원팟 퓨어 셀 프리 시스템

요약

표준 실험실 장비를 사용하여 재조합 PURE 세포 없는 TX-TL 시스템을 생산하는 빠르고 비용 효율적인 방법을 제시합니다.

초록

정의된 PURE(재조합 원소를 이용한 단백질 합성) 전사 번역 시스템은 세포없는 합성 생물학을 위한 매력적인 섀시를 제공합니다. 안타깝게도 시판되는 시스템은 비용이 많이 들며 튜닝성이 제한됩니다. 이에 비해 사용자 요구에 따라 홈메이드 접근 방식을 사용자 지정할 수 있습니다. 그러나, 집에서 만든 시스템의 준비는 리보솜뿐만 아니라 36 중간 규모의 단백질 정제의 필요성으로 인해 시간이 많이 걸리고 힘들다. 응모 및 공동 정제로 단백질 정제를 간소화하면 시간과 노동 요구 사항을 최소화할 수 있습니다. 여기서는 표준 실험실 장비를 사용하여 1주일 이내에 모든 PURE 시스템 구성 요소를 생산하는 쉽고 조정 가능하며 시간 및 비용 효율적인 방법을 제시합니다. 또한 OnePot PURE의 성능은 시판되는 시스템과 비교할 수 있습니다. OnePot PURE 준비 방법은 단순성과 비용 효율성으로 인해 PURE 시스템의 접근성을 더 많은 실험실로 확장합니다.

서문

세포 없는 전사 번역(TX-TL) 시스템은 생물학적 시스템을 조사하고 엔지니어링하기 위한 유망한 플랫폼입니다. 그들은 더 이상 성장, 항상성 또는 규제 메커니즘^1을포함한 생명 유지 프로세스에 의존하지 않기 때문에 단순화되고 조정 가능한 반응 조건을 제공합니다. 따라서, 세포없는 시스템은 생체 분자 시스템의 조사에 기여하고, 합리적 바이오 설계 전략^2를테스트하는 프레임 워크를 제공하고, 미래의 합성 세포^3,4에대한 섀시를 제공 할 것으로 예상된다. 완전 재조합 PURE 시스템은 정의되고 최소한의 구성뿐만 아니라 조정 가능성과 튜닝성^5로인해 특히 매력적인 섀시(chassis)를 제공합니다.

2001년^5년제1차 기능성 완전재조합 PURE 시스템이 설립된 이래, 시스템 한계를 확대하고 시스템 수율을^6,7,8,전사^조절9,멤브레인^{10,11, 분비} 단백질 합성^12,단백질 접이식^13,14를 용이하게 하기 위한 시스템 한계를 확대하고 시스템의 구성을 최적화하기 위한 노력이 이루어지고 있다. . 현재 는 PUREfrex (제네프론티어), PURExpress (NEB), 매직 퓨어 (크리에이티브 바이오 랩)의 세 가지 상용 시스템이 있습니다. 그러나 이러한 시스템은 비용이 많이 들고 정확한 구성은 독점적이므로 알 수 없으며 적응성이 제한됩니다.

사내에서 제조된 PURE 시스템은 가장 비용 효율적이고 튜닝 가능한^{옵션(15,16)으로}입증되었습니다. 그러나, 단백질 과 리보솜 분획에 필요한 37개의 정화 단계는 시간이 많이 걸리고 지루하다. PURE시스템^{준비(17,18,19)의}효율성을 개선하기 위한 여러 시도가 있었다. 우리는 최근에 PURE 시스템에 존재하는 모든 필수 비 리보소말 단백질을 공동 배양하고 공동 정화할 수 있음을 입증했습니다. 이 OnePot 방법은 비용 효율적이고 시간 효율적이며 준비 시간을 몇 주에서 3 영업일로 줄입니다. 이 접근법은 상용 PURExpress^{시스템(20)에}필적하는 단백질 생산 능력을 갖춘 PURE 시스템을 생성한다. PURE 제제를 단순화하기 위한 이전의 접근법과는 달리^17,18,19,OnePot 접근법에서 모든 단백질은 여전히 별도의 균주로 표현된다. 이를 통해 사용자는 특정 균주를 생략하거나 추가하거나 접종 량을 조정하여 OnePot PURE 시스템의 구성을 조정할 수 있으므로 드롭아웃 PURE 시스템을 생성하거나 최종 단백질 비율을 각각 변경할 수 있습니다.

여기에 제시된 프로토콜은^이전에설명된 대로 OnePot PURE 시스템을 만들기 위한 상세한 방법을 제공하지만, β-메르카토에탄올은 트리스(2-carboxyethyl)인포스핀(TCEP)으로 대체되었다. 더욱이, 리보솜 정화를 위한 두 가지 방법이 설명되어 있다: 소수성 상호작용과 자당 쿠션을 이용한 전통적인 태그없는 리보솜 정제, 시미즈 외^15,왕외^18및 에데르스 외^21에 기초한 Ni-NTA 리보솜 정제등이 크게 수정되었다. 후자의 방법은 PURE 시스템의 준비를 더욱 용이하게하고 표준 실험실 장비만 요구되기 때문에 더 많은 실험실에 접근할 수 있게 합니다.

실험 프로토콜은 1주일 이내에 표준 실험실 장비를 사용하여 제조할 수 있는 간단하고 튜닝가능한 비용 효율적인 세포 없는 플랫폼을 제공하기 위해 다목적 PURE 셀 프리 TX-TL 시스템의 준비를 요약합니다. 표준 PURE 컴포지션을 도입하는 것 외에도 시스템의 기능을 보장하기 위해 프로토콜의 중요한 단계에 중점을 두고 조정할 수 있는 방법과 위치를 나타냅니다.

프로토콜

참고: 이 프로토콜은 재조합 구성 요소에서 세포가 없는 TX-TL 시스템의 제조를 설명합니다. 편의를 위해, 작품은 다섯 부분으로 분리됩니다. 첫 번째 부분에서는 프로토콜을 시작하기 전에 수행해야 하는 준비 단계를 설명합니다. 두 번째 부분은 OnePot 단백질 용액의 제조를 설명합니다. 세 번째 부분은 리보솜 정제를 설명하고, 네 번째 부분은 에너지 용액의 준비를 상세히 설명하고, 마지막 부분은 PURE 반응을 설정하기위한 매뉴얼을 제공합니다. 편의를 위해 프로토콜은 일로 나누어져 표 1의일일 일정으로 요약됩니다. 일정에 따라 전체 시스템은 1주 만에 1인씩 준비할 수 있습니다.

