一锅纯无细胞系统

摘要

我们提出了一种使用标准实验室设备生产重组纯纯无细胞TX-TL系统的快速且经济高效的方法。

摘要

定义的 PURE（使用重组元素的蛋白质合成）转录-翻译系统为无细胞合成生物学提供了一个有吸引力的底盘。不幸的是，市售系统成本高昂，而且可调性有限。相比之下，可以根据用户需求定制自制方法。然而，由于需要核糖体以及36种中尺度蛋白质纯化，自制系统的制备既耗时又艰巨。通过共培养和共纯化简化蛋白质纯化可以最大限度地减少时间和劳动力需求。在这里，我们提出了一种简单，可调节，省时且具有成本效益的方法，使用标准实验室设备在1周内生产所有PURE系统组件。此外，OnePot PURE的性能可与市售系统相媲美。OnePot PURE制备方法由于其简单性和成本效益，将PURE系统的可访问性扩展到更多的实验室。

引言

无细胞转录翻译（TX-TL）系统构成了研究和工程生物系统的有前途的平台。它们提供了简化和可调的反应条件，因为它们不再依赖于维持生命的过程，包括生长，体内平衡或调节机制¹。因此，预计无细胞系统将有助于生物分子系统的研究，提供测试合理生物设计策略²的框架，并为未来的合成细胞^3，4提供底盘。完全重组的PURE系统由于其定义和最小的组成以及可调节性和可调性而提供了特别吸引人的底盘⁵。

自2001年第一个功能性、全重组的PURE系统建立^以来5，已努力扩大系统的限度并优化系统的组成，以提高系统的产量^6、7、8，允许转录调节^9、膜^10、11和分泌蛋白^合成12，并促进蛋白质折叠^13、14.如今，有三种商用系统：PUREfrex（GeneFrontier），PURExpress（NEB）和Magic PURE（Creative Biolabs）。然而，这些系统成本高昂，其确切组成是专有的，因此未知，适应性有限。

内部制备的PURE系统被证明是最具成本效益和可调选项^15，16。然而，蛋白质和核糖体级分所需的37个纯化步骤既耗时又乏味。已经进行了几次尝试来提高PURE系统制备效率17，18，19。我们最近证明，可以共同培养和共纯PURE系统中存在的所有必需的非核糖体蛋白。事实证明，这种OnePot方法具有成本效益和时间效率，可将制备时间从几周缩短到3个工作日。该方法产生一个PURE系统，其蛋白质生产能力可与市售的PURExpress系统²⁰相媲美。与之前简化PURE制备的方法^相反17，18，19，在OnePot方法中，所有蛋白质仍然在单独的菌株中表达。这使得用户能够通过省略或添加特定菌株或调整接种量来调整OnePot PURE系统的组成，从而分别产生辍学的PURE系统或改变最终的蛋白质比例。

这里提出的方案提供了一个详细的方法来创建OnePot PURE系统，如前所述^20，尽管β-巯基乙醇被三（2-羧乙基）膦（TCEP）取代。此外，还描述了两种核糖体纯化方法：使用疏水相互作用和蔗糖垫的传统无标记核糖体纯化，改编自Shimizu等人^15，以及基于Wang等人¹⁸ 和Ederth等人²¹ 但显着修改的Ni-NTA核糖体纯化。后一种方法进一步促进了PURE系统的制备，并使其可供更多的实验室使用，因为只需要标准的实验室设备。

实验方案总结了多功能纯净无细胞TX-TL系统的制备情况，以提供简单，可调谐，经济高效的无细胞平台，可在一周内使用标准实验室设备制备。除了介绍标准的PURE成分外，我们还指出了如何以及在何处进行调整，主要关注协议中的关键步骤，以确保系统的功能。

研究方案

注：该协议描述了从重组组分制备无细胞TX-TL系统的方法。为方便起见，该作品分为五个部分。第一部分描述了准备步骤，应在开始协议之前完成。第二部分描述了OnePot蛋白溶液的制备。第三部分描述了核糖体纯化，第四部分详细介绍了能量溶液的制备，最后一部分提供了建立PURE反应的手册。为方便起见，协议被划分为天，并在 表1中的每日时间表中总结。按照时间表，整个系统可以在1周内由一个人准备。

1. 前期工作

1. 制备细菌培养基和添加剂培养基，如 补充表1所述。准备并消毒所需的材料，包括移液器吸头，96个深孔板。
2. 菌株制备
   1. 使用热休克方法将 表2 中所示的表达菌株与相应的表达载体进行变换。
      1. 将纯化的质粒加入化学感受态细菌中，并在冰上孵育20-30分钟。
      2. 将混合物在42°C下放置30秒（热冲击），然后将其放回冰上2分钟。
      3. 将20μL细菌直接移取到含有氨苄西林（AMP）的琼脂平板上，并在37°C下孵育过夜。将板在4°C下储存长达1周。
      4. 接种3 mL含有AMP的LB培养基与来自琼脂平板的单个菌落。在37°C下孵育，同时以260rpm振荡过夜。
      5. 将250μL培养物与250μL50%（v / v）甘油混合并储存在-80°C。
         注意：为了将来更快地制备，请将菌株作为甘油储备储存在96孔板中。
   2. 通过菌落 PCR 和测序确认所有载体转化。对基因、启动子区域和核糖体结合位点进行测序。
3. 表达测试
   1. 在1.3mL深孔板中接种300μL含有AMP的LB培养基和约1μL制备的甘油储备。用透气膜密封板，然后在37°C下孵育，同时以260rpm振荡过夜。
      注意：此时，所有表达式都是单独完成的。
   2. 将300μL含有AMP的新鲜LB培养基接种1μL过夜培养物。在37°C下孵育，同时以260rpm振荡过夜。2小时后，用100μM异丙基β-D-1-硫代乳糖吡喃糖苷（IPTG）诱导细胞并再生长3小时。
   3. 将10μL培养物与10μL2x Laemmli缓冲液混合，并加热至95°C10分钟。使用台式离心机旋转样品1分钟，并将10μL上清液上装入PAGE凝胶上。将凝胶在Tris /甘氨酸/SDS缓冲液中以200 V运行30分钟。用去离子水冲洗干净。用考马斯蛋白染色剂覆盖凝胶，孵育1小时。如有必要，将凝胶在水中脱色（ 图1中表达测试的代表性结果）。
      注意：使用梯度（4%-15%或4%-20%）PAGE凝胶以实现良好的分离。
4. IMAC琼脂糖树脂修复和清洁
   1. 色谱柱制备。
      1. 通过涡旋将琼脂糖树脂充分混合。
      2. 将所需量的树脂移入空的重力流柱中。
         注意：所需的树脂量在His-核糖体纯化和蛋白质纯化之间有所不同，并在各自的部分中指定。
      3. 用30 mL去离子水洗涤树脂。
      4. 继续按照第 1.4.4 节中的规定进行列重新充电。
         注意：在继续下一步之前，请始终让所有液体通过色谱柱。但是，请确保色谱柱永远不会干涸。每当任何液体流过色谱柱时，请确保在液体到达树脂后立即停止流动或继续下一步。
   2. 恢复。
      1. 用30 mL去离子水洗涤色谱柱。
      2. 应用 10 mL 0.2 M EDTA 和 0.5 M NaCl 溶液。
      3. 加入30 mL的0.5M NaCl溶液。
      4. 用50 mL去离子水洗涤色谱柱。
      5. 在4°C下储存在20%（v / v）乙醇中或继续下一步。
   3. 清洗。
      注意：穿戴防护装备。
      1. 用30 mL 0.5 M NaOH洗涤色谱柱。
      2. 用30 mL去离子水洗涤色谱柱。
      3. 用30 mL 0.1M乙酸洗涤色谱柱。
      4. 用30 mL去离子水洗涤色谱柱。
      5. 用30 mL的70%（v / v）乙醇洗涤色谱柱。
      6. 用50 mL去离子水洗涤色谱柱。
      7. 在4°C下储存在20%（v / v）乙醇中或继续下一步。
   4. 重新充电。
      1. 向色谱柱中加入10 mL 0.1 M硫酸镍溶液。
         注意：硫酸镍有毒。硫酸镍废物需要按照供应商指示的预防措施进行丢弃。
      2. 用50 mL去离子水洗涤色谱柱。
      3. 在4°C下储存在20%（v / v））乙醇中或继续与色谱柱平衡。
         注意：如果色谱柱在步骤之间储存在乙醇中，请确保通过用水清洗色谱柱来除去所有微量乙醇。

