PE	BD Bioscience	559919
Apyrase	EFS-Alsace	NA
BD Trucount Tubes	BD Bioscience	340334
CD34 MicroBead Kit UltraPure, human	Miltenyi biotec	130-100-453
Centrifuge	Heraeus	Megafuge 1.OR	Or equivalent material
Compteur ADAM	DiagitalBio	NA	Or equivalent material
Cryotubes	Dutscher	55002	Or equivalent material
Dextran from leuconostoc spp	Sigma	31392-50g	Or equivalent material
DMSO Hybri-max	Sigma	D2650
EDTA 0.5 M	Gibco	15575-039
Eppendorf 1,5 mL	Dutscher	616201	Or equivalent material
Filtration unit Steriflip PVDF	Merck Millipore Ltd	SE1M179M6
Flow Cytometer	BD Bioscience	Fortessa
Human LDL	Stemcell technologies	#02698
ILOMEDINE 0,1 mg/1 mL	Bayer	MA038EX
Inserts	Fenwal	R4R1401	Or equivalent material
Laminar flow hood	Holten	NA	Archived product
LS Columms	Miltenyi Biotec	130-042-401
Lymphoprep	Stemcell	7861
Pen Strep Glutamine (100x)	Gibco	10378-016
PBS (-)	Life Technologies	14190-169	Or equivalent material
PGi2	Sigma	P6188
Poches de transferts 600ml	Macopharma	VSE4001XA
Pre-Separation Filters (30µm)	Miltenyi Biotec	130-041-407
StemRegenin 1 (SR1)	Stemcell technologies	#72344
StemSpan Expansion Supplement (100x)	Stemcell technologies	#02696
StemSpan-SFEM	Stemcell technologies	#09650
Stericup Durapore 0,22µm PVDF	Merck Millipore Ltd	SCGVU05RE
SVF Hyclone	Thermos scientific	SH3007103
Syringues 30 mL	Terumo	SS*30ESE1	Or equivalent material
Syringe filters Millex 0,22µM PVDF	Merck Millipore Ltd	SLGV033RB
TPO	Stemcell technologies	#02822
Tubes 50 mL	Sarstedt	62.548.004 PP	Or equivalent material
Tubes 15 mL	Sarstedt	62.554.001 PP	Or equivalent material
Tubulures	B Braun	4055137	Or equivalent material