호스트 세포에 세균 준수의 자동화된, 높은 처리량 검출

요약

자동 통계 분석 방법과 함께 고처리량 형광 라벨링 이미징을 사용하여 페노티픽 준수를 기반으로 숙주 세균 병원체 상호 작용을 감지하면 숙주 세포와의 잠재적 세균 상호 작용을 신속하게 평가할 수 있습니다.

초록

신흥 세균 병원체의 식별은 인간의 건강과 보안에 매우 중요합니다. 숙주 세포에 세균적인 준수는 세균성 감염에 있는 필수적인 단계이고 잠재적인 위협의 특징을 구성합니다. 따라서, 숙주 세포에 박테리아의 준수를 검토하는 것은 세균 위협 평가의 구성 요소로 사용될 수있다. 숙주 세포에 세균 부착을 열거하는 표준 방법은 숙주 세포와 박테리아를 공동 배양하고, 부착 된 박테리아를 수확하고, 고체 매체에 수확 된 세포를 플레이트한 다음, 결과 식민지 형성 단위 (CFU)를 계산하는 것이다. 대안적으로, 숙주 세포에 대한 세균준수는 면역형광 현미경-현미경 기지를 둔 접근법을 사용하여 평가될 수 있다. 그러나 이러한 접근 방식을 구현하기 위한 기존의 전략은 시간이 많이 걸리고 비효율적입니다. 여기서, 최근에 개발된 자동화형 형광 현미경-현미경-이미징 방법이 설명된다. 높은 처리량 이미지 처리 및 통계 분석과 결합하면 호스트 셀을 부착하는 박테리아의 신속한 정량화를 가능하게 합니다. 2개의 세균성 종, 그람 음성 슈도모나스 아루기노사 및 그람 양성 리스테리아 단세포 유전자 및 상응하는 부정적인 대조군, 프로토콜을 입증하기 위하여 시험되었다. 결과는 이 접근방식이 부착된 박테리아를 신속하고 정확하게 예매하고 실험적인 워크로드와 적시성보다 현저히 감소시킨다는 것을 보여줍니다.

서문

세균성 접착은 박테리아가 다른 세포 또는 표면에 부착하는 과정입니다. 세균성 병원체에 의한 감염의 성공적인 확립은 세포를 숙주하는 유착, 조직의 식민지화, 그리고 어떤 경우에는 숙주 세포의 침입^1,2,3을필요로 한다. 최근 COVID-19전염병^4,5,6에서입증된 바와 같이 신흥 전염병은 주요 공중 보건 위협을 구성한다. 중요한 것은, 새로운 또는 신흥 병원체는 게놈 기지를 둔 접근을 사용하여 쉽게 분별되지 않을 수 있습니다, 병원체가 검출을 회피하기 위하여 설계되었거나 병원성으로 그것을 확인하는 게놈 서명을 포함하지 않는 경우에 특히. 따라서, 숙주 세포에 세균 준수 같이 병원성의 특징을 직접 평가하는 방법을 사용하여 잠재적인 병원체의 식별은 병원균 식별에 중요한 역할을 할 수 있습니다.

숙주 세포에 세균성 준수는 수십 년 동안 세균 성 병인의 메커니즘을 평가하기 위해 사용되어 왔다^1,7. 현미경 이미징^8,9 및 세균식민지 형성 부(CFU)^{10,11,12,13의} 열거형은 감염 후 도금에 의해 소주세포의 미생물 준수 및/또는감염을 테스트하기 위한 두 가지 잘 발달된 실험실 방법이다. 세균 세포의 마이크로미터 스케일 크기를 고려하여, 부착 세균 세포의 열거는 일반적으로 전자 현미경 검사법, 확장 현미경 검사법 (ExM)^15,16및 3 차원 이미징^17을 포함한 고해상도 이미징 접근법뿐만 아니라 고급 고배율 현미경 기술의 사용을 요구합니다. . 대안적으로, 숙주 세포 내에서 결합되거나 내면화된 박테리아의 열거량은 고체 천차에 수확된 박테리아의 희석 계열을 도금하고 결과 CFU^10,12,13을계산하여 수행될 수 있다. 이 방법은 힘들며 고처리량 분석에 필요한 표준화또는 자동화된 절차를 수립하는 데 어려움을 야기하는 많은 수동 단계를 포함한다^18,19. 따라서 호스트 셀 첨부 파일을 평가하기 위한 새로운 방법의 개발은 필드의 현재 제한을 해결합니다.