2. OnePot蛋白溶液表达与纯化

注意：该协议由三部分组成，分为几天（图2）。理想的制备程序产生1.5 mL的13.5mg / mL OnePot蛋白溶液，相当于超过一千个10μL PURE反应。但是，溶液的量和理想浓度因批次而异。有经验的用户可以一次执行多个OnePot PURE准备工作。

第1天：

1. 制备细菌培养基和添加剂培养基，如 补充表1所述。
2. 准备并消毒所需材料，包括移液器吸头，两个96深孔板和一个1 L挡板锥形瓶。
3. 制备缓冲液和补充剂，如 补充表2中所述。使用瓶顶过滤器（0.45μm）对所有缓冲液进行过滤灭菌，并将其储存在4°C。 除非另有说明，否则在使用前用1mM TCEP补充所有缓冲液。
4. 使用2 mL琼脂糖树脂进行OnePot蛋白纯化。按照第 1.4 节中所述准备列。
5. 要制备起始培养物，将20 mL LB培养基与20μLAMP混合。在无菌的96，1.3mL深孔板中，将300μL培养基加入35孔中。用各自的应变接种它们中的每一个，除了伸长系数热不稳定（EF-Tu），并用透气膜密封板。
   注意：使用96孔复制器接种板（见 材料表）。深孔板的孔体积和起始培养物的体积至关重要。由于曝气不一致，较大的培养基体积或较小的孔体积将导致不同的细菌密度。
6. 对于EF-Tu培养，在带有卡扣帽的14 mL培养管中接种3 mLLB培养基。单个 3 mL 的 EF-Tu 培养物对于一个 OnePot 表达培养液就足够了。
7. 在37°C下孵育，同时以260rpm振荡过夜。

第2天：
注：除非另有说明，否则在室温下执行所有步骤。

8. 将 500 mL LB 培养基和 500 μL AMP 转入无菌挡板烧瓶中。
9. 用1675μLEF-Tu培养物和55μL深孔板中每种培养物接种OnePot PURE培养物（表2）。
   注意：在此步骤中，可以通过调整接种比例来调整整体蛋白质组成。确保整体接种量保持在3.6 mL不变。
   可选：为了确认所有菌株都生长过夜，使用读板器在96孔板中以600 nM（OD_600）测量过夜培养物的光密度。使用10x的稀释液进行光密度测量。
10. 在37°C下振荡260rpm孵育培养物2小时，或直到培养物的OD₆₀₀ 达到0.2-0.3。
11. 用500μL的0.1mM IPTG诱导培养物并再生长3小时。
12. 通过在4°C和3220×g下离心10分钟收获细胞，并将细胞沉淀储存在-80°C直至进一步使用。
    注意：为了优化时间，在第2天的孵育时间内准备第4节中描述的能量溶液（表1）。

第3天：

13. 测量以下步骤中描述的纯化所需的缓冲液量，并按照 补充表2所示将TCEP添加到所有缓冲液中。将剩余的不含TCEP的缓冲液储存在4°C以备将来纯化。
14. 用30 mL缓冲液A平衡带电的色谱柱（第2.4节）。25 mL缓冲液A通过后，从底部关闭色谱柱。同时，继续执行步骤 2.15-2.17。
15. 解冻细胞并使用血清学移液管将细胞沉淀重悬于7.5mL缓冲液A中。
16. 使用130瓦探头超声仪（见材料表，探头尖端直径：6 mm）裂解电池，参数如下：4 x 20 s脉冲打开，20 s脉冲关闭，70%振幅。如果超声处理成功，溶液将变暗（图2）。
    注意：确保在超声处理过程中将细胞保持在冰上。将探头放入溶液中足够深的位置，不要接触管子。如果产生大量的泡沫，能量传递将被阻尼。在这种情况下，让泡沫沉降，将探针更深地降低到溶液中，并延长超声处理时间。
17. 超声处理后立即在4°C下以21130×g离心20分钟，除去细胞碎片。将裂解物放在冰上。
18. 将上清液加入平衡柱中。从顶部关闭柱子，确保没有泄漏。使用管旋转器在4°C旋转下将塔孵育3小时。
19. 从色谱柱中洗脱未结合的组分，并用25 mL缓冲液A洗涤。
20. 用25 mL 25 mM咪唑缓冲液（23.95 mL缓冲液A和1.25 mL缓冲液B）洗涤色谱柱。
21. 用5mL 450mM咪唑缓冲液（0.5mL缓冲液A和4.5mL缓冲液B）洗脱蛋白质。始终将洗脱的蛋白质放在冰上。
22. 用25 mL HT缓冲液稀释洗脱液，将混合物保持在冰上。向 15 mL 离心过滤器中加入 15 mL，浓缩至 1.5 mL 的体积。将剩余的15 mL与浓缩溶液一起加入过滤器中，再次浓缩至1.5 mL。
23. 向浓缩样品中加入10 mL HT缓冲液，浓缩至1 mL。加入等量的储备缓冲液B并储存在-80°C直至进一步使用。
    注意：一轮交换/浓缩需要大约60分钟，在4°C下以3220×g旋转。
24. 在缓冲区交换期间，按照第 1.4 节中的规定恢复列。