1. 예비 작업

1. 보충 표 1에설명 된 바와 같이 세균 문화 배지 및 미디어 보충제를 준비합니다. 파이펫 팁, 96 개의 딥 웰 플레이트를 포함하여 필요한 재료를 준비하고 살균하십시오.
2. 스트레인 준비
   1. 열 충격 방법을 사용하여 해당 식 벡터로 표 2에 표시된 식 균주를 변환합니다.
      1. 화학적으로 유능한 박테리아에 정제 된 플라스미드를 추가하고 20-30 분 동안 얼음에 배양하십시오.
      2. 혼합물을 42°C에서 30초(열 충격)에 넣고 얼음위에 2분 동안 다시 놓습니다.
      3. 피펫 20 μL 박테리아는 암피실린(AMP)을 함유한 아가 플레이트에 직접 상회하고 하룻밤 사이에 37°C에서 배양한다. 최대 1 주일 동안 4 °C에서 접시를 저장합니다.
      4. 천판에서 박테리아의 단일 식민지와 AMP를 포함하는 LB 미디어의 접종 3 mL. 하룻밤 동안 260 rpm에서 흔들면서 37 °C에서 배양하십시오.
      5. 배양250 μL을 50%(v/v) 글리세롤250μL로 섞고 -80°C에 보관한다.
         참고: 미래에 더 빠른 준비를 위해, 글리세롤 주식으로 96 웰 플레이트에 균주를 저장합니다.
   2. 콜로니 PCR 및 시퀀싱으로 모든 벡터 변환을 확인합니다. 유전자, 프로모터 영역 및 리보솜 결합 부위를 서열한다.
3. 식 테스트
   1. 1.3mL 깊이 의 플레이트에 준비 된 글리세롤 주식의 약 1 μLAMP를 포함하는 LB 미디어의 300 μL을 접종한다. 통기성 멤브레인으로 접시를 밀봉한 다음 하룻밤 사이에 260 rpm에서 흔들면서 37 °C에서 배양하십시오.
      참고: 이 시점에서 모든 식은 별도로 수행됩니다.
   2. 하룻밤 문화의 1 μLAMP를 포함하는 신선한 LB 매체의 300 μL을 접종. 하룻밤 동안 260 rpm에서 흔들면서 37 °C에서 배양하십시오. 2 시간 후, 이소프로필 β-D-1-티오갈라크토피라노사이드(IPTG)의 100μM로 세포를 유도하고 3시간 더 자랍한다.
   3. 배양10μL을 2x Laemmli 버퍼의 10 μL과 혼합하고 10분 동안 95°C로 가열합니다. 테이블 원심분리기를 사용하여 1분 동안 샘플을 회전시키고 PAGE 젤에 상체의 10 μL을 로드합니다. 30 분 동안 200 V에서 트리스 / 글리신 / SDS 버퍼에서 젤을 실행합니다. 탈온된 물로 잘 헹구습니다. 쿠마시 단백질 얼룩으로 젤을 덮고 1 시간 동안 인큐베이션하십시오. 필요한 경우 물에 젤을 스테인 (도 1에서발현 테스트에 대한 대표적인 결과).
      참고: 그라데이션(4%-15% 또는 4%-20%) PAGE 젤을 사용하여 좋은 분리를 달성하십시오.
4. IMAC 세파로즈 수지 복원 및 청소
   1. 열 준비.
      1. 세파로즈 수지와 소용돌이를 잘 섞는다.
      2. 필요한 양의 수지가 빈 중력 흐름 열로 피펫합니다.
         참고: 필요한 수지의 양은 그의 리보솜 정제와 단백질 정제 에 따라 다르며 각 섹션에 지정됩니다.
      3. 수지30mL의 탈온물로 씻으시다.
      4. 섹션 1.4.4에 지정된 대로 열 재충전을 진행합니다.
         참고: 다음 단계로 계속하기 전에 항상 모든 액체가 열을 통과하도록 하십시오. 그러나 열이 건조하게 실행되지 않도록 하십시오. 컬럼을 통해 액체를 실행할 때마다 액체가 수지에 도달하는 즉시 흐름을 중지하거나 다음 단계로 계속하십시오.
   2. 복구.
      1. 30mL의 탈수로 컬럼을 씻으시다.
      2. 0.2 M EDTA 및 0.5 M NaCl 솔루션의 10mL를 적용합니다.
      3. 0.5 M NaCl 솔루션의 30mL를 추가합니다.
      4. 50mL의 탈수로 컬럼을 씻으시다.
      5. 4°C에서 20% (v/v) 에탄올에 보관하거나 다음 단계로 계속 보관하십시오.
   3. 청소.
      주의: 보호 장비를 착용하십시오.
      1. 0.5 M NaOH의 30mL로 컬럼을 씻으시다.
      2. 30mL의 탈수로 컬럼을 씻으시다.
      3. 0.1 M 아세트산30mL로 컬럼을 세척합니다.
      4. 30mL의 탈수로 컬럼을 씻으시다.
      5. 70%(v/v) 에탄올의 30mL로 컬럼을 세척합니다.
      6. 50mL의 탈수로 컬럼을 씻으시다.
      7. 4°C에서 20% (v/v) 에탄올에 보관하거나 다음 단계로 계속 보관하십시오.
   4. 충전을 다시 충전합니다.
      1. 컬럼에 0.1 M 니켈 황산염 용액의 10mL를 추가합니다.
         주의: 니켈 황산염은 독성이 있습니다. 니켈 황산 폐기물은 공급 업체가 지시 한 예방 조치로 폐기해야합니다.
      2. 50mL의 탈수로 컬럼을 씻으시다.
      3. 에탄올을 4°C에 20%(v/v)에 저장하거나 열 평형을 계속합니다.
         참고: 열이 단계 사이에 에탄올에 저장되어 있는 경우 열을 물로 세척하여 에탄올의 모든 흔적을 제거해야 합니다.

2. OnePot 단백질 용액 발현 및 정제

참고: 프로토콜은 일로 나눈 세 부분으로구성됩니다(그림 2). 이상적인 준비 절차는 13.5 mg / mL OnePot 단백질 용액의 1.5 mL을 생성하며, 이는 1,000 μL PURE 반응에 해당합니다. 그러나 솔루션의 양과 이상적인 농도는 배치마다 다릅니다. 숙련된 사용자는 한 번에 여러 OnePot PURE 준비를 수행할 수 있습니다.

1일차:

1. 보충 표 1에설명 된 바와 같이 세균 문화 배지 및 미디어 보충제를 준비합니다.
2. 파이펫 팁, 96개의 딥웰 플레이트 2개, 플럽트 에를렌마이어 플라스크 1개를 포함하여 필요한 재료를 준비하고 살균합니다.
3. 보충 표 2에설명 된 대로 버퍼 및 보충을 준비 합니다. 필터는 병 상단 필터 (0.45 μm)를 사용하여 모든 버퍼를 살균하고 4 ° C에 저장합니다. 달리 명시되지 않는 한 사용하기 직전에 1mM TCEP로 모든 버퍼를 보완합니다.
4. OnePot 단백질 정제를 위해 2mL의 세파로즈 수지를 사용하십시오. 섹션 1.4에 설명된 대로 열을 준비합니다.
5. 스타터 문화를 준비하려면 LB 배지 20mL와 AMP 20 μL을 결합합니다. 멸균 96, 1.3mL 딥 웰 플레이트에서 35개의 우물에 300 μL의 매체를 추가합니다. 신장 인자 열 불안정 (EF-Tu)을 제외하고 각각의 변형으로 각각을 접종하고 통기성 멤브레인으로 플레이트를 밀봉하십시오.
   참고: 96웰 의 복제자를 사용하여 플레이트를 접종합니다(재료 표참조). 깊은 음판의 양과 스타터 문화의 볼륨이 필수적입니다. 더 큰 미디어 볼륨 또는 작은 음량은 폭기 불일치로 인해 다른 세균 밀도로 이어질 것입니다.
6. EF-Tu 문화의 경우 스냅 캡이 있는 14mL 배양 튜브에서 LB 배지 3mL을 접종합니다. EF-Tu를 위한 단일 3mL 문화권은 OnePot 식 문화 권면 하나에 충분합니다.
7. 하룻밤 동안 260 rpm에서 흔들면서 37 °C에서 배양하십시오.

2일차:
참고: 달리 명시되지 않는 한 실온에서 모든 단계를 수행합니다.

8. LB 미디어 500mL및 AMP 500 μL을 멸균 플러플 플라스크로 옮기습니다.
9. EF-Tu 배양의 1675 μL및 심층플레이트로부터 각 배양의 55 μL로 OnePot PURE 배양을 접종한다(표2).
   참고: 이 단계에서, 전반적인 단백질 조성물은 접종 비율을 조정해서 조정될 수 있습니다. 전체 접종 볼륨이 3.6mL에서 일정하게 유지되는지 확인합니다.
   선택 사항: 모든 균주가 하룻밤 사이에 성장한지 확인하려면 플레이트 리더를 사용하여 96웰 플레이트에서 600nM(OD_600)에서야간 배양의 광학 밀도를 측정합니다. 광학 밀도 측정에 10배 희석을 사용합니다.
10. 260 rpm의 흔들림으로 37°C에서 2h의 배양또는 배양의 OD_600이 0.2-0.3에 도달할 때까지 배양한다.
11. 0.1 mM IPTG의 500 μL로 배양을 유도하고 추가 3 시간 동안 성장한다.
12. 세포를 원심분리로 4°C및 3220 x g에서 10분 동안 수확하고 추가 사용이 될 때까지 세포 펠릿을 -80°C에 저장한다.
    참고: 타이밍을 최적화하려면 2일째(표1)에인큐베이션 시간 동안 섹션 4에 설명된 에너지 솔루션을 준비한다.

3일차:

13. 아래 단계에 설명된 정제에 필요한 버퍼의 양을 측정하고 보충 표 2에표시된 대로 모든 버퍼에 TCEP를 추가합니다. 향후 정화를 위해 TCEP없이 나머지 버퍼를 4 °C에서 저장합니다.
14. 버퍼 A의 30mL로 충전된 컬럼(섹션 2.4)을 평형화합니다. 버퍼 A의 25mL이 통과한 후 아래에서 열을 닫습니다. 동시에 2.15-2.17 단계를 계속하십시오.
15. 세포를 해동하고 완충 A의 7.5 mL에서 세포 펠릿을 재보페하기 위해 혈청 피펫을 사용합니다.
16. 다음과 같은 매개 변수와 함께 130 와트 프로브 초음파 처리기 (재료 의 표,프로브 팁 직경 : 6mm 참조)를 사용하여 세포를 lyse : 4 x 20 펄스, 20 s 펄스 끄기, 70 % 진폭. 초음파 처리가 성공하면 용액이 어두워집니다(그림 2).
    참고: 초음파 처리 중에 세포를 얼음 위에 보관하십시오. 튜브를 건드리지 않고 프로브를 용액에 충분히 깊이 배치합니다. 많은 양의 거품이 생성되면 에너지 전달이 축축됩니다. 이 경우 폼이 정착하여 프로브를 용액 깊숙이 낮추고 초음파 처리 시간을 연장합니다.
17. 초음파 처리 직후 4 °C에서 20 분 동안 21130 x g에서 원심 분리로 세포 이물질을 제거하십시오. 얼음에 lysate을 유지합니다.
18. 상체를 평형 열에 추가합니다. 상단에서 열을 닫고 누출이 없는지 확인합니다. 튜브 회전기를 사용하여 회전 하에 4 °C에서 3 시간 동안 컬럼을 배양합니다.
19. 기둥에서 풀이 없는 성분을 풀고 25mL의 버퍼 A로 세척합니다.
20. 25m imidazole 버퍼 (버퍼 A의 23.95 mL 및 완충B의 1.25 mL)의 25 mL로 컬럼을 세척하십시오.
21. 450mM imidazole 완충제 (완충제 A0.5mL 및 완충B 4.5 mL)의 5mL로 단백질을 엘테. 항상 얼음에 용출 단백질을 유지합니다.
22. HT 버퍼의 25mL로 용출을 희석하고 혼합물을 얼음에 보관하십시오. 15mL 원심 필터에 15mL를 추가하고 1.5mL의 부피에 농축합니다. 농축 된 용액을 사용하여 나머지 15 mL을 필터에 추가하고 다시 한 번 1.5 mL에 농축합니다.
23. 농축 된 샘플에 HT 버퍼 10 mL을 추가하고 1 mL에 농축하십시오. 동일한 양의 스톡 버퍼 B를 추가하고 추가 사용이 될 때까지 -80 °C에 보관하십시오.
    참고: 교환/농도의 한 라운드는 4°C에서 3220 x g에서 약 60분 회전합니다.
24. 버퍼 교환 중에 섹션 1.4에 지정된 대로 열을 복원합니다.

4일차:

25. 공급 업체에 의해 설명 된 대로 브래드포드 분석 을 사용 하 여 단백질 농도 측정. 샘플을 0.5mL의 3kDa 컷오프 원심 필터를 20 mg/mL로 농축합니다.
    참고: 브래드포드 분석법을 과대평가하지 않도록 농도 측정 전에 단백질 용액을 25배 또는 50배 희석시 희석시.
26. 이상적인 단백질 농도를 확립하려면 단백질 용액의 다양한 농도를 가진 이 단계(섹션 5.2)에서 발현 테스트를 수행합니다. 적정을 수행하기 위해, 용액의 총 부피를 일정하게 유지하고 스톡 버퍼 B를 포함한 OnePot 단백질 용액을 5가지 비율로유지한다(보충표 7).
27. SDS-PAGE(도3A)를사용하여 OnePot PURE 단백질 조성물을 확인합니다. 7.5 μL의 물로 시료의 2.5 μL을 희석하고, 2x Laemmli 버퍼의 10 μL과 혼합한 다음 5 μL 및 2.5 μL의 샘플을 젤에 로드합니다. 섹션 1.3.3에 지정된 대로 SDS 페이지를 실행합니다.
28. Aliquot 단백질 용액을 발현을 확인하고 농도를 조정한 후 50 μL 알리쿼트로 변환합니다. OnePot PURE 단백질 용액을 -80°C에 추가로 사용할 때까지 보관하십시오.
    참고: 단백질 성분이 존재하지 않는 것으로 의심되거나 OnePot PURE에서 예상보다 낮은 농도로 존재하는 경우 다음 단계를 수행하십시오.
29. 각 균주의 야간 배양이 모든 배양의 광학 밀도 측정(OD_600)을수행하여 다른 배양과 유사한 속도로 성장했는지 확인합니다.
30. 의심스러운 단백질의 발현을 확인하기 위해 특정 균주의 추가 발현 테스트를 수행한다.

3. 리보솜 솔루션

참고: 두 개의 다른 리보솜 정화 전략이 도입되고, 하나는 육각성 태그가 지정되고 태그가 지정되지 않은 리보솜용입니다. 표준 친화성 Ni-NTA 중력 흐름 기둥에 대한 그의 정제를 이용한 정화 방법의 주요 장점은 정화가 쉽고 빠르며 FPLC 시스템 및 초원심분리기와 같은 추가 실험실 장비가 필요하지 않다는 것입니다. 그러나 OnePot PURE 반응의 단백질 생산 능력은 태그가 없는 리보좀에 비해 약 1/3입니다. 따라서 주어진 응용 프로그램에 대해 높은 수율이 중요한지 여부에 따라 리보솜 생산 방법을 선택하십시오.

1. 그의 태그 리보솜 정제
   참고 :이 프로토콜은 대장균 RB1 균주를 활용, 교수 왕 (컬럼비아 대학, 미국)^18에서선물 . 이 균주는 50S 리보소말 단백질(L7/L12)의 C 종색에 육각성 기습을 삽입하여 Ni-NTA 중력 유동 컬럼을 사용하여 정화할 수 있습니다. 일반적인 수율은 약 0.5 mL의 3.45 μM 리보솜이며, 이는 500 μL PURE 반응이상에 충분합니다.

1일차:

1. 보충 표 1에설명 된 바와 같이 세균 문화 배지 및 미디어 보충제를 준비합니다.
2. 파이펫 팁, 5L 에렌마이어 플라스크, 100mL 에렌마이어 플라스크 1개를 포함한 필요한 재료를 준비하고 살균합니다.
3. 보충 표 2에설명 된 대로 버퍼 및 보충을 준비 합니다. 필터는 병 상단 필터 (0.45 μm)를 사용하여 모든 버퍼를 살균하고 4 ° C에 저장합니다.

2일차:

4. 열에 수지의 파이펫 5 mL 및 섹션 1.4에 지정된 대로 열을 준비합니다.
   참고: 수지의 양이 많기 때문에 복원 및 정화가 훨씬 더 오래 걸린다. 교차 오염을 피하고 정화하기 전에 철저히 청소하기 위해 리보솜 정제에 다른 컬럼을 사용하십시오.
5. 100 mL Erlenmeyer 플라스크에서 LB 미디어의 35 mL을 접종하여 대장균 RB1 균주의 하룻밤 문화를 준비합니다. 260 rpm에서 흔들면서 37 °C에서 배양하십시오.

3일차:
참고: 달리 명시되지 않는 한 실온에서 모든 단계를 수행합니다.

6. LB 배지 2L을 5L 멸균 플라스크에 넣고, 하룻밤 문화의 12mL로 접종한 다음, 260 rpm에서 흔들면서 37°C에서 3-4h로 배양합니다.
   참고 : 또는, 1 L 당황 플라스크에서 배양의 4 x 500 mL에서 세균 배양을 수행합니다.
7. 3220 x g 및 4°C에서 10 분 동안 원심 분리에 의해 세포를 펠렛. 추가 사용이 될 때까지 -80 °C에 보관하십시오.

4일차:

8. 3.1.4 단계에서 준비된 열을 평형화합니다. 30mL의 리시스 버퍼.
9. 혈청 피펫을 사용하여 20mL의 용해 버퍼에서 펠릿을 다시 놓습니다.
10. 130와트 프로브 초음파 처리기(재료 표참조, 프로브 팁 직경: 6mm)로 세포를 다음과 같은 매개 변수로 리세: 11 x 20 s 펄스 에; 20s 펄스 오프, 70% 진폭(절차 세부 사항은 2.16단계 참조).
11. 초음파 처리 직후, 4 °C에서 21130 x g에서 20 분 동안 원심 분리하여 세포 이물질을 제거하십시오. 얼음에 lysate을 유지합니다.
12. 상체를 열에 로드하고 통과하게 합니다.
13. 용해 및 용출 버퍼의 다음과 같은 혼합물로 컬럼을 세척합니다.
    1. 세척 0 : 용해 버퍼의 30 mL을 사용합니다.
    2. 세척 1: 5m imidazole의 30mL사용 (용해 버퍼 29mL, 용출 버퍼 1mL).
    3. 세척 2: 25m imidazole의 60mL를 사용하십시오 (용해 버퍼 50mL, 용출 버퍼 10mL).
    4. 세척 3: 40mm imidazole의 30mL(용해 완충 22mL, 용출 완충제 8mL)을 사용하십시오.
    5. 워시 4: 60mm imidazole의 30mL(용해 완충 18mL, 용출 완충제 12mL)을 사용하십시오.
14. 용출 버퍼의 7.5 mL로 리보솜을 엘테. 항상 얼음에 용출 단백질을 유지합니다.
15. 순β-메르카토에탄올 22 μL을 리보솜 버퍼 45mL에 추가합니다.
    주의: β-메르카토에탄올은 독성이 있습니다. 안전 예방 조치를 취하고 연기 후드에서 작업하십시오.
16. 15mL 원심 필터에 용출을 넣고 1mL에 농축합니다.
17. 농축 된 샘플에 리보솜 버퍼 15 mL을 추가하고 다시 1 mL에 농축합니다.
    참고: 이전 단계를 두 번 반복합니다.
18. 추가 사용이 될 때까지 -80 °C에 보관하십시오.
    참고: 교환/농도의 한 라운드는 4°C에서 3220 x g에서 원심분리의 약 60 분 소요.
19. 버퍼 교환 중에 섹션 1.4에 지정된 대로 열을 복원합니다.

