Автоматизированное, высокопроизводительное обнаружение бактериальной приверженности клеткам-хозяевам

Резюме

Обнаружение взаимодействий патогенов-хозяев и бактерий на основе фенотипической приверженности с использованием высокопроизводительной флуоресцентной маркировки изображений наряду с автоматизированными методами статистического анализа позволяет быстро оценить потенциальные бактериальные взаимодействия с клетками-хозяевами.

Аннотация

Идентификация новых бактериальных патогенов имеет решающее значение для здоровья и безопасности человека. Бактериальная приверженность клеткам-хозяевам является важным шагом при бактериальных инфекциях и представляет собой признак потенциальной угрозы. Поэтому изучение приверженности бактерий к клеткам-хозяевам может быть использовано в качестве компонента оценки бактериальной угрозы. Стандартный метод перечисления бактериальной приверженности клеткам-хозяевам заключается в совместной инкубации бактерий с клетками-хозяевами, сборе адгезивных бактерий, нанесении собранных клеток на твердые среды, а затем подсчете результирующих колониеобразующих единиц (КОЕ). Альтернативно, бактериальная приверженность к клеткам-хозяевам может быть оценена с использованием подходов, основанных на иммунофлуоресцентной микроскопии. Однако традиционные стратегии реализации этих подходов отнимают много времени и неэффективны. Здесь описан недавно разработанный автоматизированный метод визуализации на основе флуоресцентной микроскопии. В сочетании с высокопроизводительной обработкой изображений и статистическим анализом метод позволяет быстро количественно оценить бактерии, которые прилипают к клеткам-хозяевам. Два вида бактерий, Gram-отрицательный Pseudomonas aeruginosa и Gram-positive Listeria monocytogenes и соответствующие отрицательные контрольные группы, были протестированы для демонстрации протокола. Результаты показывают, что этот подход быстро и точно перечисляет адгезивные бактерии и значительно снижает экспериментальные нагрузки и сроки.

Введение

Бактериальная адгезия - это процесс, посредством которого бактерии прикрепляются к другим клеткам или поверхностям. Успешное установление инфекции бактериальными возбудителями требует адгезии к клеткам-хозяевам, колонизации тканей, а в некоторых случаях и инвазии клеток-хозяев^1,2,3. Возникающие инфекционные заболевания представляют собой серьезную угрозу общественному здравоохранению, о чем свидетельствует недавняя пандемия^{COVID-19 4,5,6.} Важно отметить, что новые или возникающие патогены не могут быть легко распознаны с использованием геномных подходов, особенно в тех случаях, когда патоген был спроектирован так, чтобы избежать обнаружения или не содержит геномных сигнатур, которые идентифицируют его как патогенный. Поэтому идентификация потенциальных патогенов с использованием методов, которые непосредственно оценивают признаки патогенности, такие как бактериальная приверженность клеткам-хозяевам, может играть решающую роль в идентификации патогенов.

Бактериальная адгезия к клеткам-хозяевам использовалась для оценки механизмов бактериального патогенеза на протяжении^{десятилетий 1,7.} Микроскопическая визуализация^8,9 и перечисление бактериальной колониеобразующей единицы (КОЕ)^10,11,12,13 путем постинфекционного покрытия являются двумя хорошо разработанными лабораторными методами тестирования микробной адгезии и/или инфицирования клеток-хозяев^14. Учитывая размер бактериальных клеток в микрометровом масштабе, перечисление адгезивных бактериальных клеток обычно требует использования передовых методов микроскопии с высоким увеличением, а также подходов к визуализации с высоким разрешением, включая электронную микроскопию, расширительную микроскопию (ExM)^15,16и трехмерную визуализацию¹⁷ . Альтернативно, перечисление бактерий, связанных или интернализованных внутри клеток-хозяев, может быть выполнено путем покрытия серии разбавления собранных бактерий на твердом агаре и подсчета результирующих КОЕ^10,12,13. Этот метод трудоемкий и включает в себя множество ручных шагов, что создает трудности в создании стандартизированной или автоматизированной процедуры, необходимой для высокопроизводительных анализов^18,19. Таким образом, разработка новых методов оценки прикрепления клеток-хозяев позволит устранить текущие ограничения в этой области.