第4天：

25. 使用供应商描述的布拉德福德测定法测量蛋白质浓度。用0.5 mL 3 kDa截止离心过滤器将样品浓缩至20mg / mL。
    注意：在浓度测量之前，将蛋白质溶液稀释25倍或50倍，以避免布拉德福德测定过度饱和。
26. 为了确定理想的蛋白质浓度，请在此阶段（第5.2节）使用不同浓度的蛋白质溶液进行表达测试。为了进行滴定，保持溶液的总体积恒定，并以五种不同的比例移取OnePot蛋白质溶液，包括储备缓冲液B（补充表7）。
27. 使用SDS-PAGE验证OnePot PURE蛋白质组成（图3A）。用7.5μL水稀释2.5μL样品，与10μL2x Laemmli缓冲液混合，然后将5μL和2.5μL样品上样到凝胶中。按照第 1.3.3 节中的指定运行 SDS-PAGE。
28. 在验证表达并调整浓度后，将蛋白质溶液等分到50μL等分试样中。将OnePot PURE蛋白质溶液储存在-80°C直至进一步使用。
    注意：如果怀疑蛋白质成分不存在，或者OnePot PURE中的浓度低于预期，请执行以下步骤。
29. 通过对所有培养物进行光密度测量（OD_600），检查相应菌株的过夜培养物是否以与其他培养物相当的速度生长。
30. 对特定菌株进行额外的表达测试，以验证可疑蛋白的表达。

3. 核糖体溶液

注意：介绍了两种不同的核糖体纯化策略，一种用于己西替丁标记，另一种用于未标记的核糖体。在标准亲和力Ni-NTA重力流柱上使用His纯化方法的主要优点是纯化简单，快速，并且不需要额外的实验室设备，例如FPLC系统和超速离心机。然而，与无标记核糖体相比，OnePot PURE反应中的蛋白质生产能力约为三分之一。因此，根据高产量是否对给定的应用重要来选择核糖体生产方法。

1. 他标记的核糖体纯化
   注意：该协议利用 大肠杆菌 RB1菌株，这是王教授（美国哥伦比亚大学）赠送^{的礼物18。}该菌株在50S核糖体蛋白（L7 / L12）的C末端具有己西替丁标签的基因组插入，允许使用Ni-NTA重力流柱进行纯化。通常的产率约为0.5 mL的3.45μM核糖体，足以进行超过500个10μL纯化反应。

第1天：

1. 制备细菌培养基和添加剂培养基，如 补充表1所述。
2. 准备并消毒所需材料，包括移液器吸头、一个 5 L 锥形瓶和一个 100 mL 锥形瓶。
3. 制备缓冲液和补充剂，如 补充表2中所述。使用瓶顶过滤器（0.45μm）对所有缓冲液进行过滤，并将其储存在4°C。

第2天：

4. 将5 mL树脂移液到色谱柱中，并按照第1.4节中的规定制备色谱柱。
   注意：由于树脂的体积较大，修复和纯化所需的时间要长得多。使用不同的色谱柱进行核糖体纯化，以避免交叉污染，并在纯化前彻底清洁。
5. 通过将35mL LB培养基接种在100mL锥形瓶中来制备 大肠杆菌 RB1菌株的过夜培养物。在37°C下孵育，同时以260rpm振荡。

第3天：
注：除非另有说明，否则在室温下执行所有步骤。

6. 将2LLB培养基加入5L无菌烧瓶中，用12mL过夜培养物接种，然后在37°C下孵育3-4小时，同时以260rpm振荡。
   注意：或者，在1 L挡板烧瓶中在4 x 500 mL培养物中进行细菌培养。
7. 通过在3220×g和4°C下离心10分钟沉淀细胞。 储存在-80°C直至进一步使用。

第4天：

8. 平衡步骤3.1.4中制备的色谱柱。用30 mL裂解缓冲液。
9. 使用血清学移液管将沉淀重悬于20mL裂解缓冲液中。
10. 用130瓦探针超声仪（见 材料表，探针尖端直径：6 mm）在冰上裂解细胞，参数如下：11 x 20 s脉冲打开;20 s 脉冲关闭，70% 振幅（有关程序详细信息，请参见步骤 2.16）。
11. 超声处理后立即通过在4°C下以21130×g离心20分钟除去细胞碎片。 将裂解物放在冰上。
12. 将上清液加载到色谱柱上，让它通过。
13. 用以下裂解和洗脱缓冲液的混合物洗涤色谱柱。
    1. 洗涤0：使用30 mL裂解缓冲液。
    2. 洗涤1：使用30mL的5mM咪唑（29mL裂解缓冲液，1mL洗脱缓冲液）。
    3. 洗涤2：使用60mL25mM咪唑（50mL裂解缓冲液，10mL洗脱缓冲液）。
    4. 洗涤3：使用30mL 40mM咪唑（22mL裂解缓冲液，8mL洗脱缓冲液）。
    5. 洗涤4：使用30mL的60mM咪唑（18mL裂解缓冲液，12mL洗脱缓冲液）。
14. 用7.5mL洗脱缓冲液洗脱核糖体。始终将洗脱的蛋白质放在冰上。
15. 将22μL纯β巯基乙醇加入45mL核糖体缓冲液中。
    注意：β巯基乙醇是有毒的。采取安全预防措施，在通风橱中工作。
16. 将洗脱液加入15 mL离心过滤器中，浓缩至1 mL。
17. 向浓缩样品中加入15mL核糖体缓冲液，并再次浓缩至1mL。
    注意：重复上一步两次。
18. 储存在-80°C直至进一步使用。
    注意：一轮交换/浓缩需要大约60分钟，在4°C下以3220×g离心。
19. 在缓冲区交换期间，按照第 1.4 节中的规定恢复列。