5일차:

21. 리보솜 버퍼에서 1:100을 희석한 시료의 260 nM에서 흡광도를 측정하여 리보솜 농도를 결정한다. 희석된 용액의 10의 흡광도 값은 이전에 설명된^16과같이 희석되지 않은 용액의 23 μM에 해당한다.
22. 3.45 μM의 최종 재고 농도를 구현합니다. 농도를 조정하려면 리보솜을 리보솜 버퍼로 희석하거나 4°C에서 3kDa 0.5mL 원심 필터에서 14000 x g에서 원심분리에 의해 더 농축한다.
    참고: 최적의 시스템 발현을 달성하려면 리보솜 농도 적정(섹션 5.2, 보충표 7)을수행합니다.
23. 섹션 1.3.3에 지정된 대로 SDS-PAGE(그림3A)를사용하여 리보솜 조성물을 확인합니다. 7.5 μL의 물로 시료의 2.5 μL을 희석하고, 2x Laemmli 버퍼의 10 μL과 혼합한 다음, 5 μL 및 2.5 μL의 샘플을 젤에 적재합니다.

2. 태그없는 리보솜 정제
   참고: 태그없는 리보솜 정제는 FPLC시스템(재료 표)을사용하여 수행되며 2 x 5mL 부틸 컬럼(재료표)을사용하여 소수성 상호 작용 크로마토그래피를 기반으로 합니다. 리보솜은 임의의 균주로부터 정제될 수 있지만, 대장균 A19(예일 CGSC의대장균 유전 자원)를 이용하여 RNase I 삭제^22로인해 유리하다. 차가운 방이나 냉각 캐비닛에서 4 °C에서 정화를 수행합니다. 일반적인 수율은 약 0.5 mL의 10 μM 리보솜이며, 이는 500 μL PURE 반응에 해당합니다.

1일차:

1. 보충 표 1에설명 된 바와 같이 세균 문화 배지 및 미디어 보충제를 준비합니다.
2. 파이펫 팁, 5 L Erlenmeyer 플라스크, 100 mL Erlenmeyer 플라스크를 포함하여 필요한 재료를 준비하고 살균하십시오.
3. 보충 표 2에설명 된 대로 버퍼 및 보충을 준비 합니다. 필터는 병 상단 필터 (0.45 μm)를 사용하여 모든 버퍼를 살균하고 4 ° C에 저장합니다.

2일차:

4. 대장균 A19 균주의 하룻밤 문화를 준비하기 위해 100 mL Erlenmeyer 플라스크에서 LB 미디어의 35 mL을 접종하십시오. 260 rpm에서 흔들면서 37 °C에서 배양하십시오.

3일차:

5. LB 배지 2L을 5L멸균 플라스크로 옮기고, 야간 배양의 30mL로 접종한 다음, 200 rpm에서 흔들면서 37°C에서 3-4h로 배양한다.
6. 4°C에서 15분 동안 4000 x g에서 원심분리로 세포를 펠렛합니다. 25mL의 서스펜션 버퍼로 펠릿을 다시 중단하고 추가 사용이 있을 때까지 -80°C에 보관하십시오.

4일차:

7. 단계 3.2.8-3.2.12단계를 3.2.13-3.2.19단계와 병렬로 수행합니다.
8. 다음 매개 변수가 있는 얼음 에 130와트 프로브 초음파 처리기(재료 표 및 프로브 팁 직경: 6mm 참조)를 사용하여 세포를 해동하고 용해하십시오: 12 x 20 s 펄스 켜기; 20s 펄스 오프, 70% 진폭(단계 2.16 절차 세부 정보 참조).
9. 4°C에서 20분 동안 20000 x g에서 원심분리로 세포 이물질을 즉시 제거합니다.
10. 슈퍼네티퍼를 흡인하고 볼륨을 측정합니다. 동일한 양의 서스펜션 버퍼(High salt)를 추가하여 황산암모늄의 최종 농도를 1.5M로 조정하고 잘 섞습니다.
11. 4°C에서 20분 동안 20000 x g에서 원심분리로 침전을 제거합니다.
12. FPLC 정화 전에 0.45 μm polyethersulfone 멤브레인 주사기 필터를 사용하여 상체를 필터링하고 100mL 유리 병에 여과물을 수집합니다. 상수체를 항상 4°C로 유지합니다.
13. 다음과 같이 이중 부틸 컬럼(2 x 5mL)을 사용하여 소수성 상호 작용 크로마토그래피 정제를 위한 FPLC 시스템을 설정합니다. 이 설정의 경우 하나의 열 볼륨(CV)은 10mL의 부피를 나타냅니다.
14. 버퍼 라인으로 두 개, 샘플 라인으로 하나 등 세 개의 입구가 필요합니다. 정화기의 기본 설정으로 인해 버퍼 C 및 버퍼 D에 대해 라인 A1과 B1을 선택하고 A2를 샘플 라인으로 선택하는 것이 편리합니다. 펌프 세차(10mL/min)를 제외하고 또는 달리 명시되지 않는 한 4mL/min의 기본 유량을 적용합니다.
    참고: TCEP는 비용이 많이 드는 시약이기 때문에 평형 단계 후에만 버퍼 C 및 D에 해당 금액을 추가합니다.
15. 시스템 펌프 세척을 20%(v/v)로 수행하여 시스템을 청소하고 이전 정화에서 잠재적인 오염을 제거합니다. 수동으로 0.2 mL/min의 유량을 설정하고 열을 장착합니다. 흐름을 중지합니다.
16. 물로 시스템 펌프 워시를 실행합니다. 3 CV의 물로 컬럼을 씻으시다.
17. 평형: 입구 A1및 A2를 완충 C에 배치하고 입구 B1을 TCEP 없이 버퍼 D에 배치합니다. 펌프 세척을 실행하고 버퍼 C의 4 CV로 열을 평형화합니다.
18. C와 D 버퍼에 TCEP를 추가합니다.
19. 15mL 튜브 또는 명확한 둥근 분획 수집관을 분수 수집기로 준비하여 4-5mL 용출 분획을 수집합니다.
20. 로딩: 여과된 샘플로 입구 A2를 병에 넣습니다. 샘플 볼륨의 약 90%를 열에 로드합니다. 샘플을 TCEP 함유 버퍼 C의 20mL로 희석하고 샘플의 10mL를 컬럼에 로드합니다. 희석 단계를 적어도 두 번 반복하고 가능한 한 많은 샘플을 열에 로드합니다. 공기가 기계에 빨려 들어가지 않도록 하는 것이 중요합니다.
21. 세척 단계 1 : 무한 성분을 제거하기 위해 완충 C의 3 CV로 세척합니다.
22. 세척 단계 2 : 80 % 버퍼 C와 20 % 버퍼 D의 5 CV로 세척하십시오.
23. 용출: 버퍼 C의 50%와 버퍼 D의 50%를 총 용출 부피 5CV로 적용하여 제품을 elute.
24. 세척 단계 3: Elute 모든 강하게 상호 작용 오염 물질 100% 버퍼 D 와 총 볼륨 5 CV.
25. 260 또는 280 nM(도4)에서샘플 분획의 흡수 스펙트럼을 분석합니다. 첫 번째 피크는 적재 및 첫 번째 세척 단계에서 용출된 비흡수 단백질을 보여줍니다. 두 번째 피크는 두 번째 세척 단계에서 용출된 오염 물질을 보여줍니다. 세 번째 피크는 최종 제품을 모니터링하고 마지막 피크는 강하게 상호 작용하는 오염 물질을 보여줍니다. 추가 처리를 위해 세 번째 피크에 해당하는 모든 샘플 분획을 풀. 항상 얼음에 용출 단백질을 유지합니다.
26. 4개의 폴리카보네이트 극심분리 튜브에서 쿠션 버퍼의 15mL에 회수된 분획을 부드럽게 오버레이합니다. 쿠션 버퍼의 15mL에 샘플의 최대 15mL를 추가합니다. 튜브의 무게의 균형을 잘 맞추십시오. 16h에 대한 4 °C에서 100000 x g에서 초원심 분리에 의해 리보솜을 펠렛.
    참고: 초원심분리관에 균열이 없는지 확인하십시오.
27. 다음과 같이 열을 청소하고 재설정합니다. 5mL/min의 유량은 잘 작동합니다. 모든 입구를 물에 넣고 펌프 세척을 실행합니다. 2 CV의 물로 컬럼을 씻으시다.
    1. 입구를 0.5 M NaOH 용액에 넣고 펌프 세척을 수행한 다음 NaOH의 3 CV로 컬럼을 세척합니다.
    2. 입구를 물에 넣고 펌프 세척을 수행한 다음 2 CV의 물으로 컬럼을 세척합니다.
    3. 입구를 0.1 M 아세트산 용액에 놓고 펌프 세척을 수행하고, 아세트산 용액의 3 CV로 컬럼을 세척합니다.
    4. 펌프 세척 및 물 2 이력서로 컬럼을 세척하고 세척합니다.
    5. 모든 입구를 20%(v/v)에 넣고 펌프 세척 단계를 실행하고 20%(v/v)에 탄올에 열을 보관하여 20%(v/v)의 3CV로 세척합니다.
       참고: 시스템이 건조하거나 공기 중으로 짜증이 나는 적이 없는지 확인합니다. 버퍼에 버퍼를 직접 적용하거나 버퍼에 에탄올을 적용하지 마십시오. 그렇지 않으면 열을 막히는 침전물의 위험이 있기 때문에 항상 사이에 물 세척 단계를 추가하십시오. 충분한 샘플 수집 튜브를 추가해야 합니다.