이러한 방법 중 하나는 높은 처리량 이미지 처리 및 통계 분석과 결합된 자동화된 높은 처리량 현미경 을 사용하는 것으로 여기에 설명되어 있습니다. 이러한 접근법을 입증하기 위해, 인간, 동물,^{식물14,20의}기회성 그람 음성 세균 병원균인 슈도모나스 아루기노사를포함한 여러 세균병원균을 실험하여 숙주 방어 기능이 손상된 환자의 호흡기를 식민지화하는 경우가 많았다. 이 접근법은 이전 연구에서 설명된 현미경 이미징 과정을^{최적화14,20.} 이미징 검출은 형광 표지호스트 세포와 박테리아에 의해 단순화되어 그(것)들의 근접성을 급속하게 추적하기 위하여, 극적으로 박테리아를 구별하기 위한 고해상도 심상을 얻기 위하여 현미경 워크로드를 감소시켰습니다. 또한, 숙주 세포 및 박테리아를 세는 이미지의 자동 통계 분석은 숙주 세포당 부착 세균 수의 비율을 추정하기 위해 세균 CFU 도금의 수동 실험을 대체하였다. 이 방법의 호환성을 확인하기 위해, 다중 세균성 균주 및 숙주 세포 모형은 또한 리스테리아 단세포 유전자, 황색포도상구균, 바실러스 뇌엽서, 및 Klebsiella 폐렴과 같은, 또한 인간 적인 혈관 내피 세포 (HUVECs) 및 그 결과를 지원합니다, 및 결과는 체계의 다양성과 효과성을 지원합니다.

프로토콜

1. A549 세포 배양

1. F-12K 배지에서 A549 세포주를 유지하여 10% 태아소 혈청(FBS)으로 보충하고 37°C, 5%_CO2에서배양한다.
2. 매 3-4 일마다 매체를 변경하고 85 %-95 %의 합류로 통과합니다.
3. 간략하게, 1 x 인산염 완충식식염(PBS, pH 7.4, 달리 명시되지 않는 한)으로 세포를 헹구고 1 ml의 0.25% 트립신-0.53 mM 에틸렌디아민트라아세산(EDTA) 용액(세포층을 37°C)에 약 2°C로 치료한다.
4. 프로테아제 활성을 중지하려면 완전한 성장 매체(F-12K 배지 + 10% FBS)를 추가로 6mL를 추가합니다. 이어서, 멸균 폴리스티렌 T-75 조직 배양에서 세포를 1:3-1:8의 하위 배양 비율로 플레이트한다. 문화의 마지막 볼륨은 12 mL입니다.
5. 종자 약 1 x 10⁴ A549 세포 (세포 농도: ~1 x 10⁵ 세포/mL) 준수 에세이 하루 전에 96 웰 플레이트의 각 웰에.