第5天：

21. 通过测量在核糖体缓冲液中以1：100稀释的样品在260 nM处的吸光度来确定核糖体浓度。稀释溶液的吸光度值为10对应于23μM的未稀释溶液，如前所述^16。
22. 实现 3.45 μM 的最终高液浓度。为了调节浓度，用核糖体缓冲液稀释核糖体，或者通过在4°C的3 kDa 0.5mL离心过滤器中以14000×g进一步浓缩它们。
    注意：为了获得最佳的系统表达，请进行核糖体浓度滴定（第5.2节，补充表7）。
23. 使用SDS-PAGE（图3A）验证核糖体组成，如第1.3.3节所述。用7.5μL水稀释2.5μL样品，与10μL2x Laemmli缓冲液混合，然后将5μL和2.5μL样品上样到凝胶上。

2. 无标签核糖体纯化
   注意：无标记核糖体纯化是使用FPLC系统（材料表）进行的，并且基于使用2 x 5 mL丁基柱的疏水相互作用色谱（材料表）。虽然核糖体可以从任何菌株中纯化，但使用 大肠杆菌A19（ 耶鲁大学CGSC的大肠杆菌 遗传资源）菌株是有利的，因为它的RNase I缺失^22。在冷室或冷却柜中在4°C下进行纯化。通常的产量约为0.5 mL的10μM核糖体，相当于500多个10μL PURE反应。

第1天：

1. 制备细菌培养基和添加剂培养基，如 补充表1所述。
2. 准备并消毒所需材料，包括移液器吸头、5 L 锥形瓶和 100 mL 锥形瓶。
3. 制备缓冲液和补充剂，如 补充表2中所述。使用瓶顶过滤器（0.45μm）对所有缓冲液进行过滤，并将其储存在4°C。

第2天：

4. 为了准备 大肠杆菌 A19菌株的过夜培养物，在100 mL锥形瓶中接种35mLLB培养基。在37°C下孵育，同时以260rpm振荡。

第3天：

5. 将2LLB培养基转移到5L无菌挡板烧瓶中，用30mL过夜培养物接种，然后在37°C下孵育3-4小时，同时以200rpm振荡。
6. 通过在4°C下以4000×g离心15分钟来沉淀细胞。 将沉淀重悬于25mL悬浮缓冲液中，并储存在-80°C直至进一步使用。

第4天：

7. 与步骤 3.2.13-3.2.19 并行执行步骤 3.2.8-3.2.12。
8. 使用130瓦探针超声仪（参见 材料表 和探针尖端直径：6 mm）在冰上解冻和裂解细胞，参数如下：12 x 20 s脉冲打开;20 s 脉冲关闭，70% 振幅（参见步骤 2.16 程序详细信息）。
9. 立即通过在4°C下以20000×g离心20分钟除去细胞碎片。
10. 吸出上清液并测量体积。加入等体积的悬浮缓冲液（高盐）以将硫酸铵的最终浓度调节至1.5M并充分混合。
11. 通过在4°C下以20000×g离心20分钟除去沉淀物。
12. 在FPLC纯化之前，使用0.45μm聚醚砜膜注射器过滤上清液，并将滤液收集在100mL玻璃瓶中。始终将上清液保持在4°C。
13. 设置FPLC系统，使用双丁基柱（2 x 5 mL）进行疏水相互作用色谱纯化，如下所示。对于此设置，一个色谱柱体积 （CV） 是指 10 mL 的体积。
14. 需要三个入口：两个作为缓冲线，一个作为样品线。由于净化器的默认设置，分别选择缓冲区C和缓冲区D的行A1和B1以及行A2作为样品线是很方便的。应用 4 mL/min 的默认流速，但泵清洗 （10 mL/min） 除外，除非另有说明。
    注意：由于TCEP是一种昂贵的试剂，因此只有在平衡步骤之后才将相应量的量加入缓冲液C和D中。
15. 在20%（v / v））乙醇中执行系统泵清洗，以清洁系统并去除先前纯化中的潜在污染物。手动设置 0.2 mL/min 的流速并安装色谱柱。停止流动。
16. 用水执行系统泵清洗。用3 CV的水清洗色谱柱。
17. 平衡：将入口 A1 和 A2 置于缓冲液 C 中，入口 B1 置于不含 TCEP 的缓冲液 D 中。执行泵清洗并用4 CV缓冲液C平衡色谱柱。
18. 将 TCEP 添加到缓冲区 C 和 D 中。
19. 准备15 mL管或透明的圆形馏分收集管到馏分收集器以收集4-5 mL洗脱级分。
20. 装载：将入口A2放入含有过滤样品的瓶子中。将大约90%的样品体积加载到色谱柱上。用20 mL含TCEP的缓冲液C稀释样品，并将10mL样品倒入柱上。重复稀释步骤至少两次，并将尽可能多的样品倒入色谱柱上。确保没有空气被吸入机器至关重要。
21. 洗涤步骤1：用3 CV缓冲液C洗涤以除去未结合的组分。
22. 洗涤步骤2：用5 CV的80%缓冲液C和20%缓冲液D洗涤。
23. 洗脱：通过施用50%的缓冲液C和50%的缓冲液D洗脱产物，总洗脱体积为5 CV。
24. 洗涤步骤3：使用100%缓冲液D洗脱所有强烈相互作用的污染物，总体积为5 CV。
25. 分析样品分数在260或280 nM处的吸收光谱（图4）。第一个峰显示加载和第一个洗涤步骤期间洗脱的未吸收蛋白质;第二个峰值显示在第二个洗涤步骤中洗脱的污染物。第三个峰值监测最终产品，最后一个峰值显示强烈相互作用的污染物。汇集与第三峰相对应的所有样品馏分以进行进一步处理。始终将洗脱的蛋白质放在冰上。
26. 将回收的馏分轻轻覆盖在四个聚碳酸酯超速离心管中的15 mL缓冲液上。将最多15 mL样品加入15 mL缓冲液中。确保很好地平衡管子的重量。通过在4°C下以100000×g超速离心16小时沉淀核糖体。
    注：确保超速离心管中没有裂缝。
27. 清理并重置列，如下所示。5 mL/min 的流速效果很好。将所有进水口放入水中，然后执行泵清洗。用2 CV的水清洗色谱柱。
    1. 将入口放入0.5 M NaOH溶液中，进行泵洗，然后用3 CV的NaOH洗涤色谱柱。
    2. 将进水口放入水中，进行泵洗，然后在2 CV水中洗涤色谱柱。
    3. 将入口置于0.1M乙酸溶液中，进行泵洗，然后用3 CV的乙酸溶液洗涤色谱柱。
    4. 泵洗并用2 CV的水清洗柱子。
    5. 将所有入口放入20%（v / v））乙醇中，执行泵洗涤步骤，并通过用3 CV的20%（v / v）乙醇溶液洗涤色谱柱，将色谱柱储存在20%（v / v））乙醇中。
       注：确保系统永不干涸或吸入空气。切勿将缓冲液直接涂在乙醇上，或将乙醇涂在缓冲液上。始终在中间加入一个水洗步骤，否则存在沉淀物堵塞色谱柱的风险。确保添加足够的样品收集管。