Здесь описан один из таких методов, который использует автоматизированную высокопроизводительную микроскопию в сочетании с высокопроизводительной обработкой изображений и статистическим анализом. Чтобы продемонстрировать подход, были проведены эксперименты с несколькими бактериальными патогенами, в том числе Pseudomonas aeruginosa,оппортунистическим грамотрицательным бактериальным патогеном человека, животных и растений^14,20,который часто обнаруживается для колонизации дыхательных путей пациентов с нарушенными защитными функциями хозяина. Этот подход оптимизировал процесс микроскопической визуализации, описанный в предыдущих исследованиях^14,20. Обнаружение изображений было упрощено флуоресцентно-мечеными клетками-хозяевами и бактериями для быстрого отслеживания их близости, что значительно снизило рабочую нагрузку микроскопии для получения изображений с высоким разрешением для различения бактерий. Кроме того, автоматизированный статистический анализ изображений при подсчете клеток-хозяев и бактерий заменил ручной эксперимент по бактериальному покрытию КОЕ для оценки соотношения количества адгезивных бактерий на клетку-хозяина. Чтобы подтвердить совместимость этого метода, также были протестированы множественные бактериальные штаммы и типы клеток-хозяев, такие как Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus и Klebsiella pneumoniae, а также эндотелиальные клетки пупочных вен человека (HUVECs), и результаты подтверждают разнообразие и эффективность метода.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Культура клеток A549

1. Поддерживать клеточную линию A549 в среде F-12K, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и инкубировать при 37 °C, 5% CO_2.
2. Менять среду каждые 3-4 дня и проходить при 85%-95% слиянии.
3. Вкратце промыть клетки 1 х фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS, рН 7,4, если не указано иное) и обработать 1 мл 0,25% трипсина-0,53 мМ раствора этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (погружая клеточный слой) в течение примерно 2 мин при 37 °C.
4. Добавьте дополнительно 6 мл полной питательной среды (среда F-12K + 10% FBS), чтобы остановить активность протеазы. Затем обложите клетки стерильным полистиролом Т-75 тканевой культуральной колбой с соотношением субкультивации 1:3-1:8. Конечный объем культуры составляет 12 мл.
5. Посейте приблизительно 1 х^{10 4} ячейки A549 (концентрация клеток: ~1^{х 10 5} клеток /мл) на каждую лунку 96-луночной пластины за день до анализа адгезии.

