自动、高通量检测细菌对宿主细胞的粘附

摘要

使用高通量荧光标记成像以及自动统计分析方法，基于表型粘附性检测宿主 - 细菌病原体相互作用，可以快速评估细菌与宿主细胞的潜在相互作用。

摘要

识别新出现的细菌病原体对人类健康和安全至关重要。细菌对宿主细胞的粘附是细菌感染的重要步骤，并构成潜在威胁的标志。因此，检查细菌对宿主细胞的粘附性可以用作细菌威胁评估的一个组成部分。枚举细菌对宿主细胞的粘附的标准方法是将细菌与宿主细胞共同孵育，收获贴壁细菌，将收获的细胞接种在固体培养基上，然后计算所得的菌落形成单位（CFU）。或者，可以使用基于免疫荧光显微镜的方法评估细菌对宿主细胞的依从性。然而，实施这些方法的传统策略既耗时又低效。在这里，描述了最近开发的基于自动荧光显微镜的成像方法。当与高通量图像处理和统计分析相结合时，该方法可以快速定量粘附在宿主细胞上的细菌。测试了两种细菌物种，铜绿革兰氏阴 性假单胞菌 和革兰氏阳性 单核细胞增多性李斯特菌 以及相应的阴性对照，以证明方案。结果表明，这种方法可以快速准确地枚举贴附细菌，并显着减少实验工作量和时间表。

引言

细菌粘附是细菌附着在其他细胞或表面上的过程。细菌病原体感染的成功建立需要粘附于宿主细胞，定植组织，并且在某些情况下，侵入宿主细胞^1，2，3。新出现的传染病构成重大的公共卫生威胁，最近的COVID-19大流行^4，5，6证明了这一^点。重要的是，使用基于基因组的方法可能无法轻易识别新的或正在出现的病原体，特别是在病原体被设计为逃避检测或不包含将其识别为致病性的基因组特征的情况下。因此，使用直接评估致病性特征的方法（如细菌对宿主细胞的粘附性）鉴定潜在病原体可以在病原体鉴定中起关键作用。

细菌对宿主细胞的粘附性已被用于评估细菌发病机制数十年^1，7。显微成像^8、9和通过感染后电镀枚举细菌集落形成单元（CFU）10、11、12、13是两种成熟的实验室方法，用于测试微生物的粘附和/或宿主细胞的感染^14。考虑到细菌细胞的微米级大小，贴壁细菌细胞的枚举通常需要使用先进的高倍率显微镜技术，以及高分辨率成像方法，包括电子显微镜，膨胀显微镜（ExM）15，16和三维成像¹⁷.或者，可以通过在固体琼脂上接种收获的细菌的稀释系列并计数所得的CFU^10，12，13来计数与宿主细胞结合或内化在宿主细胞内的细菌的枚举。这种方法费力，包括许多手动步骤，这给建立高通量分析所需的标准化或自动化程序带来了困难^18，19。因此，开发用于评估宿主细胞附着的新方法将解决该领域当前的局限性。

这里描述了一种这样的方法，它使用自动化高通量显微镜，结合高通量图像处理和统计分析。为了证明这种方法，对几种细菌病原体进行了实验，包括铜绿假单胞菌，一种人类，动物和植物的机会性革兰氏阴性细菌病原体14，20，它经常被发现定植于宿主防御功能受损患者的呼吸道。这种方法优化了先前研究^14，20中描述的显微成像过程。通过荧光标记的宿主细胞和细菌简化了成像检测，以快速跟踪它们的接近程度，这大大减少了显微镜工作量，以获得用于区分细菌的高分辨率图像。此外，对计数宿主细胞和细菌中的图像进行自动统计分析取代了细菌CFU接种的动手实验，以估计每个宿主细胞的贴壁细菌计数的比率。为了证实该方法的相容性，还测试了多种细菌菌株和宿主细胞类型，如单核细胞增多性李斯特菌，金黄色葡萄球菌，蜡样芽孢杆菌和肺炎克雷伯菌，以及人脐静脉内皮细胞（HUVECs），结果支持该方法的多样性和有效性。