第5天：

28. 弃去上清液并小心地，在不干扰半透明沉淀的情况下，用0.5mL冰冷的核糖体缓冲液洗涤每个沉淀。重复此步骤两次。
29. 使用磁力搅拌棒（直径3mM，10mM长度）将每个透明沉淀重悬于100μL核糖体缓冲液中，使用尽可能低的速度在磁力搅拌器上。收集重悬的核糖体，并用额外的50μL核糖体缓冲液洗涤管。
    注意：半透明的颗粒很难看到。因此，小心地从管的侧面清洗颗粒。
30. 通过测量在核糖体缓冲液中以1：100的比例稀释的样品在260 nM处的吸光度来确定核糖体浓度。10的稀释溶液的吸光度对应于23μM的未稀释溶液，如前所述^16。
31. 实现 10 μM 的最终储液浓度。为了调节浓度，用核糖体缓冲液稀释核糖体，或者通过在4°C的3 kDa离心过滤器中以14000×g离心进一步浓缩它们。
    注：为了获得最佳的系统表达，请进行核糖体滴定（第5.2节，补充表7）。
32. 用SDS-PAGE（图3A）验证核糖体组成，如第1.3.3节所述。用7.5μL水稀释2.5μL样品，与10μL2x Laemmli缓冲液混合，然后将5μL和2.5μL样品上样到凝胶中。

4. 能源解决方案

注：这里介绍的2.5x能量溶液的组成是一个适用于标准TX-TL反应的溶液的示例。为了优化时间安排，请在第2天准备能量解决方案。详细解释了氨基酸溶液的制备，然后是最终的制备程序。

1. 氨基酸溶液
   注意：批量制备氨基酸溶液。制备至少2000μL的最终体积所需的氨基酸储备溶液的量将减少原本非常少量的称量误差。氨基酸溶液的总浓度受氨基酸的溶解度和相应的储备溶液浓度的限制。对于标准PURE系统，制备终浓度为3.25 mM的溶液。使用氨基酸溶液计算表（补充表3）作为模板。使用盐形式的半胱氨酸，以确保足够的溶解度。避免使用基于KOH的氨基酸制备方法。可以直接称量氨基酸的确切量到最终氨基酸溶液中，而无需为所有氨基酸制备储备溶液。但是，这更具挑战性且不那么精确。
   1. 按照 补充表3所述，为每种氨基酸准备储备溶液，酪氨酸除外。
      注意：由于氨基酸在水中的溶解度不同，储备溶液的相应建议浓度不同。
   2. 最小质量[mg]提供了获得目标总体积的足够量的储备溶液所需的近似最小质量，作为参考。
      注：最小质量的盈余为10%。
   3. 为了更容易地制备溶液，不要称量确切的氨基酸量，而是对于手头的质量，调整水的量以达到所需的浓度。使用 补充表3中的电子表格，根据填充的实际质量（浅黄色细胞）和所需浓度计算所需的去离子水（添加水[μL]）的量。
   4. 通过涡旋溶解氨基酸储备溶液，直到所有沉淀物溶解。单个氨基酸储备溶液可以在-20°C下储存数周。
      注意：有些氨基酸很难溶解在水中;该过程可能需要一些时间。
   5. 称取获得终浓度3.25mM所需的酪氨酸的确切量，直接进入用于氨基酸溶液的管中。
      注意：酪氨酸很难溶解在水中。直接添加它，而不是准备储备溶液。
   6. 加入相应量的氨基酸储备溶液和最终体积中指示的水，以加入[μL]柱（浅蓝色细胞）并涡旋溶液。将完成的氨基酸溶液储存在-80°C直至进一步使用。
2. 能源解决方案的制备
   注意：总共2.5x能量溶液分别含有0.75mM的每个氨基酸，29.5mM的乙酸镁，250mM的谷氨酸钾，5mM的ATP和GTP，2.5mM的CTP，UTP和TCEP，分别来自 大肠杆菌 MRE 600的8.75mg / mL的tRNA，50mM的磷酸肌酸，0.05mM的亚叶酸， 5 mM的亚精胺和125mM的HEPES。首次使用的用户以200μL的小批量制备能量溶液，将根据 补充表4 制备的单个溶液储存在-20°C或-80°C下供以后使用。
   1. 在冰上解冻 补充表5 中提到的所有水溶液。
   2. 同时，为 补充表4中列出的其余组分准备库存溶液。准备后将所有溶液放在冰上。
      注意：将500μLRNase和不含DNA酶的水直接加入小瓶中以溶解冻干的tRNA。通过轻柔的涡旋充分混合;限制移液以避免引入 RNaase。
   3. 将储备溶液和水的计算体积（补充表5）相加，并使用涡旋充分混合。始终将溶液放在冰上。
   4. 通过将1μL移液到pH试纸上来测量溶液的pH值，以确保溶液的pH值为中性。
   5. 将能量溶液以每管50-100μL等分在冰上，并储存在-80°C直至进一步使用。在等分时，经常涡旋主储液以防止组分沉淀。
      注意：可选地，对新制造的能源溶液进行活性测定，以对抗商业能源溶液，例如PURExpress中的溶液A。如果观察到系统与能量溶液的性能显着降低，则通过滴定（5-20mM）优化离子浓度，特别是镁离子可能是有利的。