2. Рост и окрашивание бактерий

1. Выполняйте всю бактериальную работу в кабинете биобезопасности, лаборатории уровня биобезопасности 2.
2. Инокулируют все бактериальные культуры, включая P. aeruginosa (PAO1), Escherichia. coli, L. monocytogenes и B. subtilis и т. д., из замороженного глицеринового бульона и выращивают их в триптическом соевом бульоне (TSB, 3 мл) в встряхивающем инкубаторе при 37 °C в течение ночи, поддерживаемом при 250 оборотах в минуту.
3. На следующий день используйте разбавление 1:100 ночной культуры для прививки субкультуры и выращивайте их в TSB (1 мл) в течение 3 ч до экспоненциальной фазы, измерьте OD при 600 нм (OD₆₀₀₎для подтверждения. Убедитесь, что OD₆₀₀ находится в диапазоне 0,4-0,6.
4. Перед выполнением анализа приверженности бактерий-хозяев пластинчатых последовательных разведений бактериальной суспензии на пластинах TSB-агара, инкубируют их в течение ночи при 37 °C, а затем устанавливают бактериальные КОЕ из числа колоний. Для P. aeruginosaOD₆₀₀ 1,0 соответствует 2 x 10⁸ жизнеспособным бактериальным клеткам/ мл, а для L. monocytogenesOD₆₀₀ 1,0 соответствует 9 x 10⁸ жизнеспособным бактериальным клеткам / мл.
5. Соберите бактериальные культуры в экспоненциальной фазе путем центрифугирования при 13 000 х г в течение 2 мин при комнатной температуре (RT), затем промыть их один раз, используя 1x PBS (1 мл). Повторно суспендируют бактериальные гранулы в 1 мл 1x PBS и определяют концентрации путем измерения OD₆₀₀ бактериальных суспензий. Например, P. aeruginosa с OD₆₀₀ 0,5 представляет собой концентрацию 1 х 10⁸ бактериальных клеток/мл.
6. Окрашивайте бактериальную суспензию зеленым или красным флуоресцентным красителем при RT в течение 30 мин с мягким вращением в темноте. Для этого добавьте 2 мкл 500-кратного концентрированного красителя для окрашивания в 1 мл бактериальной суспензии, чтобы разбавить краситель в 1 раз. Чтобы смыть окрашивающий краситель, центрифугируйте окрашенные бактерии на 13 000 х г в течение 2 минут и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл 1x PBS в течение трех раз.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если в эксперименте используются флуоресцентные (GFP-, RFP-, mCherry- и т.д.) помеченные бактерии, то пропустите этот этап бактериального окрашивания. В этом протоколе использовались GFP-метки P. aeruginosa и окрашенные красным флуоресцентным красителем L. monocytogenes.
7. Соберите окрашенные бактериальные клетки или помеченные GFP бактерии центрифугированием при 13 000 х г в течение 2 мин. Повторно суспендировать в свежей среде F-12K (1 мл) и измерить OD₆₀₀ каждой культуры. Впоследствии разбавляют культуры до желаемых концентраций на основе кратности инфекции (MOI) и концентрации клеток хозяина. Конечный объем, используемый в этом эксперименте, составляет 500 мкл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Например, если концентрация клеток-хозяев, подсчитанная с помощью окрашивания Trypan Blue, составляет 1^{х 10 5} клеток / мл, желаемая концентрация бактериальных клеток при MOI 100 будет составлять 1 х 10⁷ клеток / мл. Концентрация P. aeruginosa при 0,5 OD₆₀₀ составляет 1 х 10^8/мл. Для получения нужной концентрации разводят культуру P. aeruginosa в 10 раз, добавляют 50 мкл повторно суспендированной культуры к 450 мкл свежей среды F-12K.

3. Бактериальная адгезия и окрашивание клеток-хозяев

1. Сначала промыть посеянные монослои ячейки A549 три раза теплым 1x PBS. Для каждой промывки добавьте 100 мкл 1x PBS в каждую лунку, аккуратно пипетку вверх и вниз три раза, утилизируйте 1x PBS или подождите 10 с после добавления, а затем пылесосите, чтобы удалить 1x PBS. Чтобы определить кинетику бактериальной ассоциации, наложите на клетки 100 мкл желаемых концентраций бактериальной суспензии с различными MOI (0, 1, 10 и 100). Раскрутите бактерии при 200 х г в течение 10 мин и инкубируйте инфицированные клетки A549 при 37 °C, 5% CO₂ в течение дополнительного 1 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте каждое условие имело техническую тройку.
2. Удалите несвязанные бактерии, промыв монослои пять раз теплым 1x PBS, как описано выше. Добавьте 100 мкл 4% формальдегида (в 1x PBS) в каждую лунку 96-луночных пластин, чтобы зафиксировать ячейки. Дайте пластинам постоять на льду в течение 15 минут, а затем смойте раствор для фиксации, используя 1x PBS три раза.
3. Чтобы окрасить ядра, добавляют 50 нг/мл 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) и инкубируют его в течение 10 мин при RT. После инкубации промыть колодцы три раза, используя 1x PBS. Покройте инфицированные клетки A549 100 мкл 1x PBS, чтобы избежать высыхания. Обработайте для следующего этапа или храните пластину при 4 °C до 2 дней в темноте.