研究方案

1. A549细胞培养

1. 将A549细胞系维持在补充有10%胎牛血清（FBS）的F-12K培养基中，并在37°C，5%CO₂下孵育。
2. 每3-4天更换一次培养基，以85%-95%的汇合度通过。
3. 简而言之，用1x磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4，除非另有说明）冲洗细胞，并在37°C下用1ml 0.25%胰蛋白酶-0.53mM乙二胺四乙酸（EDTA）溶液（浸没细胞层）处理约2分钟。
4. 加入额外的6mL完全生长培养基（F-12K培养基+ 10%FBS）以停止蛋白酶活性。然后，将细胞以1:3-1:8的沉降比接种在无菌聚苯乙烯T-75组织培养瓶中。最终培养体积为12mL。
5. 在粘附测定前一天将约1 x 10⁴ 个A549细胞（细胞浓度:~1×10⁵ 个细胞/ mL）接种到96孔板的每个孔上。

2. 细菌生长和染色

1. 在生物安全柜，生物安全2级实验室中执行所有细菌工作。
2. 从冷冻甘油储备中接种所有细菌培养物，包括铜绿假单胞菌（PAO1），大肠杆菌，单核细胞增多性李斯特菌和枯草芽孢杆菌等，并在37°C的振荡培养箱中在37°C下在250rpm下振荡培养的胰蛋白酶大豆肉汤（TSB，3mL）中生长它们。
3. 第二天，使用1:100稀释的过夜培养物接种传代培养物，并在TSB（1mL）中生长3小时至指数相，测量600nm处的OD（OD_600）以确认。确保 OD₆₀₀ 在 0.4-0.6 的范围内。
4. 在进行细菌 - 宿主依从性测定之前，将板连续稀释细菌悬浮液到TSB-琼脂平板上，在37°C下孵育过夜，然后从菌落数量中建立细菌CFU。对于 铜绿假单胞菌，OD₆₀₀ 为1.0对应于2 x 10⁸ 活细菌细胞/mL，而对于 单核细胞增多性李斯特菌，OD₆₀₀ 为1.0对应于9 x 10⁸ 活细菌细胞/mL。
5. 通过在室温（RT）下以13，000×g离心2分钟，在指数相上收获细菌培养物，然后使用1x PBS（1mL）洗涤一次。将细菌沉淀重悬于1mL 1x PBS中，并通过测量OD₆₀₀细菌悬浮液来确定浓度。例如，OD_600为0.5的铜绿假单胞菌代表1×10⁸个细菌细胞/ mL的浓度。
6. 在室温下使用绿色或红色荧光染料染色细菌悬浮液30分钟，在黑暗中轻轻旋转。为此，将2μL500倍浓缩的储备染色染料加入1mL细菌悬浮液中以稀释染料1倍。为了洗掉染色染料，将染色的细菌以13，000×g离心2分钟，并将沉淀重悬于1mL的1x PBS中三次。
   注意:如果在实验中使用荧光（GFP-，RFP-，mCherry-等）标记的细菌，则跳过此细菌染色步骤。GFP-标记 的铜绿假单胞 菌和红色荧光染料染色 的单核细胞增多性李斯特菌 用于该方案。
7. 通过以13，000×g离心2分钟收集染色的细菌细胞或GFP标记的细菌。 重悬于新鲜的F-12K培养基（1 mL）中，并测量每种培养物的OD_600。 随后根据感染（MOI）的多样性和宿主细胞浓度将培养物稀释至所需浓度。本实验中使用的最终体积为500μL。
   注意:例如，如果使用台盼蓝染色计数的宿主细胞浓度为1 x 10⁵ 个细胞/ mL，则MOI为100的细菌细胞的所需浓度将为1 x 10⁷ 个细胞/ mL。铜绿假单胞菌 在0.5 OD₆₀₀ 下的浓度为1×10⁸/mL。为了获得所需的浓度，将 铜绿假单胞菌 培养物稀释10倍，将50μL重悬培养物加入450μL新鲜F-12K培养基中。

3. 细菌粘附和宿主细胞染色

1. 首先，用温热的1x PBS洗涤接种的A549细胞单层三次。对于每次洗涤，向每个孔中加入100μL1x PBS，轻轻地上下移液三次，处理1x PBS或在添加后等待10秒，然后真空除去1x PBS。为了确定细菌关联的动力学，用100μL所需浓度的细菌悬浮液覆盖细胞，并具有不同的MOI（0，1，10和100）。将细菌以200×g旋转10分钟，并将受感染的A549细胞在37°C，5%CO₂下再孵育1小时。
   注意:在此实验中，每个条件都有一个技术上的一式三份。
2. 如上所述，通过用温热的1x PBS洗涤单层五次来去除未结合的细菌。将100μL4%甲醛（在1x PBS中）加入96孔板的每个孔中以固定细胞。让盘子在冰上静置15分钟，然后用1x PBS洗掉固定溶液三次。
3. 要染色细胞核，加入50 ng / mL的4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI），并在室温下孵育10分钟。孵育后，使用1x PBS洗涤孔三次。用100μL的1x PBS覆盖受感染的A549细胞以避免干燥。处理下一步或在黑暗中将板在4°C下储存长达2天。

