Automatisierter Hochdurchsatz-Nachweis der bakteriellen Adhärenz an Wirtszellen

Zusammenfassung

Der Nachweis von Wirt-Bakterien-Pathogen-Interaktionen basierend auf phänotypischer Adhärenz mittels Hochdurchsatz-Fluoreszenzmarkierungsbildgebung zusammen mit automatisierten statistischen Analysemethoden ermöglicht eine schnelle Bewertung potenzieller bakterieller Interaktionen mit Wirtszellen.

Zusammenfassung

Die Identifizierung neu auftretender bakterieller Krankheitserreger ist für die menschliche Gesundheit und Sicherheit von entscheidender Bedeutung. Die bakterielle Adhärenz an wirtszellen ist ein wesentlicher Schritt bei bakteriellen Infektionen und stellt ein Kennzeichen potenzieller Bedrohung dar. Daher kann die Untersuchung der Adhärenz von Bakterien an Wirtszellen als Bestandteil der bakteriellen Bedrohungsbewertung verwendet werden. Eine Standardmethode zur Aufzählung der bakteriellen Adhärenz an Wirtszellen besteht darin, Bakterien mit Wirtszellen zu inkubieren, die adhärenten Bakterien zu ernten, die geernteten Zellen auf festen Medien zu plattieren und dann die resultierenden koloniebildenden Einheiten (CFU) zu zählen. Alternativ kann die bakterielle Adhärenz an Wirtszellen mit Immunfluoreszenzmikroskopie-basierten Ansätzen bewertet werden. Herkömmliche Strategien zur Umsetzung dieser Ansätze sind jedoch zeitaufwendig und ineffizient. Hier wird ein kürzlich entwickeltes automatisiertes fluoreszenzmikroskopiebasiertes Bildgebungsverfahren beschrieben. In Kombination mit Hochdurchsatz-Bildverarbeitung und statistischer Analyse ermöglicht die Methode eine schnelle Quantifizierung von Bakterien, die an Wirtszellen haften. Zwei Bakterienarten, Gram-negative Pseudomonas aeruginosa und Gram-positive Listeria monocytogenes und entsprechende Negativkontrollen, wurden getestet, um das Protokoll zu demonstrieren. Die Ergebnisse zeigen, dass dieser Ansatz adhärente Bakterien schnell und genau aufzählt und experimentelle Arbeitsbelastungen und Zeitpläne signifikant reduziert.

Einleitung

Bakterielle Adhäsion ist ein Prozess, bei dem sich Bakterien an andere Zellen oder Oberflächen anlagern. Die erfolgreiche Etablierung einer Infektion durch bakterielle Krankheitserreger erfordert die Adhäsion an Wirtszellen, die Besiedlung von Geweben und in einigen Fällen die Invasion von Wirtszellen^1,2,3. Neu auftretende Infektionskrankheiten stellen eine große Bedrohung für die öffentliche Gesundheit dar, wie die jüngste COVID-19-Pandemie^{4,5,6 zeigt.} Wichtig ist, dass neue oder aufkommende Krankheitserreger mit genombasierten Ansätzen möglicherweise nicht ohne weiteres erkannt werden können, insbesondere in Fällen, in denen der Erreger so konstruiert wurde, dass er sich dem Nachweis entzieht oder keine genomischen Signaturen enthält, die ihn als pathogen identifizieren. Daher kann die Identifizierung potenzieller Krankheitserreger mit Methoden, die Kennzeichen der Pathogenität, wie die bakterielle Adhärenz an Wirtszellen, direkt bewerten, eine entscheidende Rolle bei der Identifizierung von Krankheitserregern spielen.