4. Автоматизированная флуоресцентная визуализация, обработка и анализ

1. Чтобы сохранить целостность данных, случайным образом и вручную выберите пять мест каждой скважины для захвата изображений с 20-кратным увеличением. Захват флуоресцентных изображений клеток и бактерий A549 по каналам DAPI и GFP соответственно. Используйте канал PE-Cy5 для бактерий, окрашенных красным флуоресцентным красителем.
2. Чтобы иметь лучшее разрешение, обработайте все изображения для сведения и деконволюции фона. Установите параметры диаметра 68 мкм катящегося шара для сглаживания и автоматического измерения функции точечного спреда (PSF) деконволюции изображения на основе объектива.
3. Чтобы подсчитать все квалифицированные клетки и бактерии, измерьте интенсивность флуоресценции клеток-хозяев и бактерий и установите самую слабую интенсивность флуоресценции клеток-хозяев и бактерий в качестве пороговых значений для количества клеток. Подсчитайте все бактерии, находящиеся рядом с клеткой-хозяином на расстоянии 15 мкм, поскольку адгезивные бактерии, поскольку диаметр ячейки A549 составляет 10,59-14,93 мкм^21.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка по умолчанию в системе визуализации выборочно подсчитывает клетки-хозяева диаметром от 5 до 100 мкм и бактерии размером от 0,2-5 мкм (ширина и длина).
4. Основываясь на вышеупомянутых результатах ручной обработки изображений, примените параметры сглаживания изображения, деконволюции, размеров объектов, расстояния и интенсивности флуоресценции к остальным автоматизированным изображениям. После автоматизированного анализа рассмотрите критические показания, такие как общее количество клеток-хозяев, размеры и формы клеток, общее количество бактерий и среднее количество бактерий на клетку-хозяина, что было наиболее важным показателем для определения бактериальной приверженности.
5. Экспорт данных и статистический анализ
   1. Экспортируйте проанализированные результаты со всех изображений в электронную таблицу (например, в формат 'xlsx'). Автоматизированная система генерирует два набора результатов: 1) среднее количество бактерий адгезивов с каждого изображения; 2) информативные данные каждой отдельной клетки-хозяина, такие как количество адгезивных бактерий на одной клетке, размер хозяина и средняя интенсивность флуоресценции клетки-хозяина и бактерий, из соответствующего изображения.
   2. Рассчитайте среднее число и стандартное отклонение количества адгезивных бактерий из всех изображений, чтобы представить уровень бактериальной приверженности по сравнению с отрицательными контрольными группами. В этом методе E. coli и B. subtilis служили отрицательным контролем при тестировании грамотрицательной и грамположительной бактериальной приверженности соответственно. Выполняйте двусторонние ANOVA для проверки значительных различий между точками данных в лечении для трех независимых экспериментов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Для разработки анализа бактериальной приверженности на основе флуоресцентной визуализации штамм P. aeruginosa PAO1 и его аналог с отрицательной адгезией E. coli были использованы для проверки эффективности протокола, поскольку сообщалось о прилипании этих бактерий к клеткам A549

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Протокол описывает автоматизированный подход к перечислению бактериальной привязанности к клеткам-хозяевам. Описанный подход имеет ряд привлекательных преимуществ перед обычными методами. Во-первых, этот подход позволяет точно количественно оценить количество клеток микробного па...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x PBS	VWR	45001-130
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher	62248	Host cell staining dye
96 well plate	Corning	3882	Half area well, flat clear bottom
A549 cells	ATCC	CCL 185	Mammalian cell line
BactoView Live Red	Biotium	40101	Bacteria staning dye
Centrifuge	Eppendorf	5810R
CFSE cell division tracker	BioLegend	423801
Cytation 5	BioTek	Cytation 5	Cell imaging multi-mode reader
E. coli			Laboratory stock
EGM bulletKit	Lonza	CC-3124	HUVEC cell culture medium
EHEC			NIST collections
F-12k medium	ATCC	302004	A549 cell culture medium
Fetal bovine serum	Corning	35-016-CV
HUVEC			Laboratory stock
L. monocytogenes			NIST collections
OD600 DiluPhotometer	IMPLEN
P. aeruginosa			Dr. Lori Burrows laboratory stock
P. aeruginosa ΔpilA			Dr. Lori Burrows laboratory stock
S. agalactiae			NIST collections
S. aureus	BEI	NR-46543
S. aureus ΔsaeR	BEI	NR-48164
S. rubidaea			NIST collections
Typical soy broth	Growcells	MBPE-4040