5일차:

28. 반투명 펠릿을 방해하지 않고 상체를 조심스럽게 버리고 각 펠릿을 0.5mL의 얼음 차가운 리보솜 버퍼로 씻으십시오. 이 단계를 두 번 반복합니다.
29. 가능한 가장 낮은 속도를 사용하여 자기 교반기의 자기 교반 바(직경 3mM, 길이 10mM)를 사용하여 얼음에 리보솜 버퍼100μL로 각 클리어 펠릿을 재연합니다. 리보솜을 수집하고 리보솜 버퍼의 추가 50 μL로 튜브를 세척합니다.
    참고: 반투명 펠릿은 보기 가 어렵습니다. 따라서 튜브 의 측면에서 펠릿을 조심스럽게 씻으십시오.
30. 리보솜 완충에서 1:100의 비율로 희석된 시료의 260nM에서 흡광도를 측정하여 리보솜 농도를 결정한다. 희석된 용액 10의 흡광도는 이전에 설명된^16과같이 희석되지 않은 용액의 23 μM에 해당한다.
31. 10 μM의 최종 재고 농도를 구현합니다. 농도를 조정하려면 리보솜을 리보솜 버퍼로 희석하거나 4°C에서 3kDa 원심 필터에서 14000 x g에서 원심분리에 의해 더 농축한다.
    참고: 최적의 시스템 표현을 얻으려면 리보솜 적정(섹션 5.2, 보충표 7)을수행합니다.
32. 섹션 1.3.3에 지정된 대로 SDS-PAGE(그림3A)를통해 리보솜 조성물을 확인합니다. 7.5 μL의 물로 시료의 2.5 μL을 희석하고, 2x Laemmli 버퍼의 10 μL과 혼합한 다음, 5 μL 및 2.5 μL의 샘플을 젤에 로드합니다.

4. 에너지 솔루션

참고: 여기에 도입된 2.5x 에너지 솔루션의 구성은 표준 TX-TL 반응에 적합한 솔루션의 예입니다. 타이밍을 최적화하려면 2일동안 에너지 솔루션을 준비하십시오. 아미노산 용액의 준비는 세부 사항으로 설명되고 최종 준비 절차가 뒤따릅니다.

1. 아미노산 용액
   참고: 아미노산 용액을 대량으로 준비합니다. 최소 2000 μL의 최종 부피에 필요한 아미노산 스톡 솔루션의 양을 준비하면 매우 적은 양의 계량 오차가 줄어듭니다. 아미노산 용액의 전반적인 농도는 아미노산의 용해도 및 각각의 재고 용액 농도에 의해 제한됩니다. 표준 PURE 시스템의 경우 최종 농도가 3.25mM인 솔루션을 준비합니다. 아미노산 용액 계산표(보충 표 3)를템플릿으로 사용하십시오. 충분한 용해도를 보장하기 위해 소금 형태로 시스테인을 사용합니다. KOH 기반 아미노산 제제 방법을 사용하지 마십시오. 모든 아미노산에 대한 재고 용액을 준비하지 않고도 정확한 양의 아미노산을 최종 아미노산 용액에 직접 계량할 수 있습니다. 그러나, 이것은 더 도전적이고 덜 정확합니다.
   1. 티로신을 제외한 보충표 3에기재된 바와 같이 각 아미노산에 대한 스톡 솔루션을 준비한다.
      참고: 물에 있는 아미노산의 다른 수용성 때문에, 주식 용액의 각각의 제안된 농도는 다릅니다.
   2. 최소 질량 [mg]은 기준으로서 대상 전체 부피에 대한 충분한 양의 스톡 솔루션을 얻는 데 필요한 대략적인 최소 질량을 제공한다.
      참고: 최소 질량은 10%의 잉여로 계산됩니다.
   3. 용액의 쉬운 준비를 위해 정확한 양의 아미노산을 계량하지 말고 대신, 당면한 질량의 경우 원하는 농도를 달성하기 위해 물의 양을 조절합니다. 보충표 3에서스프레드시트를 사용하여 실제 질량(라이트 옐로우 셀)과 원하는 농도를 기준으로 필요한 탈이온화된 물([μL]을 추가하는 물)의 양을 계산한다.
   4. 모든 침전이 용해 될 때까지 소용돌이에 의해 아미노산 스톡 솔루션을 용해. 개별 아미노산 스톡 용액은 몇 주 동안 -20 °C에서 저장될 수 있습니다.
      참고: 일부 아미노산은 물에 용해하기 어렵다; 프로세스에 다소 시간이 걸릴 수 있습니다.
   5. 아미노산 용액을 위해 튜브내로 직접 3.25 mM의 최종 농도를 얻는 데 필요한 정확한 티로신의 양을 계량한다.
      참고 : 티로신은 물에 용해하기가 매우 어렵습니다. 스톡 솔루션을 준비하는 대신 직접 추가합니다.
   6. 최종 부피에 표시된 바와 같이 상응하는 양의 아미노산 스톡 솔루션과 물을 추가하여 [μL] 컬럼(light blue cells)을 추가하고 용액을 잘 소용돌이시다. 완성된 아미노산 용액을 -80°C에 추가 로 사용할 때까지 보관하십시오.
2. 에너지 솔루션 준비
   참고: 총 2.5배 에너지 솔루션은 각 아미노산의 0.75mM를 함유하고 있으며, 아세테이트 29.5mMM, 글루타민산 250mM, ATP 5m, CTP, UTP, TCEP 2.5mMM, E. coli MRE 600, 50mMTRNA 의 TRNA 1.75 mg/mL, 크레아틴 포메이트 05m 5 mM의 정자, 그리고 125 HEPES의 mM. 최초 이용자는 200μL의 작은 배치로 에너지 용액을 준비합니다.
   1. 얼음에 보충 표 5에 언급 된 모든 수성 솔루션을 해동.
   2. 한편, 보충표 4에나열된 나머지 구성 요소에 대한 재고 솔루션을 준비한다. 준비 후 모든 솔루션을 얼음에 보관하십시오.
      참고: RNase 및 DNase 가 없는 물의 500μL을 바이알에 직접 추가하여 lyophilized tRNA를 용해시세요. 부드러운 소용돌이로 잘 섞으세요. RNases를 도입하지 않도록 파이펫팅을 제한합니다.
   3. 스톡 솔루션과 물의 계산된볼륨(보충 표 5)을추가하고 소용돌이를 사용하여 잘 섞습니다. 항상 얼음에 용액을 유지합니다.
   4. 1 μL을 pH 스트립에 파이프하여 용액의 pH를 측정하여 용액의 pH가 중립적인지 확인합니다.
   5. Aliquot는 얼음에 튜브 당 50-100 μL에서 에너지 용액을 쿼트하고 추가 사용이 될 때까지 -80 °C에 저장합니다. 알리쿼팅하는 동안, 주 재고를 자주 소용돌이하여 구성 요소가 침전되는 것을 방지합니다.
      참고: 선택적으로, PURExpress의 솔루션 A와 같은 상업용 에너지 솔루션에 대해 새로 만들어진 에너지 솔루션의 활동 분석법을 수행합니다. 에너지 용액을 가진 시스템의 성능이 현저히 낮아지면, 이온 농도, 특히 마그네슘 이온을 최적화하면 적정(5-20 mMM)에 의해 유리할 수 있다.