4. 自动荧光成像、处理和分析

1. 为了保持数据的完整性，随机和手动选择每个孔的五个位置，以20倍放大倍率捕获图像。分别在DAPI和GFP通道下捕获A549细胞和细菌的荧光图像。使用PE-Cy5通道对红色荧光染料染色的细菌。
2. 要获得更好的分辨率，请处理所有图像以进行背景拼合和解卷积。将参数设置为滚动球直径为68 μm，用于平滑和自动测量基于物镜的图像反卷积的点扩散函数（PSF）。
3. 要对所有合格的细胞和细菌进行计数，测量宿主细胞和细菌的荧光强度，并将宿主细胞和细菌的最弱荧光强度设置为细胞计数的阈值。计数15μm距离内靠近宿主细胞的所有细菌，因为贴壁细菌为A549细胞的直径为10.59-14.93μm21。
   注意:成像系统中的默认设置选择性地计数直径范围为5-100μm的宿主细胞和大小为0.2-5μm（宽度和长度）的细菌。
4. 根据上述手动图像处理结果，将图像平滑、反卷积、物体大小、距离和荧光强度等参数应用于其余的自动图像。自动分析后，考虑关键读数，例如宿主细胞总计数，细胞大小和形状，总细菌计数以及每个宿主细胞的平均细菌计数，这是最重要的指标，以确定细菌粘附性。
5. 数据导出和统计分析
   1. 将所有图像的分析结果导出到电子表格（例如，"xlsx"格式）。自动化系统生成两组结果:1）每个图像的平均粘附细菌计数;2）每个单宿主细胞的信息性数据，如单个细胞上的贴壁细菌计数、宿主大小、宿主细胞和细菌的平均荧光强度等，来自相应的图像。
   2. 计算所有图像中粘附细菌计数的平均数和标准差，以表示与阴性对照相比的细菌粘附水平。在这种方法中， 大肠杆菌 和 枯草芽孢杆菌 分别作为检测革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌依从性的阴性对照。执行双向ANOVA以测试三个独立实验中治疗中数据点之间的显着差异。

结果

为了开发基于荧光成像的细菌粘附测定法，使用铜绿假单胞菌菌株PAO1及其阴性粘附对应物大肠杆菌来测试方案有效性，因为这些细菌对A549细胞的粘附已有^报道14，20，22。首先，分别在各种MOI下将GFP标记的铜绿假单胞菌（PAO1）和GFP标记的大肠杆菌与人类永生化上皮细胞系A549共同孵育。结果表明，PAO1?...

讨论

该协议描述了一种用于枚举细菌附着在宿主细胞上的自动化方法。与传统方法相比，所描述的方法具有几个有吸引力的优点。首先，这种方法能够精确定量附着在单个宿主细胞上的微生物病原体细胞的数量。重要的是，这种定量可以在不需要费力的细菌收获，连续稀释，在固体培养基上电镀以及CFU^10，11，12的测定的情况下进行...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x PBS	VWR	45001-130
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher	62248	Host cell staining dye
96 well plate	Corning	3882	Half area well, flat clear bottom
A549 cells	ATCC	CCL 185	Mammalian cell line
BactoView Live Red	Biotium	40101	Bacteria staning dye
Centrifuge	Eppendorf	5810R
CFSE cell division tracker	BioLegend	423801
Cytation 5	BioTek	Cytation 5	Cell imaging multi-mode reader
E. coli			Laboratory stock
EGM bulletKit	Lonza	CC-3124	HUVEC cell culture medium
EHEC			NIST collections
F-12k medium	ATCC	302004	A549 cell culture medium
Fetal bovine serum	Corning	35-016-CV
HUVEC			Laboratory stock
L. monocytogenes			NIST collections
OD600 DiluPhotometer	IMPLEN
P. aeruginosa			Dr. Lori Burrows laboratory stock
P. aeruginosa ΔpilA			Dr. Lori Burrows laboratory stock
S. agalactiae			NIST collections
S. aureus	BEI	NR-46543
S. aureus ΔsaeR	BEI	NR-48164
S. rubidaea			NIST collections
Typical soy broth	Growcells	MBPE-4040