5. 一锅纯反应

1. 基因模板
   注意：编码在T7启动子下游的蛋白质可以用来自线性或环状DNA的PURE表达。通过使用延伸PCR生成线性DNA模板，可以省略繁琐的克隆步骤。本研究的线性模板由PCR生成，如下所述，使用高保真DNA聚合酶（材料表）。本研究中使用的引物序列，熔化温度和热循环仪设置在 补充表6中指定。DNA模板的制备不包括在每日时间表中。
   1. 按照聚合酶供应商的建议设置 PCR 反应。
      注：高保真DNA聚合酶的优化参数（材料表）见补充表6。
   2. 使用基因特异性引物（500 nM）从质粒或基因组中扩增靶基因（例如eGFP）作为线性模板（有关参数，请参见补充表6）。
   3. 扩增产生较短的延伸，为以下扩展PCR步骤提供退火序列。
   4. 检查琼脂糖凝胶上的扩增子是否正确大小和纯度。
   5. 使用扩增的DNA作为后续扩展步骤的模板。设置至少50μL的反应。
   6. 使用扩展引物（2.5 nM）运行10个PCR扩增循环。完成扩增循环后，立即将最终引物（500 nM）加入相同的反应中，并运行30个循环以扩增扩展的PCR产物。在 补充表6中找到熔化温度和引物序列。
   7. 使用DNA纯化试剂盒纯化DNA片段，并在不含核酸酶的水中洗脱DNA，而不是含有洗脱缓冲液的EDTA。
   8. 检查琼脂糖凝胶上的线性模板，以确定正确的大小和纯度。
   9. 使用紫外可见分光光度计测量ng / μL中的DNA浓度。
2. 设置 PURE 反应
   注意：最终的反应成分是1x能量溶液，无标签核糖体或His-tag核糖体，OnePot PURE蛋白和DNA模板。反应体积比包括40%的能量溶液，30%的蛋白质和核糖体溶液，以及30%的DNA和水。典型的反应体积在5μL和25μL之间变化，在读板器上连续定量荧光蛋白的表达。使用绿色利斯 in vitro 翻译标记系统将荧光标记的赖氨酸残基结合到新合成的蛋白质中，以验证SDS-PAGE凝胶上非荧光蛋白的表达。给出了一个示例反应模板 附表7 帮助建立纯细胞无表达反应。黄色的细胞表示用户输入的值，橙色的细胞表示要选择性地添加到反应中的其他试剂。保持组分的体积比精确，以确保正确的离子平衡。例如，为了达到更高的蛋白质浓度，增加OnePot蛋白质溶液的浓度;然而，不要增加加入到反应中的蛋白质溶液的体积。
   1. 在电子表格中填写相应黄色细胞中DNA的浓度[ng / μL]和长度[碱基对]。使用2-10nM的DNA进行反应。
   2. 以μL为单位填充所需的总反应体积。
   3. 从冰箱中取出所需的试剂，并在冰上解冻。
      注意：可以在不降低功能的情况下重新冻结组件。但是，请尽可能减少冻融循环次数，并将样品储存在冰上的时间。
   4. 将计算出的水、DNA和能量溶液的量移液到PCR管的一侧或384孔板上孔的一角。在同一侧添加所需量的任何其他试剂。尽量减少每个实验的样品数量，以避免样品蒸发和实验开始时间偏差。
      注意：至关重要的是保持能量成分与蛋白质成分的物理分离，以避免能源的过早消耗和较低的产量。
   5. 将计算出的蛋白质和核糖体溶液量移液到PCR管的另一侧或384孔板的另一角。
      注意：尽可能使用预混液，以减少移液错误的影响。经过初步测试后，核糖体和蛋白质溶液可以混合并储存为一种溶液。
   6. 旋转短时间（30秒）以合并反应组分。为了防止读板器实验过程中的蒸发，加入35μL液体蜡并用透明密封剂密封板（见 材料表）。
   7. 在37°C下孵育至少3小时。
   8. 对于读板器上的读数，每2分钟测量一次所需波长的荧光强度（代表性结果如图 3B所示）。
   9. 对绿色裂隙标记的样品执行以下步骤。
   10. 无细胞表达后，用0.16μg/ μL RNase A在37°C下孵育样品30分钟，以除去Green Lys标记试剂盒的荧光背景。
       注意：使用 RNase A，因为其他类型的 RNases 不能很好地去除背景。
   11. 通过运行SDS-PAGE可视化蛋白质表达，如1.3.3节中所述。将未染色的凝胶在去离子水中轻轻洗涤，并使用488nm的激发波长在荧光成像仪上成像。
   12. 随后，使用传统的考马斯染色方法对凝胶进行染色。有关合适的参数，请参见 1.3.3 节。
       注意：使用推荐的核糖体浓度对蛋白质溶液进行滴定，如果需要，之后以最佳OnePot蛋白浓度滴定核糖体。使用商用PURExpress ΔRibosome试剂盒作为阳性对照。溶液A，因子混合物和核糖体溶液分别对应于制备的能量，OnePot蛋白溶液和纯化的核糖体。

结果

上述方案旨在促进在任何实验室中建立纯裸细胞无细胞TX-TL系统。该协议包括对PURE系统的三个不同部分的制备的详细说明：OnePot蛋白，核糖体和能量溶液。优化工作流程的详细每日计划如 表 1所示。工作流程针对他标记核糖体的纯化进行了优化，如果进行无标记核糖体纯化，时间范围可能会略有不同。一种制剂为至少500个10μL反应提供足够量的PURE。此外，制备的溶液在-80°C下稳定超过一年，并且可以承受多次冻融循环。

所有菌株的足够过表达水平对于最终蛋白质溶液的功能至关重要。 图1 显示了随后用于OnePot蛋白制备的所有36种菌株的成功过表达。过度表达的蛋白质条带强度的变化很可能是由于SDS-PAGE凝胶上样体积的偏倚。预期的蛋白质大小总结在 表2中。GlyRS和PheRS由两个不同分子量的亚基组成;其余34种蛋白质由单个亚基组成。该协议简单性和时间有效性的关键是共培养和共纯化步骤（图2）。通过增加EF-Tu菌株相对于所有其他表达菌株的比例来制备OnePot蛋白溶液。通过SDS-PAGE分析最终蛋白质的整体组成（图3A）。从凝胶（泳道2，3）中可以明显看出，与其他蛋白质相比，EF-Tu（43.3 kDa）的浓度更高，正如预期的那样。虽然凝胶提供了蛋白质表达比率的良好初步指示，但很难确定每种蛋白质是否以及在哪个水平上表达。因此，强烈建议在共培养之前确认每种菌株中的过表达，如上所示。

大肠杆菌核糖体是一种复杂的分子机器，由50多个单独的蛋白质亚基²³组成。用于无标记核糖体纯化的260nm处的代表性吸收光谱如图4所示;第三个峰是核糖体洗脱成功的特征。对于两种核糖体纯化方法，在SDS-PAGE凝胶上观察到预期的运行模式（图3A）18。我们确实观察到两种净化的污染，尽管数量很少（<10%）。值得注意的是，由于方法的变化，无标记（泳道5，6）和His标记（泳道11，12）核糖体中存在不同的污染物。作为用户参考，还包括用于组合系统的SDS-PAGE凝胶（泳道8、9和14、15）。