5. 원팟 퓨어 반응

1. DNA 템플릿
   참고: T7 프로모터의 하류에 인코딩된 단백질은 선형 또는 원형 DNA로부터 PURE로 발현될 수 있다. 확장 PCR을 사용하여 선형 DNA 템플릿을 생성하면 지루한 복제 단계를 생략할 수 있습니다. 이 연구를 위한 선형 템플릿은 아래에 설명된 바와 같이 PCR에 의해 생성되었으며, 고충실도 DNA 폴리머라제(재료표)를 이용하여생성하였다. 프라이머 서열, 용융 온도 및 이 연구에 사용되는 열순환기 설정은 보충 표 6에지정됩니다. DNA 템플릿의 준비는 일일 일정에 포함되지 않습니다.
   1. 중합체 공급 업체가 권장하는 대로 PCR 반응을 설정합니다.
      참고 : 고충실도 DNA 폴리머라제(재료의 표)에대한 최적화 된 매개 변수는 보충 표 6에서주어진다.
   2. 유전자 특이적 프라이머(500 nM)를 이용하여 플라스미드 또는 게놈으로부터 선형 템플릿으로서 표적 유전자(예를 들어, eGFP)를 증폭(파라미터의 경우, 보충표 6참조).
   3. 증폭은 다음 확장 PCR 단계에 대한 어닐링 시퀀스를 제공하기 위해 짧은 확장을 생성합니다.
   4. 올바른 크기와 순도에 대한 아가로즈 젤에 앰플리코를 확인합니다.
   5. 증폭된 DNA를 후속 확장 단계의 템플릿으로 사용합니다. 적어도 50 μL의 반응을 설정합니다.
   6. 확장 프라이머 (2.5 nM)와 함께 10 PCR 증폭 주기를 실행합니다. 증폭 주기를 완료한 후 최종 프라이머(500nM)를 동일한 반응에 즉시 추가하고 30사이클을 실행하여 확장된 PCR 제품을 증폭시합니다. 보충 표 6에서용융 온도와 프라이머 시퀀스를 찾습니다.
   7. DNA 정화 키트를 사용하여 DNA 단편을 정화하고 용출 완충제를 포함하는 EDTA 대신 핵이 없는 물에서 DNA를 엘로드합니다.
   8. 올바른 크기와 순도를 위해 아가로즈 젤의 선형 템플릿을 확인하십시오.
   9. UV-Vis 분광광계를 사용하여 ng/μL의 DNA 농도를 측정합니다.
2. 순수 반응 설정
   참고: 최종 반응 구성은 1x 에너지 용액, 태그 없는 리보솜 또는 그의 태그 리보솜, OnePot PURE 단백질 및 DNA 템플릿입니다. 반응 부피 비율은 40% 에너지 용액, 30%의 단백질 및 리보솜 용액, 30%의 DNA 및 물로 구성됩니다. 일반적인 반응 량은 5 μL과 25 μL 사이 다릅니다. 플레이트 판독기에서 형광 단백질의 발현을 지속적으로 정량화합니다. 녹색 Lys 사용 in vitro 형광으로 표지된 라이신 잔류물을 새로 합성된 단백질에 통합하는 번역 라벨링 시스템은 SDS-PAGE 젤에서 비형광 단백질의 발현을 검증합니다. 예제 반응 템플릿이 보충 표 7 PURE 세포 없는 발현 반응을 설정하는 데 도움이 됩니다. 노란색의 세포는 사용자 입력 값을 나타내고 주황색의 세포는 반응에 선택적으로 추가될 추가 시약을 나타냅니다. 올바른 이온 균형을 보장하기 위해 구성 요소의 볼륨 비율을 정밀하게 유지합니다. 예를 들어, 더 높은 단백질 농도를 달성하기 위해 OnePot 단백질 용액 농도를 증가시면; 그러나, 반응에 추가된 단백질 용액의 양을 증가시키지 않는다.
   1. 스프레드시트내의 해당 황세포에서 DNA의 농도[ng/μL] 및 길이[기본 쌍]을 채웁니다. 반응에 대한 DNA의 2-10 nM을 사용합니다.
   2. 필요한 총 반응 부피를 μL로 채웁니다.
   3. 냉동고에서 필요한 시약을 제거하고 얼음에 해동하십시오.
      참고: 기능 저하 없이 구성 요소를 재고정할 수 있습니다. 그러나 동결 해동 주기의 수를 최소화하고 샘플이 얼음에 가능한 한 많이 저장되는 시간을 최소화하십시오.
   4. 피펫은 PCR 튜브의 한쪽 또는 384웰 플레이트상의 우물의 한쪽 구석에 계산된 양의 물, DNA 및 에너지 용액을 피펫합니다. 같은 쪽에 필요한 시약을 추가합니다. 실험당 샘플 수를 최소화하여 샘플 증발 및 실험 시작 시간 편향을 방지합니다.
      참고: 에너지원의 조기 소비와 낮은 수율을 피하기 위해 에너지 성분을 단백질 성분과 물리적으로 분리하는 것이 중요합니다.
   5. 피펫은 PCR 튜브의 반대편 또는 384웰 플레이트의 반대쪽 모서리에 계산된 양의 단백질 및 리보솜 용액을 피펫한다.
      참고: 가능한 한 마스터 믹스를 사용하여 파이펫 팅 오류의 영향을 줄입니다. 초기 테스트 후 리보솜 및 단백질 용액을 하나의 솔루션으로 혼합하고 저장할 수 있습니다.
   6. 짧은 시간 동안 회전 (30 s) 반응 구성 요소를 병합. 플레이트 리더 실험 중 증발을 방지하려면 액체 왁스 35μL을 추가하고 투명 실란트로 플레이트를 밀봉하십시오(재료 표참조).
   7. 37°C에서 최소 3시간 동안 배양합니다.
   8. 플레이트 판독기의 판독을 위해, 필요한 파장에서 형광 강도를 측정매 2분마다(대표적인 결과는 도 3B에표시됨).
   9. 녹색 Lys 레이블 이샘플에 대 한 다음 단계를 수행 합니다.
   10. 세포-자유 발현 후, 37°C에서 30분 동안 RNase A의 0.16 μg/μL으로 샘플을 배양하여 그린 리스 라벨링 키트의 형광 배경을 제거한다.
       참고: RNase의 다른 유형이 배경을 충분히 제거하지 않기 때문에 RNase A를 사용합니다.
   11. 섹션 1.3.3에 명시된 대로 SDS-PAGE를 실행하여 단백질 발현을 시각화합니다. 스테인드 드 젤을 탈이온된 물에 부드럽게 씻고 488nm의 난동파장을 사용하여 형광 이질에 이미지를 담가집니다.
   12. 이어서, 기존의 쿠마시 염색 방법을 사용하여 젤을 염색. 적합한 매개 변수의 경우 섹션 1.3.3을 참조하십시오.
       참고: 권장 리보솜 농도로 단백질 용액의 적정을 수행하고 필요한 경우 리보솜을 최적의 OnePot 단백질 농도로 격자화합니다. 상용 PURExpress ΔRibosome 키트를 긍정적인 제어로 사용합니다. 용액 A, 팩터 믹스 및 리보솜 용액은 각각 제조된 에너지, OnePot 단백질 용액 및 정제된 리보솜에 대응한다.

결과

위의 프로토콜은 모든 실험실에서 PURE 세포 없는 TX-TL 시스템을 쉽게 확립하도록 설계되었습니다. 이 프로토콜에는 PURE 시스템의 세 가지 뚜렷한 부분의 준비에 대한 자세한 설명이 포함되어 있습니다: OnePot 단백질, 리보솜 및 에너지 솔루션. 워크플로를 최적화하는 자세한 일일 일정은 표 1에표시됩니다. 워크플로우는 그의 태그된 리보솜의 정화에 최적화되어 있으며, 태그없는 리보솜 정제가 수행되면 시간 프레임이 약간 다를 수 있습니다. 한 번의 준비는 최소 500μL 반응에 대해 충분한 양의 PURE를 제공합니다. 더욱이, 준비된 용액은 -80°C에서 1년 이상 안정되어 있으며 여러 동결 해동 주기를 견딜 수 있다.

모든 균주에 대한 적절한 과발현 수준은 최종 단백질 용액의 기능에 매우 중요합니다. 도 1은 OnePot 단백질 제제에 대해 이후에 사용되는 모든 36개의 개별 균주에서 성공적인 과발현을 나타낸다. 과발현 단백질의 대역 강도의 변화는 SDS-PAGE 젤에 부피를 적재하는 편향으로 인해 가장 많이 발생했을 것이다. 예상 단백질 크기는 표 2로요약됩니다. GlyRS 및 PheRS는 다양한 분자량의 2개의 하위 단위로 구성됩니다; 나머지 34단백질은 단일 서브유닛으로 구성된다. 이 프로토콜의 단순성과 시간 효율성의 핵심은 응모 및 공동 정화단계(그림2)입니다. OnePot 단백질 용액은 다른 모든 발현 균주에 대하여 EF-Tu 균주의 비율을 증가시킴으로써 제조되었다. 최종 단백질의 전체 조성물은 SDS-PAGE(도3A)에의해 분석되었다. 겔(lanes 2, 3)에서 EF-Tu(43.3 kDa)가 예상대로 다른 단백질에 비해 더 높은 농도로 존재하는 것이 눈에 띈다. 젤은 단백질 발현 비의 좋은 첫번째 표시를 제공하지만, 각 개별 단백질이 표현된 수준 및 어느 수준을 결정하기 어렵다. 따라서, 상기와 같이, 응식하기 전에 각 변형의 과발현을 확인하는 것이 좋습니다.