2. 세균 성장과 염색

1. 생물 안전 캐비닛, 생물 안전 수준 2 실험실에서 모든 세균 작업을 수행합니다.
2. 냉동 글리세롤 육수로부터 P. aeruginosa (PAO1),대장균, L. monocytogenes 및 B. subtilis 등을 포함한 모든 세균 배양을 접종하고 37 °C에서 흔들리는 인큐베이터에서 트립틱 간유 육수 (TSB, 3 mL)에서 성장합니다.
3. 다음 날, 야간 배양을 1:100 희석하여 서브컬쳐를 접종하고 TSB(1mL)에서 3시간 동안 기하급수적 단계로 성장시키고, 600nm(OD_600)에서OD를 측정하여 확인한다. OD_600이 0.4-0.6 범위에 있는지확인합니다.
4. 박테리아-숙주 준수 분석법을 수행하기 전에, TSB-agar 플레이트에 세균 현탁액의 플레이트 시리얼 희석, 37°C에서 하룻밤 을 배양한 다음 식민지 수로부터 세균 성 CfU를 확립한다. P. aeruginosa의경우, 1.0의 OD_600은 2 x 10⁸ 실행 가능한 세균 세포 /mL에 해당하며 L. monocytogenes의경우 1.0의 OD_600은 9 x 10⁸ 실행 가능한 세균 세포 /mL에 해당합니다.
5. 실온(RT)에서 2분 동안 13,000 x g에서 원심분리로 기하급수적 국상에서 세균 배양을 수확한 다음 1x PBS(1mL)를 사용하여 한 번 세척합니다. 1x PBS의 1mL에서 세균성 펠릿을 재중단하고 OD_600의 세균 현탁액을 측정하여 농도를 결정한다. 예를 들어, 0.5의 OD_600을 가진 P. aeruginosa는 1 x 10⁸ 세균세포/mL의 농도를 나타낸다.
6. 어두운 에서 부드러운 회전으로 30 분 동안 RT에서 녹색 또는 빨간색 형광 염료를 사용하여 세균 현탁액을 얼룩. 이를 위해, 500배 농축 육수 염색염2μL을 세균현탁액 1mL에 첨가하여 염료를 1배 희석시 한다. 염색염을 씻어내고, 스테인드 박테리아를 13,000 x g에서 2분 동안 원심분리하고 1x PBS의 1mL로 펠릿을 3회 재차 분리합니다.
   참고: 형광-(GFP-, RFP-, mCherry-등) 태그된 박테리아가 실험에 사용되는 경우, 다음이 세균 염색 단계를 건너 뜁니다. GFP-태그P. aeruginosa 및 적색 형광 염료 염색 L. 단세포 유전자는 이 프로토콜에 사용되었다.
7. 2 분 동안 13,000 x g에서 원심 분리에 의해 스테인드 세균 세포 또는 GFP 태그 박테리아를 수집합니다. 신선한 F-12K 배지(1mL)로 재연하고 각 배양의 OD_600을 측정한다. 후속감염(MOI) 및 숙주 세포 농도의 복합성에 기초하여 원하는 농도로 배양을 희석시한다. 이 실험에 사용된 최종 부피는 500 μL입니다.
   참고: 예를 들어, Trypan Blue 염색을 사용하여 계산된 숙주 세포 농도가 1 x 10⁵ 세포/mL인 경우, 100의 MOI에서 세균 세포의 원하는 농도는 1 x 10⁷ 세포/mL이 될 것이다. P. aeruginosa0.5 OD_600의 농도는 1 x 10⁸/mL이다. 원하는 농도를 얻으려면 P. aeruginosa 배양을 10배 희석하고, 신선한 F-12K 배지의 450 μL에 50 μL의 재중단 배양을 첨가한다.

3. 세균 성 준수 및 숙주 세포 염색

1. 먼저, 씨앗A549 셀 모노레이어를 따뜻한 1x PBS로 3회 세척합니다. 각 세척에 대해 1x PBS 100 μL을 각 웰에 넣고 부드럽게 파이펫을 세 번 내리고, 1x PBS를 폐기하거나 추가 후 10s를 기다린 다음 진공 청소기를 사용하여 1x PBS를 제거합니다. 세균성 협회의 운동학을 결정하기 위하여는, 다른 MOI를 가진 세균현탁액의 100 μL의 100 μL로 세포를 오버레이 (0, 1, 10 및 100). 박테리아를 200 x g에서 10분 동안 스핀다운하고 감염된 A549 세포를 37°C에서 배양하고, 5%_CO2를 추가로 1h로 배양한다.
   참고: 이 실험에서 각 조건은 기술적 삼중 항도가 있었습니다.
2. 위에서 설명한 바와 같이 따뜻한 1x PBS로 단층층을 5회 세척하여 언바운드 박테리아를 제거합니다. 세포를 고정하기 위해 96웰 플레이트의 각 웰에 4% 포름알데히드(1x PBS)의 100 μL을 추가합니다. 접시가 얼음 위에 15분 동안 앉아 서 1x PBS를 사용하여 고정 용액을 세 번 씻어 내십시오.
3. 핵을 더럽히려면 4′,6-diamidino-2-페닐린돌 (DAPI)의 50 ng /mL을 추가하고 RT에서 10 분 동안 배양하십시오. 인큐베이션 후 1x PBS를 사용하여 우물을 세 번 씻으시면 됩니다. 건조를 피하기 위해 감염된 A549 세포를 1x PBS의 100 μL로 덮습니다. 다음 단계에 대한 공정 또는 어둠 속에서 최대 2 일 동안 4 °C에서 플레이트를 저장합니다.