Bakterielle Adhärenz an Wirtszellen wird seit Jahrzehnten verwendet, um Mechanismen der bakteriellen Pathogenese zu bewerten^1,7. Die mikroskopische Bildgebung^8,9 und die Aufzählung der bakteriellen koloniebildenden Einheit (KBE)^{10 , 11,12,13} durch Post-Infektionsplattierung sind zwei gut entwickelte Labormethoden zur Prüfung der mikrobiellen Adhärenz und/oder Infektion von Wirtszellen¹⁴. In Anbetracht der Mikrometerskala von Bakterienzellen erfordert die Zählung der adhärenten Bakterienzellen im Allgemeinen den Einsatz fortschrittlicher Mikroskopietechniken mit hoher Vergrößerung sowie hochauflösender Bildgebungsansätze, einschließlich Elektronenmikroskopie, Expansionsmikroskopie (ExM)^15,16und dreidimensionale Bildgebung¹⁷ . Alternativ kann die Zählung von Bakterien, die an Wirtszellen gebunden oder internalisiert sind, durchgeführt werden, indem die Verdünnungsreihe der geernteten Bakterien auf festes Agar plattiert und die resultierenden CFUs^10,12,13gezählt werden. Diese Methode ist mühsam und umfasst viele manuelle Schritte, was Schwierigkeiten bei der Etablierung eines standardisierten oder automatisierten Verfahrens mit sich bringt, das für Hochdurchsatzanalysen erforderlich ist^18,19. Daher würde die Entwicklung neuer Methoden zur Bewertung der Wirtszellbindung die derzeitigen Einschränkungen in diesem Bereich angehen.

Eine solche Methode wird hier beschrieben, die automatisierte Hochdurchsatzmikroskopie in Kombination mit Hochdurchsatz-Bildverarbeitung und statistischer Analyse verwendet. Um den Ansatz zu demonstrieren, wurden Experimente mit mehreren bakteriellen Krankheitserregern durchgeführt, darunter Pseudomonas aeruginosa, ein opportunistischer gramnegativer bakterieller Erreger von Menschen, Tieren und Pflanzen^14,20, der häufig die Atemwege von Patienten mit beeinträchtigten Wirtsabwehrfunktionen besiedelt. Dieser Ansatz optimierte den in früheren Studien^14,20beschriebenen mikroskopischen Bildgebungsprozess. Der bildgebende Nachweis wurde durch fluoreszenzmarkierte Wirtszellen und Bakterien vereinfacht, um die Nähe von ihnen schnell zu verfolgen, was den Mikroskopieaufwand drastisch reduzierte, um hochauflösende Bilder zur Unterscheidung von Bakterien zu erhalten. Darüber hinaus ersetzte die automatisierte statistische Analyse von Bildern in zählenden Wirtszellen und Bakterien das praktische Experiment der bakteriellen CFU-Beschichtung, um das Verhältnis der adhärenten Bakterienzahlen pro Wirtszelle abzuschätzen. Um die Kompatibilität dieser Methode zu bestätigen, wurden auch mehrere Bakterienstämme und Wirtszelltypen wie Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus und Klebsiella pneumoniae sowie menschliche Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) getestet, und die Ergebnisse unterstützen die Vielfalt und Wirksamkeit der Methode.

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Protokoll

1. A549 Zellkultur

1. Halten Sie die A549-Zelllinie in F-12K-Medium, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), und inkubieren Sie bei 37 °C, 5%_CO2.
2. Wechseln Sie das Medium alle 3-4 Tage und passieren Sie es mit 85% -95% Konfluenz.
3. Spülen Sie die Zellen kurz mit 1 x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4, sofern nicht anders angegeben) und behandeln Sie sie mit 1 ml 0,25% 0,53 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Lösung (Untertauchen der Zellschicht) für etwa 2 min bei 37 °C.
4. Fügen Sie zusätzliche 6 ml komplettes Wachstumsmedium (F-12K-Medium + 10% FBS) hinzu, um die Proteaseaktivität zu stoppen. Anschließend werden die Zellen in einem sterilen Polystyrol-T-75-Gewebekulturkolben mit einem Subkultivationsverhältnis von 1:3-1:8 plattiert. Das endgültige Kulturvolumen beträgt 12 ml.
5. Säen Sie etwa 1 x 10⁴ A549-Zellen (Zellkonzentration: ~ 1 x 10⁵ Zellen / ml) auf jede Vertiefung einer 96-Well-Platte einen Tag vor den Adhärenztests.