最后，比较了使用不同核糖体变体的制备系统的性能（图3）。体外eGFP表达的时间过程表明，两种PURE系统都是功能性的，并产生荧光eGFP。然而，OnePot蛋白溶液与His标记的核糖体结合，使用通过滴定优化的核糖体浓度，仅产生非标记核糖体版本的表达水平的三分之一（图3B）。当使用Green Lys tRNA体外标记系统表达和标记三种不同大小的蛋白质时，观察到类似的结果（图3C）。如荧光凝胶所示，全长产物在两种体系中都成功表达;然而，只有大约一半的表达水平是通过His-tag核糖体系统实现的。除了荧光标记外，所有三种蛋白质的预期条带在考马斯染色的凝胶上也是可区分的（图3D）。结果表明，引入的表达系统可以在一周内在实验室中使用标准设备制备，可用于线性模板中编码的T7启动子下游的蛋白质的体外表达。

图1：PURE系统所有表达菌株的过表达测试的代表性结果。 PURE蛋白质的数量和大小总结在 表2中。蛋白质编号 21、24 和 27 用星号标记，以便更好地可视化。 请点击此处查看此图的放大版本。

图2：OnePot蛋白纯化。 OnePot蛋白质溶液生产中涉及的所有步骤的示意图和相应照片。 请点击此处查看此图的放大版本。

图3：使用不同核糖体变体的制备系统的性能。 （A）OnePot蛋白质溶液的考马斯蓝染色SDS-PAGE凝胶（泳道2，3），无标记核糖体无蛋白质溶液（泳道5，6）和蛋白质溶液（泳道8，9），没有蛋白质溶液的His标记核糖体（泳道11，12）和蛋白质溶液（泳道14，15）。每个样品上样两种不同的浓度。（B） His标记核糖体和无标记核糖体的eGFP表达的比较。使用无标记核糖体（1.8μM，蓝色）和His标记核糖体（0.62μM，红色）监测 体外 eGFP表达的荧光强度，以进行PURE反应。线性模板和OnePot蛋白溶液的浓度分别为4 nM和2 mg/ mL。图（C）和（D）显示了在OnePot中合成的蛋白质的SDS-PAGE凝胶，分别用GreenLys 体外 标记试剂盒（C）标记并用Coomassie蓝（D）标记并用Coomassie蓝（D）标记。黑色箭头表示合成蛋白质的预期条带：eGFP（26.9 kDa），ArgRS（64.7 kDa），T7 RNAP（98.9 kDa）。线性模板和OnePot蛋白溶液浓度分别为4 nM和1.6 mg/mL。 请点击此处查看此图的放大版本。

图4：260nm处的吸光度光谱。 在无标记核糖体的疏水相互作用纯化过程中260nm处吸光度光谱的代表性结果。 请点击此处查看此图的放大版本。

表 1：用于 准备所有 OnePot PURE 解决方案的每日时间优化计划。 请单击此处下载此表。

表2：纯蛋白质列表请点击这里下载此表。

补充表1：试剂。 该表列出了本研究期间使用的试剂和组分的浓度，体积和其他具体细节。 请点击此处下载此表格。

补充表2：缓冲液。 该电子表格列出了蛋白质、无标记核糖体和His-tag核糖体纯化的确切缓冲液成分，以及用于制备它们的储备溶液的浓度。此外，它还根据缓冲区体积计算所需的分量。 请点击此处下载此表格。

补充表3：氨基酸计算。 该电子表格列出了能量溶液所需的氨基酸及其推荐的储备溶液浓度。它根据实际称量的质量计算要添加到每个氨基酸中的水量，并且还计算要添加到最终氨基酸混合物中的氨基酸溶液的体积。 请点击此处下载此表格。

补充表4：能源解决方案的库存溶液。 该表列出了能量溶液所需的储备溶液的浓度和体积，并指出了更多细节，包括储存条件。 请点击此处下载此表格。

补充表5：能量溶液。 该表列出了能量溶液成分及其推荐浓度。此外，它还根据其储备溶液浓度和能量溶液的体积计算要添加到最终溶液中所需的体积。 请点击此处下载此表格。

补充表6：聚合酶链反应。 该表列出了用于扩展PCR的引物的序列和浓度，并指示了熔化温度和针对高保真DNA聚合酶优化的热循环器步骤。 请点击此处下载此表格。

补充表7：纯反应。 电子表格显示了 PURE 反应的示例设置。它列出了使用无标记核糖体或His-tag核糖体进行PURE反应的组分的用浓度和体积。此外，它还计算蛋白质和核糖体滴定的体积比。 请点击此处下载此表格。

讨论

这里提出的方案描述了一种基于标准组合物¹⁵的简单、时间和具有成本效益的制备多功能PURE表达系统²⁰的方法。通过将方案与提供的每日时间表（表1）结合使用，所有组分都可以在1周内制备，并且产量足以进行多达500个10μL PURE反应。由于该方案中使用的蛋白质从高拷贝质粒中过表达并且对大肠杆菌具有低毒性，因此所有必需蛋白质都观察到良好的表达水平（图1）。这允许轻松调整菌株，因此也可以通过修改接种菌株^{的比例20来}调节共培养中的蛋白质组成。除核糖体蛋白外，EF-Tu的浓度对表达产生⁶具有根本重要性。相反，其他蛋白质组分浓度的变化对PURE系统^7，24的鲁棒性的影响相对较小。因此，通过调整EF-Tu相对于所有其他组分的接种比例，可以实现与标准PURE组合物相当的成分，并且可以获得具有相似产量²⁰的PURE系统。在制备蛋白质溶液时，至关重要的是要确保所有菌株生长良好并在诱导后过度表达编码的蛋白质（图1）。

核糖体功能是PURE系统²⁴整体性能的关键。在该协议中，演示了两种用于制备核糖体溶液的不同方法，即无标记和His标记核糖体纯化。无标记核糖体纯化基于疏水相互作用色谱，然后用蔗糖垫离心，这需要使用FPLC纯化系统和超速离心机¹⁵。相比之下，利用His标记的核糖体¹⁸ 和重力流亲和色谱纯化的方法不需要专门的设备，并且可以在大多数实验室中进行。因此，后一种方法具有诸如简单性和可访问性等优点。然而，与无标记变体相比，我们观察到在OnePot PURE中使用His标记的核糖体时合成产量显着降低（图3）。根据应用类型，这种较低的产量可能是可以接受的。