대장균은 50개 이상의 개별 단백질 하위^{유닛(23)으로}구성된 복합 분자 기체이다. 태그없는 리보솜 정화를 위한 260 nm의 대표적인 흡수 스펙트럼이 도 4에도시되어 있다. 세 번째 피크는 성공적인 리보솜 용출의 특징입니다. 두 리보솜 정제 방법에 대해, SDS-PAGE젤(도 3A)^18에서 예상되는 실행 패턴을 관찰하였다. 소량(<10%)이었기는 하지만 두 정제모두에 대한 오염을 관찰했습니다. 특히, 타구가 없는(차선 5, 6) 및 그의 태그가 지정된(차선 11, 12) 리보솜에 상이한 오염물질이 존재했다. 사용자 참조를 위해 결합된 시스템에 대한 SDS-PAGE 젤도 포함됩니다(차선 8, 9 및 14, 15).

마지막으로, 상이한 리보솜 변종을 이용한 준비된시스템(도 3)의성능이 비교된다. 시험관 내 eGFP 발현의 시간 과정은 PURE 시스템이 모두 기능적이고 형광 eGFP를 생성한다는 것을 보여줍니다. 그러나, 원포트 단백질 용액은 적정에 의해 최적화된 리보솜 농도를 이용하여, 태그가 없는 리보솜버전(그림 3B)의발현 레벨의 3분의 1만 산출하였다. 유사한 결과는 다른 크기의 3개의 단백질이 체외 라벨링 시스템(그림3C)에서녹색 Lys tRNA를 사용하여 발현및 표지되었을 때 관찰되었다. 형광 젤에서 볼 수 있듯이, 전체 길이 제품은 성공적으로 두 시스템에서 발현되었다; 그러나, 표현 수준의 절반 정도만이 그의 태그 리보솜 시스템으로 달성되었다. 형광 라벨링 외에도, 3가지 단백질 모두에 대한 예상 밴드는 쿠마시 스테인드젤(도 3D)에서구별할 수 있다. 결과는 표준 장비가 있는 실험실에서 1주일 이내에 제조될 수 있는 도입된 발현 시스템이 선형 템플릿으로부터 T7 프로모터의 하류로 인코딩된 단백질의 체외 발현에 사용될 수 있음을 보여준다.

그림 1: PURE 시스템의 모든 식균에 대한 초과식 테스트의 대표적인 결과. PURE 단백질 수와 크기는 표 2로요약됩니다. 단백질 번호 21, 24 및 27은 더 나은 시각화를 위한 별으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 원포트 단백질 정제. OnePot 단백질 용액 의 생산에 관련된 모든 단계의 회로도 묘사 및 해당 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 3: 상이한 리보솜 변종을 이용한 제조된 시스템의 성능. (A)코마시 블루 스테인드 SDS-PAGE 젤의 OnePot 단백질 용액(차선 2, 3), 단백질 용액이 없는 태그없는 리보솜(차선 5, 6) 및 단백질 용액(차선 8, 9), 단백질 용액이 없는 리보솜(차선 11, 12차선) 및 12차선(차선 11, 124)이 없는 리보솜(lanes 11, 124). 샘플당 두 개의 서로 다른 농도가 로드되었습니다. (B)그의 태그리보솜과 태그없는 리보좀의 eGFP 표현의 비교. 시험관 내 eGFP 발현의 형광 강도는 태그없는 리보솜(1.8 μM, 파란색) 및 태그가 지정된 리보솜(0.62 μM, 빨간색)을 사용하여 퓨어 반응을 위해 시간이 지남에 따라 모니터링됩니다. 선형 템플릿과 OnePot 단백질 용액의 농도는 각각 4nM 및 2 mg/mL이었다. 패널(C)및(D)는원포트에서 합성된 단백질의 SDS-PAGE 젤을 태그없는(1.8 μM, 블루, 레인 3, 4, 5)와 그의 태그 리보솜(0.62 μM, 적색, 차선 6, 7, 8)으로 표시하여 각각 의체외 라벨 키트(C) 및 디매스(C) 염색키트(C) 및 디매스(C)와 함께 그린리(C) 및 디매스(D)를 표시한다. 검은 화살은 합성 단백질의 예상 밴드를 나타냅니다: eGFP (26.9 kDa), ArgRS (64.7 kDa), T7 RNAP (98.9 kDa). 선형 템플릿 및 OnePot 단백질 용액 농도는 각각 4nM 및 1.6 mg/mL이었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 흡광스펙트럼 스펙트럼 260 nm. 태그없는 리보좀의 소수성 상호 작용 정화 시 260 nm에서 흡광스펙트럼 스펙트럼의 대표적인 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 모든 OnePot PURE 솔루션의 준비를 위한 일일 시간 최적화 된 일정.

표 2: PURE 단백질 목록은 여기를 클릭하여 이 표를 다운로드하십시오.

보충 표 1: 시약. 표에는 이 연구 중에 사용되는 시약 및 구성 요소의 농도, 볼륨 및 기타 특정 세부 정보가 나열되어 있습니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 2: 버퍼. 스프레드시트에는 단백질, 태그 없는 리보솜 및 그의 태그 리보솜 정제뿐만 아니라 준비에 사용되는 스톡 솔루션의 농도에 대한 정확한 완충성분이 나열되어 있습니다. 또한 버퍼 볼륨을 기반으로 필요한 양의 구성 요소를 계산합니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 3: 아미노산 계산. 스프레드시트에는 에너지 용액에 필요한 아미노산과 권장 재고 용액 농도가 나열되어 있습니다. 실제 계량 질량에 기초하여 각 아미노산에 첨가되는 물의 양을 계산하고, 또한 최종 아미노산의 혼합물에 첨가할 아미노산 용액의 부피를 계산한다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 4: 에너지 솔루션을 위한 스톡 솔루션. 이 표는 에너지 솔루션에 필요한 재고 솔루션의 농도와 볼륨을 나열하고 저장 조건을 포함한 자세한 내용을 나타냅니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보조 표 5: 에너지 솔루션. 표에는 에너지 솔루션 구성 요소와 권장 농도가 나열되어 있습니다. 또한, 스톡 솔루션 농도 및 에너지 솔루션의 부피에 따라 최종 솔루션에 추가해야 하는 필요한 볼륨을 계산합니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 6: PCR. 표는 확장 PCR에 사용되는 프라이머의 서열 및 농도를 나열하고 고충실도 DNA 폴리머라제에 최적화 된 용융 온도 및 열 사이클러 단계를 나타냅니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 7: 순수한 반응. 스프레드시트는 PURE 반응의 예제 설정을 보여 주습니다. 태그없는 리보솜 또는 His-tag 리보솜을 사용하여 PURE 반응을 위해 구성 요소의 사용 농도 및 볼륨을 나열합니다. 또한, 단백질과 리보솜 적정에 대한 부피 비율을 계산합니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

여기에 제시된 프로토콜은 표준^{조성물(15)에}기초하여 다재다능한 PURE 발현^{시스템(20)을} 준비하는 간단하고 시간 적이며 비용 효율적인 방법을 설명한다. 제공된 일일일정(표 1)과함께 프로토콜을 활용하여 모든 구성 요소를 1주에 제조할 수 있으며 최대 500μL PURE 반응에 충분한 양을 산출할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 단백질은 높은 복사 플라스미드로부터 과발현되고 대장균에대한 독성이 낮기 때문에 필요한 모든단백질(도 1)에대해 양호한 발현 수준이 관찰된다. 이것은 균주의 쉬운 조정을 허용하고, 따라서 또한 교양에서 단백질 조성을 허용, 단순히 접종 균주의 비율을 수정하여⁽²⁰⁾. 리보소피 단백질 외에도 EF-Tu의 농도는 발현 수율^6에대한 근본적인 중요성을 보였다. 대조적으로, 다른 단백질 성분의 농도의 변화는 PURE 시스템^7,24의견고성에 상대적으로 낮은 영향을 미쳤다. 따라서, EF-Tu의 접종 비율을 다른 모든 구성 요소에 대하여 조정함으로써, 표준 PURE 조성물에 유사한 조성물을 달성할 수 있고, 유사한^{수율(20)을} 가진 PURE 시스템을 달성할 수 있다. 단백질 용액을 준비할 때, 모든 균주가 잘 자라도록 보장하고 유도 후 인코딩된 단백질을 과도하게 표현하는 것이중요합니다(도 1).