2. Bakterienwachstum und Färbung

1. Führen Sie alle bakteriellen Arbeiten in einer Biosicherheitswerkbank, Biosafety Level 2 Labor, durch.
2. Impfen Sie alle Bakterienkulturen, einschließlich P. aeruginosa (PAO1), Escherichia. coli, L. monocytogenes und B. subtilis usw., aus dem gefrorenen Glycerinbestand und züchten Sie sie in Trypto-Sojabrühe (TSB, 3 ml) in einem Schüttelbrutschrank bei 37 ° C über Nacht bei 250 U / min.
3. Verwenden Sie am nächsten Tag eine 1:100-Verdünnung der Übernachtkultur, um eine Subkultur zu impfen und sie in TSB (1 ml) für 3 h bis zur exponentiellen Phase zu züchten, messen Sie den OD bei 600 nm (OD_600),um dies zu bestätigen. Stellen Sie sicher, dass sich der OD₆₀₀ im Bereich von 0,4-0,6befindet.
4. Vor der Durchführung des Bakterien-Wirt-Adhärenz-Assays platten sie serielle Verdünnungen der Bakteriensuspension auf TSB-Agarplatten, inkubieren sie über Nacht bei 37 °C und stellen dann die bakteriellen CFUs aus der Anzahl der Kolonien her. Für P. aeruginosaentspricht ein OD₆₀₀ von 1,0 2 x 10⁸ lebensfähigen Bakterienzellen/ml, und für L. monocytogenesentspricht ein OD₆₀₀ von 1,0 9 x 10⁸ lebensfähigen Bakterienzellen/ml.
5. Ernten Sie die Bakterienkulturen in exponentieller Phase durch Zentrifugation bei 13.000 x g für 2 min bei Raumtemperatur (RT) und waschen Sie sie dann einmal mit 1x PBS (1 ml). Resuspendieren Sie die Bakterienpellets in 1 mL 1x PBS und bestimmen Sie die Konzentrationen durch Messung von OD₆₀₀ von Bakteriensuspensionen. Zum Beispiel stellt P. aeruginosa mit OD₆₀₀ von 0,5 eine Konzentration von 1 x 10⁸ Bakterienzellen/ ml dar.
6. Färben Sie die Bakteriensuspension entweder mit einem grünen oder einem roten Fluoreszenzfarbstoff bei RT für 30 minuten mit sanfter Rotation im Dunkeln. Dazu 2 μL des 500-fachen konzentrierten Brühfärfarbstoffs in 1 ml Bakteriensuspension geben, um den Farbstoff 1-fach zu verdünnen. Um den Färbefarbstoff abzuwaschen, zentrifugieren Sie die gefärbten Bakterien bei 13.000 x g für 2 min und resuspenieren Sie das Pellet dreimal in 1 ml 1x PBS.
   HINWEIS: Wenn fluoreszenz- (GFP-, RFP-, mCherry-, etc.) markierte Bakterien im Experiment verwendet werden, überspringen Sie diesen bakteriellen Färbeschritt. GFP-markierte P. aeruginosa und rot fluoreszierende Farbstoff-gefärbte L. monocytogenes wurden in diesem Protokoll verwendet.
7. Sammeln Sie die gefärbten Bakterienzellen oder GFP-markierten Bakterien durch Zentrifugation bei 13.000 x g für 2 min. Resuspend in frischem F-12K Medium (1 ml) und messen Sie die OD₆₀₀ jeder Kultur. Anschließend verdünnen Sie die Kulturen auf die gewünschten Konzentrationen basierend auf der Vielzahl der Infektionen (MOI) und der Wirtszellkonzentration. Das in diesem Experiment verwendete Endvolumen beträgt 500 μL.
   HINWEIS: Wenn beispielsweise die wirtszellkonzentration, die mit der Trypan Blue-Färbung gezählt wird, 1 x^{10 5} Zellen / ml beträgt, beträgt die gewünschte Konzentration von Bakterienzellen bei einem MOI von 100 1 x^{10 7} Zellen / ml. Die Konzentration von P. aeruginosa bei 0,5 OD₆₀₀ beträgt 1 x 10⁸/ml. Um die gewünschte Konzentration zu erhalten, verdünnen Sie die P. aeruginosa-Kultur 10-fach, fügen Sie 50 μL resuspendierte Kultur zu 450 μL frischem F-12K-Medium hinzu.