能量解决方案提供为 体外 TX-TL反应提供燃料所需的低分子量组分和tRNA。该协议为典型的能源解决方案提供了配方，可以根据用户需求轻松调整。与tRNA，NTP和磷酸肌酸一起，Mg^{2 +} 离子的丰度和浓度对于PURE系统⁸的整体性能至关重要，因为它们是转录和翻译的关键辅助因子。因此，在某些情况下，离子滴定可以大大提高整体PURE性能。DNA完整性对于PURE性能至关重要。因此，序列验证启动子区域，核糖体结合位点和靶基因并确保足够的DNA浓度（<2 nM）将有助于解决在建立PURE反应时可能出现的问题。

PURE系统是最小的TX-TL系统，因此特定应用可能需要额外的调整²⁵。这些可能包括掺入不同的RNA聚合酶^9、26、伴侣¹³和蛋白质因子，如EF-P或ArfA^8。虽然这些蛋白质的表达菌株可以包含在共培养中，但将它们单独添加到制备的系统中可以更好地控制所需的蛋白质水平。此外，囊泡的内含物对于膜蛋白^10，11的产生至关重要。氧化而不是还原环境和二硫键异构酶有利于适当的二硫键形成，例如，分泌蛋白¹²所需的二硫键。

必须确保任何其他组分不会干扰反应。下面列出了设置反应或添加其他组分时要注意的最重要因素。确保既不使用不相容的缓冲液，也不干扰离子浓度。尽可能避免使用含有甘油、高浓度钾、镁、钙离子、渗透液、焦磷酸盐、抗生素或EDTA的溶液。例如，在DNA纯化过程中用水代替洗脱缓冲液可能是有益的，因为EDTA是该缓冲液中的常见添加剂。为溶液提供额外的带负电荷的分子，如NTP或dNTP，需要调节镁浓度^8，因为带负电荷的分子表现为螯合剂并结合带正电荷的分子。中性pH值是反应的理想选择。因此，所有组分都应缓冲到相应的pH值;这对于高酸性或碱性分子（如NTPs）尤其重要。最后，温度和体积是反应的关键参数。为了获得良好的产量，应实现37°C左右的温度，因为低于34°C的温度将显着降低产量²⁷。

值得注意的是，在准备OnePot PURE之前，应考虑目标应用和相关要求，例如体积，纯度，易修改性以及组分的包含或遗漏。对于许多应用，该系统将是一个很好的选择，但其他应用可能需要产量、可调节性和其他因素，而OnePot系统无法提供这些因素。无论如何，引入的协议将有利于任何自制系统的制备，因为此处总结了此类制备的所有关键步骤。

OnePot系统的主要优点之一是它与市售的PURExpress系统的兼容性，该系统提供了通过按顺序将每个PURExpress组件替换为其OnePot等效组件来单独测试所有组件的功能和完整性的可能性。OnePot PURE系统的优势，如可调性和简单，快速且具有成本效益的制备，将使全球更多实验室可以使用无细胞TX-TL，并有助于扩大这一强大平台在无细胞合成生物学中的实施。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Tris/Glycine/SDS buffer	Bio-Rad Laboratories	1610732
15 mL centrifuge tubes	VWR International	525-0309
384-well Black Assay Plates	Corning	3544
4-20% Mini-PROTEANRTM TGXTM Precast Protein Gels	Bio-Rad Laboratories	4561096
50 mL centrifuge tubes	VWR International	525-0304
96-Well Polypropylene DeepWell plate	Nunc	260252
Acetic acid, 99.8 %	Acros	222140010
Äkta purifier	GE Healthcare		purification of tag free ribosomes
AMICON ULTRA 0.5 mL - 3 KDa	Merck Millipore	UFC500324
AMICON ULTRA 15 mL - 3 KDa	Merck Millipore	UFC900324
Amino acids	Sigma-Aldrich	LAA21-1KT
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	09718-250G
Ammonium sulfate	Sigma-Aldrich	A4418
Ampicillin	Condalab	6801
BenchMark Fluorescent Protein Standard	ThermoFisher	LC5928
Breathe-Easy sealing membrane	Diversified Biotech	Z380059-1PAK
Centrifuge tubes polycarbonate	Beckman	355631	purification of tag free ribosomes
Chill-out Liquid Wax	Bio-Rad Laboratories	CHO1411
Creatine phosphate	Sigma-Aldrich	27920
DNA Clean & Concentrator-25 (Capped)	Zymo	ZYM-D4034-200TS
DTT	SantaCruz Biotech	sc-29089B
Econo-Pac Chromatography Columns	Bio-Rad Laboratories	7321010
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)	Sigma-Aldrich	03609-250G
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes	VWR International / Eppendorf	525-0133
Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap	Falcon	352051
Flasks, baffled 1000 mL 4 baffles, borosilicate glass	Scilabware	9141173
FluoroTect Green Lys in vitro Translation Labeling System	Promega	L5001	optional
Folinic acid	Sigma-Aldrich	PHR1541
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7757-1L
HEPES	Gibco	15630-056
HiTrap Butyl HP Column	GE Healthcare	28411005	purification of tag free ribosomes
IMAC Sepharose 6 Fast Flow	GE Healthcare	17-0921-07
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399
InstantBlue	Expedeon	ISB1L-1L
IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactoside)	Alfa Aesar	B21149.03
Laemmli buffer (2x), sample buffer	Sigma-Aldrich	S3401-1VL
Lysogeny broth (LB) media	AppliChem	A0954
Magnesium acetate	Sigma-Aldrich	M0631
Magnesium chloride	Honeywell Fluka	63020-1L
Nickel Sulfate	Alfa Aesar	15414469
NTP	ThermoFisher	R0481
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL)	ThermoFisher	F530S
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P5405-1KG
Potassium glutamate	Sigma-Aldrich	49601
PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit	NEB	E6800S
PURExpress Δ Ribosome Kit	NEB	E3313S
Quick Start Bradford 1x Dye Reagent	Bio-Rad Laboratories	5000205
Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units	ThermoFisher	564-0020
RNaseA solution	Promega	A7973
SealPlate film	Excel Scientific	Z369659-100EA
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	6203
Spermidine	Sigma-Aldrich	S2626
Sucrose	Sigma-Aldrich	84097
TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphin -hydrochlorid)	Sigma-Aldrich	646547-10X1mL
Thickwall Polycarbonate Tube	Beckman	355631
Trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	T0699
Tris base	ThermoFisher	BP152-500
tRNA	Roche	10109541001
Ultracentrifuge Optima L-80	Beckman		purification of tag free ribosomes
Whatman GD/X syringe filters	GE Whatman	WHA68722504
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250-100mL