4. 자동 형광 이미징, 처리 및 분석

1. 데이터 무결성을 유지하기 위해 각 웰의 5개 위치를 임의로 수동으로 선택하여 20배 배율로 이미지를 캡처합니다. DAPI 및 GFP 채널하에서 A549 세포 및 박테리아의 형광 이미지를 각각 캡처합니다. 적색 형광염에 의해 염색된 박테리아에 PE-Cy5 채널을 사용하십시오.
2. 더 나은 해상도를 갖도록 모든 이미지를 백그라운드 병합 및 절충을 처리합니다. 파라미터를 압연 볼의 직경 68μm로 설정하여 스무딩을 하고 목표에 따라 이미지 분광의 포인트 스프레드 함수(PSF)를 자동 측정합니다.
3. 자격을 갖춘 모든 세포와 박테리아를 계산하려면 숙주 세포 및 박테리아의 형광 강도를 측정하고 숙주 세포 및 박테리아의 가장 약한 형광 강도를 세포 수의 임계값으로 설정합니다. A549 세포의 직경이 10.59-14.93 μm^21이기때문에 부착박테리아가 15 μm 거리 이내의 숙주 세포로 근접한 모든 박테리아를 계산한다.
   참고: 이미징 시스템의 기본 설정은 5-100 μm 및 크기(너비 및 길이)에 이르는 박테리아의 직경을 가진 숙주 세포를 선택적으로 계산합니다.
4. 위에서 언급한 수동 이미지 처리 결과를 기반으로 이미지 스무딩, 데콘볼루션, 오브젝트 크기, 거리 및 형광 강도의 매개 변수를 나머지 자동화된 이미지에 적용합니다. 자동화된 분석 후에는 총 숙주 세포 수, 세포 크기 및 모양, 총 세균 수 및 가장 중요한 지표였던 숙주 세포당 평균 세균 수와 같은 중요한 판독값을 고려하여 세균 성 준수를 결정하십시오.
5. 데이터 내보내기 및 통계 분석
   1. 모든 이미지에서 스프레드시트(예: 'xlsx' 형식)로 분석된 결과를 내보냅니다. 자동화된 시스템은 두 가지 결과 세트를 생성합니다: 1) 각 이미지의 평균 부착 세균 수; 2) 상기 각 단일 숙주 세포의 유익한 데이터, 예를 들어 단일 세포에 부착된 세균 수, 숙주 크기, 및 숙주 세포 및 박테리아의 평균 형광 강도, 상응하는 이미지로부터.
   2. 모든 이미지에서 부착된 세균 수의 평균 수 와 표준 편차를 계산하여 부정적인 대조군과 비교하여 세균 부착 수준을 나타냅니다. 이 방법에서 대장균과 B. 서브틸리스는 각각 그람 음성 및 그람 양성 세균 준수를 테스트하는 부정적인 대조군으로 사용되었습니다. 3개의 독립적인 실험을 위한 처리 에 걸쳐 데이터 점 사이 중요한 변이를 시험하기 위하여 양방향 ANOVA를 수행합니다.

결과

형광 영상 기반 세균 준수 분석서를 개발하기 위해, P. aeruginosa 균주 PAO1 및 그 음성 준수 대응 대장균은 A549 세포에 이러한 박테리아의 준수가^14,20,22에보고되었기 때문에 프로토콜 효과를 테스트하는 데 사용되었다. 먼저, GFP-표기표 P. aeruginosa (PAO1) 및 GFP 라벨 E. 대장균은 각각 다양한 MOI에서 인간 불?...

토론

프로토콜은 호스트 세포에 세균 부착을 예매하기 위한 자동화된 접근 법을 설명합니다. 설명된 접근 방식은 기존의 방법에 비해 몇 가지 매력적인 장점이 있습니다. 첫째, 이러한 접근법은 개별 숙주 세포에 부착된 미생물 병원균 세포의 수의 정확한 정량화를 가능하게 한다. 중요하게도, 이러한 정량화는 고성세균 수확, 직렬 희석, 고체 매체에 도금, CFUs^10,...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x PBS	VWR	45001-130
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher	62248	Host cell staining dye
96 well plate	Corning	3882	Half area well, flat clear bottom
A549 cells	ATCC	CCL 185	Mammalian cell line
BactoView Live Red	Biotium	40101	Bacteria staning dye
Centrifuge	Eppendorf	5810R
CFSE cell division tracker	BioLegend	423801
Cytation 5	BioTek	Cytation 5	Cell imaging multi-mode reader
E. coli			Laboratory stock
EGM bulletKit	Lonza	CC-3124	HUVEC cell culture medium
EHEC			NIST collections
F-12k medium	ATCC	302004	A549 cell culture medium
Fetal bovine serum	Corning	35-016-CV
HUVEC			Laboratory stock
L. monocytogenes			NIST collections
OD600 DiluPhotometer	IMPLEN
P. aeruginosa			Dr. Lori Burrows laboratory stock
P. aeruginosa ΔpilA			Dr. Lori Burrows laboratory stock
S. agalactiae			NIST collections
S. aureus	BEI	NR-46543
S. aureus ΔsaeR	BEI	NR-48164
S. rubidaea			NIST collections
Typical soy broth	Growcells	MBPE-4040