3. Bakterielle Adhärenz und Wirtszellfärbung

1. Waschen Sie zuerst die ausgesäten A549-Zellmonoschichten dreimal mit warmen 1x PBS. Für jede Wäsche 100 μL 1x PBS in jede Vertiefung geben, dreimal vorsichtig auf und ab pipettieren, 1x PBS entsorgen oder nach Zugabe 10 s warten und dann saugen, um 1x PBS zu entfernen. Um die Kinetik der Bakterienassoziation zu bestimmen, überlagern Sie die Zellen mit 100 μL der gewünschten Konzentrationen der Bakteriensuspension mit verschiedenen MOIs (0, 1, 10 und 100). Drehen Sie die Bakterien bei 200 x g für 10 min herunter und inkubieren Sie die infizierten A549-Zellen bei 37 °C, 5%_CO2 für weitere 1 h.
   HINWEIS: In diesem Experiment hatte jede Bedingung ein technisches Dreifaches.
2. Entfernen Sie die ungebundenen Bakterien, indem Sie die Monoschichten fünfmal mit warmen 1x PBS wie oben beschrieben waschen. Fügen Sie 100 μL 4% Formaldehyd (in 1x PBS) in jede Vertiefung der 96-Well-Platten hinzu, um die Zellen zu fixieren. Lassen Sie die Platten 15 min auf Eis liegen und waschen Sie dann die Fixierlösung dreimal mit 1x PBS ab.
3. Um die Kerne zu färben, fügen Sie 50 ng/ml 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) hinzu und inkubieren Sie sie für 10 min bei RT. Nach der Inkubation waschen Sie die Vertiefungen dreimal mit 1x PBS. Bedecken Sie die infizierten A549-Zellen mit 100 μL 1x PBS, um ein Austrocknen zu vermeiden. Für den nächsten Schritt verfahren oder die Platte bei 4 °C bis zu 2 Tage im Dunkeln lagern.

4. Automatisierte Fluoreszenzbildgebung, -verarbeitung und -analyse

1. Um die Datenintegrität zu erhalten, wählen Sie nach dem Zufallsprinzip und manuell fünf Positionen jeder Vertiefung aus, um die Bilder mit 20-facher Vergrößerung aufzunehmen. Erfassen Sie die fluoreszierenden Bilder von A549-Zellen und Bakterien unter DAPI- bzw. GFP-Kanälen. Verwenden Sie den PE-Cy5-Kanal für die Bakterien, die durch den roten Fluoreszenzfarbstoff gefärbt sind.
2. Um eine bessere Auflösung zu erzielen, verarbeiten Sie alle Bilder für die Hintergrundverflachung und Dekonvolution. Stellen Sie die Parameter auf 68 μm Durchmesser der Walzkugel für die Glättung ein und messen Sie automatisch die Punktspreizungsfunktion (PSF) der Bilddekonvolution basierend auf dem Objektiv.
3. Um alle qualifizierten Zellen und Bakterien zu zählen, messen Sie die Fluoreszenzintensität der Wirtszellen und Bakterien und legen Sie die schwächste Fluoreszenzintensität von Wirtszellen und Bakterien als Schwellenwerte für die Zellzahl fest. Zählen Sie alle Bakterien in der Nähe einer Wirtszelle innerhalb von 15 μm Entfernung als die adhärenten Bakterien, da der Durchmesser der A549-Zelle 10,59-14,93 μm^{21 beträgt.}
   HINWEIS: Eine Standardeinstellung im Bildgebungssystem zählt selektiv die Wirtszellen mit Durchmessern von 5-100 μm und Bakterien mit einer Größe von 0,2-5 μm (Breite und Länge).
4. Basierend auf den oben genannten manuellen Bildverarbeitungsergebnissen wenden Sie die Parameter Bildglättung, Dekonvolution, Objektgrößen, Abstand und Fluoreszenzintensitäten auf den Rest der automatisierten Bilder an. Berücksichtigen Sie nach der automatisierten Analyse kritische Messwerte wie die Gesamtzahl der Wirtszellen, die Zellgrößen und -formen, die Gesamtkeimzahl und die durchschnittliche Keimzahl pro Wirtszelle, die der wichtigste Indikator war, um die Bakterienadhärenz zu bestimmen.
5. Datenexport und statistische Auswertung
   1. Exportieren Sie die analysierten Ergebnisse aus allen Bildern in eine Tabelle (z. B. 'xlsx'-Format). Das automatisierte System generiert zwei Sätze von Ergebnissen: 1) die durchschnittliche Anzahl der adhärenten Bakterien aus jedem Bild; 2) die informativen Daten jeder einzelnen Wirtszelle, wie die adhärente Bakterienzahl auf einer einzelnen Zelle, die Wirtsgröße und die durchschnittliche Fluoreszenzintensität von Wirtszellen und Bakterien, aus dem entsprechenden Bild.
   2. Berechnen Sie die mittlere Anzahl und Standardabweichung der adhärenten Bakterienzahlen aus allen Bildern, um den bakteriellen Adhärenzgrad im Vergleich zu Negativkontrollen darzustellen. Bei dieser Methode dienten E. coli und B. subtilis als Negativkontrollen beim Testen der gramnegativen bzw. grampositiven bakteriellen Adhärenz. Führen Sie Zwei-Wege-ANOVAs durch, um für drei unabhängige Experimente auf signifikante Unterschiede zwischen Datenpunkten in der gesamten Behandlung zu testen.