리보솜 기능은 PURE^{시스템(24)의}전반적인 성능의 핵심이다. 이 프로토콜에서는 리보솜 솔루션을 준비하기 위한 두 가지 방법이 시연됩니다( 예: 태그없는 및 그의 태그가 지정된 리보솜 정화). 태그없는 리보솜 정제는 소수성 상호 작용 크로마토그래피를 기반으로 하며, 그 다음에는 자당 쿠션을 가진 원심분리작용을 기반으로 하며, 이는 FPLC 정화 시스템과^{초원심분리기(15)에}대한 접근이 필요하다. 대조적으로, 그의^{태그리보솜(18)과} 중력흐름친화정제를 활용한 방법은 특수장비를 필요로 하지 않으며 대부분의 실험실에서 수행될 수 있다. 따라서 후자의 방법은 단순성 및 접근성과 같은 이점을 제공합니다. 그러나, 원팟 퓨어에서 그의 태그가 붙은 리보솜을 사용할 때 합성 수율이 현저히 낮은 것을 관찰하였다(도3). 응용 프로그램의 유형에 따라, 이 낮은 수율은 허용 될 수있다.

에너지 솔루션은 체외 TX-TL 반응에 연료를 공급하는 데 필요한 저분자 성분과 tRNA를 제공합니다. 이 프로토콜은 사용자의 요구에 따라 쉽게 조정할 수 있는 일반적인 에너지 솔루션에 대한 레시피를 제공합니다. tRNA, NTP 및 크레아틴 인산염과 함께, Mg²⁺ 이온의 풍부하고 농도는 전사 및 번역에 중요한 보조 인자이기 때문에 PURE 시스템^8의전반적인 성능에 매우 중요합니다. 어떤 경우에는 이온의 적정이 전체 PURE 성능을 크게 향상시킬 수 있습니다. DNA 무결성은 PURE 성능에 매우 중요합니다. 따라서, 발기인 영역, 리보솜 결합 부위 및 표적 유전자를 확인하고 적절한 DNA 농도(<2 nM)가 PURE 반응을 설정하는 동안 발생할 수 있는 문제를 해결하는 데 도움이 될 것이다.

PURE 시스템은 최소한의 TX-TL 시스템이며, 따라서 특정 응용 프로그램은 추가 조정이 필요할 수 있습니다^25. 이들 로는 상이한 RNA 중합체^9,26,샤페론(13) 및 EF-P 또는 ArfA 8과 같은 단백질 인자를 포함할 수^있다. 이러한 단백질에 대한 발현 균주는 공동 배양에 포함될 수 있지만, 준비된 시스템에 별도로 추가하는 것은 필요한 단백질 수준을 더 잘 제어할 수 있다. 더욱이, 소포의 포함은 막 단백질^10,11의생산에 필수적이다. 환경과 이황화물 결합 이소머라제는 환경과 이황화물 결합을 감소시키기 보다는 산화는 예를 들어, 분비^{단백질(12)에}필요한 적절한 이황화 결합 형성을 용이하게 한다.

추가 구성 요소가 반응을 방해하지 않도록 하는 것이 필수적입니다. 반응을 설정하거나 다른 구성 요소를 추가할 때 주의를 기울여야 할 가장 중요한 요소는 다음과 같습니다. 호환되지 않는 버퍼가 사용되지 않고 이온 농도가 방해되지 않도록 합니다. 글리세롤, 고농도 칼륨, 마그네슘, 칼슘 이온, 삼투석, 파이로포스페이트, 항생제 또는 EDTA를 가능한 한 함유한 용액을 피하십시오. 예를 들어, EDTA가 이 완충제에서 일반적인 첨가제이기 때문에 DNA 정제 시 용출 완충제를 물로 대체하는 것이 유익할 수 있다. NTP 또는 dNTP와 같은 추가 음전하 분자와 함께 솔루션을 공급하려면 음전하 분자가 킬라팅 제로 작용하고 양전하 분자를 결합하기 때문에 마그네슘 농도^8을조정해야 합니다. 중립 pH는 반응에 이상적입니다. 따라서 모든 구성 요소는 해당 pH에 버퍼링되어야 합니다. 이것은 NTPs와 같은 고산성 또는 기본 분자를 위해 특히 중요합니다. 좋은 수율을 달성하기 위해, 34 °C 이하의 온도가 크게 수율^27을감소시킬 수 있기 때문에, 37 ° C 주위의 온도를 구현해야합니다.

OnePot PURE를 준비하기 전에 대상 응용 프로그램 및 부피, 순도, 수정 용이성 및 구성 요소의 포함 또는 누락과 같은 관련 요구 사항을 고려해야 합니다. 많은 응용 프로그램의 경우 시스템은 훌륭한 선택이 될 것이지만 다른 응용 프로그램은 원팟 시스템이 제공할 수 없는 수율, 조정 가능성 및 기타 요인이 필요할 수 있습니다. 이와 관계없이, 도입된 프로토콜은 이러한 준비를 위한 모든 중요한 단계가 여기에 요약되기 때문에 모든 홈메이드 시스템의 준비에 도움이 될 것입니다.

OnePot 시스템의 주요 장점 중 하나는 시판되는 PURExpress 시스템과의 호환성으로 각 PURExpress 구성 요소를 OnePot에 상응하는 구성 요소를 순차적으로 교체하여 모든 구성 요소의 기능과 무결성을 별도로 테스트할 수 있다는 점입니다. 튜닝성과 쉽고 빠르며 비용 효율적인 준비와 같은 OnePot PURE 시스템의 장점은 전 세계적으로 더 많은 실험실에 세포가 없는 TX-TL에 접근할 수 있게 하고 세포 없는 합성 생물학에서 이 강력한 플랫폼의 구현을 확장하는 데 기여할 것입니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Tris/Glycine/SDS buffer	Bio-Rad Laboratories	1610732
15 mL centrifuge tubes	VWR International	525-0309
384-well Black Assay Plates	Corning	3544
4-20% Mini-PROTEANRTM TGXTM Precast Protein Gels	Bio-Rad Laboratories	4561096
50 mL centrifuge tubes	VWR International	525-0304
96-Well Polypropylene DeepWell plate	Nunc	260252
Acetic acid, 99.8 %	Acros	222140010
Äkta purifier	GE Healthcare		purification of tag free ribosomes
AMICON ULTRA 0.5 mL - 3 KDa	Merck Millipore	UFC500324
AMICON ULTRA 15 mL - 3 KDa	Merck Millipore	UFC900324
Amino acids	Sigma-Aldrich	LAA21-1KT
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	09718-250G
Ammonium sulfate	Sigma-Aldrich	A4418
Ampicillin	Condalab	6801
BenchMark Fluorescent Protein Standard	ThermoFisher	LC5928
Breathe-Easy sealing membrane	Diversified Biotech	Z380059-1PAK
Centrifuge tubes polycarbonate	Beckman	355631	purification of tag free ribosomes
Chill-out Liquid Wax	Bio-Rad Laboratories	CHO1411
Creatine phosphate	Sigma-Aldrich	27920
DNA Clean & Concentrator-25 (Capped)	Zymo	ZYM-D4034-200TS
DTT	SantaCruz Biotech	sc-29089B
Econo-Pac Chromatography Columns	Bio-Rad Laboratories	7321010
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)	Sigma-Aldrich	03609-250G
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes	VWR International / Eppendorf	525-0133
Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap	Falcon	352051
Flasks, baffled 1000 mL 4 baffles, borosilicate glass	Scilabware	9141173
FluoroTect Green Lys in vitro Translation Labeling System	Promega	L5001	optional
Folinic acid	Sigma-Aldrich	PHR1541
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7757-1L
HEPES	Gibco	15630-056
HiTrap Butyl HP Column	GE Healthcare	28411005	purification of tag free ribosomes
IMAC Sepharose 6 Fast Flow	GE Healthcare	17-0921-07
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399
InstantBlue	Expedeon	ISB1L-1L
IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactoside)	Alfa Aesar	B21149.03
Laemmli buffer (2x), sample buffer	Sigma-Aldrich	S3401-1VL
Lysogeny broth (LB) media	AppliChem	A0954
Magnesium acetate	Sigma-Aldrich	M0631
Magnesium chloride	Honeywell Fluka	63020-1L
Nickel Sulfate	Alfa Aesar	15414469
NTP	ThermoFisher	R0481
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL)	ThermoFisher	F530S
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P5405-1KG
Potassium glutamate	Sigma-Aldrich	49601
PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit	NEB	E6800S
PURExpress Δ Ribosome Kit	NEB	E3313S
Quick Start Bradford 1x Dye Reagent	Bio-Rad Laboratories	5000205
Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units	ThermoFisher	564-0020
RNaseA solution	Promega	A7973
SealPlate film	Excel Scientific	Z369659-100EA
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	6203
Spermidine	Sigma-Aldrich	S2626
Sucrose	Sigma-Aldrich	84097
TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphin -hydrochlorid)	Sigma-Aldrich	646547-10X1mL
Thickwall Polycarbonate Tube	Beckman	355631
Trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	T0699
Tris base	ThermoFisher	BP152-500
tRNA	Roche	10109541001
Ultracentrifuge Optima L-80	Beckman		purification of tag free ribosomes
Whatman GD/X syringe filters	GE Whatman	WHA68722504
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250-100mL