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Ergebnisse

Zur Entwicklung des fluoreszenzbildgebenden bakteriellen Adhärenztests wurden P. aeruginosa Stamm PAO1 und sein Negativadhärenz-Gegenstück E. coli verwendet, um die Wirksamkeit des Protokolls zu testen, da die Adhärenz dieser Bakterien an A549-Zellen berichtet worden war^14,20,22. Zuerst wurden GFP-markierte P. aeruginosa (PAO1) und GFP-markierte E. coli mit einer humanen immortalisierten E...

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Diskussion

Das Protokoll beschreibt einen automatisierten Ansatz zur Aufzählung der bakteriellen Bindung an Wirtszellen. Der beschriebene Ansatz hat mehrere attraktive Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden. Erstens ermöglicht dieser Ansatz die genaue Quantifizierung der Anzahl der mikrobiellen Pathogenzellen, die an einzelne Wirtszellen gebunden sind. Wichtig ist, dass diese Quantifizierung ohne die Notwendigkeit einer mühsamen Bakterienernte, seriellen Verdünnung, Beschichtung auf festen Medien und Bestimmung der CFUs

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x PBS	VWR	45001-130
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher	62248	Host cell staining dye
96 well plate	Corning	3882	Half area well, flat clear bottom
A549 cells	ATCC	CCL 185	Mammalian cell line
BactoView Live Red	Biotium	40101	Bacteria staning dye
Centrifuge	Eppendorf	5810R
CFSE cell division tracker	BioLegend	423801
Cytation 5	BioTek	Cytation 5	Cell imaging multi-mode reader
E. coli			Laboratory stock
EGM bulletKit	Lonza	CC-3124	HUVEC cell culture medium
EHEC			NIST collections
F-12k medium	ATCC	302004	A549 cell culture medium
Fetal bovine serum	Corning	35-016-CV
HUVEC			Laboratory stock
L. monocytogenes			NIST collections
OD600 DiluPhotometer	IMPLEN
P. aeruginosa			Dr. Lori Burrows laboratory stock
P. aeruginosa ΔpilA			Dr. Lori Burrows laboratory stock
S. agalactiae			NIST collections
S. aureus	BEI	NR-46543
S. aureus ΔsaeR	BEI	NR-48164
S. rubidaea			NIST collections
Typical soy broth	Growcells	MBPE-4040