זיהוי אוטומטי בעל תפוקה גבוהה של דבקות חיידקית בתאים מארחים

Summary

זיהוי של אינטראקציות פתוגן מארח-חיידקי המבוסס על דבקות פנוטיפית באמצעות הדמיית תיוג פלואורסצנטית בעלת תפוקה גבוהה יחד עם שיטות ניתוח סטטיסטיות אוטומטיות מאפשר הערכה מהירה של אינטראקציות חיידקיות פוטנציאליות עם תאים מארחים.

Abstract

זיהוי של פתוגנים חיידקיים מתעוררים הוא קריטי לבריאות וביטחון האדם. דבקות חיידקית בתאים מארחים היא צעד חיוני בזיהומים חיידקיים ומהווה סימן היכר של איום פוטנציאלי. לכן, בחינת דבקותם של חיידקים לתאים מארחים יכולה לשמש כמרכיב של הערכת איום חיידקי. שיטה סטנדרטית לספירת דבקות חיידקית לתאים מארחים היא להדגיר יחד חיידקים עם תאים מארחים, לקצור את החיידקים החסידים, צלחת התאים שנקטפו על מדיה מוצקה, ולאחר מכן לספור את המושבה שנוצרת יחידות יוצרות (CFU). לחלופין, דבקות חיידקית בתאים מארחים ניתן להעריך באמצעות גישות מבוססות מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית. עם זאת, אסטרטגיות קונבנציונליות ליישום גישות אלה גוזלות זמן ולא יעילות. כאן, פותחה לאחרונה שיטת הדמיה אוטומטית המבוססת על מיקרוסקופיה. בשילוב עם עיבוד תמונה בעל תפוקה גבוהה וניתוח סטטיסטי, השיטה מאפשרת כימות מהיר של חיידקים הנצמדים לתאים מארחים. שני מינים חיידקיים, פסאודומונס ארוגינוזה גרם-חיובי מונוציטוגנים ופקדים שליליים תואמים, נבדקו כדי להדגים את הפרוטוקול. התוצאות מראות כי גישה זו מהווה נדבך במהירות ובדייקנות ומצטרפת באופן משמעותי את עומסי העבודה וצירי הזמן הניסיוניים.

Introduction

הידבקות חיידקית היא תהליך לפיו חיידקים מתחברים לתאים או למשטחים אחרים. הקמה מוצלחת של זיהום על ידי פתוגנים חיידקיים דורשת הידבקות לתאים מארחים, קולוניזציה של רקמות, ובמקרים מסוימים, פלישה לתאים מארחים^1,2,3. מחלות זיהומיות מתפתחות מהוות איומים גדולים על בריאות הציבור, כפי שמעידת מגפת COVID-19 האחרונה^4,5,6. חשוב לציין, פתוגנים חדשים או מתעוררים לא ניתן להבחין בקלות באמצעות גישות מבוססות גנומיות, במיוחד במקרים שבהם הפתוגן תוכנן להתחמק מזיהוי או אינו מכיל חתימות גנומיות המזהות אותו פתוגניים. לכן, זיהוי של פתוגנים פוטנציאליים באמצעות שיטות המעריכות ישירות סימני היכר של פתוגניות, כמו דבקות חיידקית בתאים מארחים, יכול לשחק תפקיד קריטי בזיהוי פתוגן.

דבקות חיידקית לתאים מארחים שימשה להערכת מנגנונים של פתוגנזה חיידקית במשך^{עשרות שנים 1,7}. הדמיה מיקרוסקופית^8,9 והספירה של יחידת יצירת מושבה חיידקית (CFU)^10,11,12,13 על ידי ציפוי לאחר זיהום הן שתי שיטות מעבדה מפותחות לבדיקת דבקות מיקרוביאלית ו / או זיהום של תאים מארחים¹⁴. בהתחשב בגודל קנה המידה של תאי החיידקים, חלוקת תאי החיידקים החסידים דורשת בדרך כלל שימוש בטכניקות מיקרוסקופיות מתקדמות בהגדלה גבוהה, כמו גם בגישות הדמיה ברזולוציה גבוהה, כולל מיקרוסקופיה אלקטרונית, מיקרוסקופיה הרחבה (ExM)^15,16והדמיה תלת ממדית¹⁷ . לחלופין, ספירת חיידקים הקשורים או מופנמים בתוך תאים מארחים יכולה להתבצע על ידי ציפוי סדרת הדילול של חיידקים שנקטפו על אגר מוצק וספירת CFUs^10,12,13. שיטה זו היא מייגע וכוללת צעדים ידניים רבים, אשר מציג קשיים בקביעת הליך סטנדרטי או אוטומטי הנדרש לניתוחים בעלי תפוקה גבוהה^18,19. לכן, פיתוח שיטות חדשות להערכת קובץ מצורף לתא מארח יטפל במגבלות הנוכחיות בשדה.

שיטה אחת כזו מתוארת כאן המשתמשת במיקרוסקופיה אוטומטית של תפוקה גבוהה, בשילוב עם עיבוד תמונה בתפוקה גבוהה וניתוח סטטיסטי. כדי להדגים את הגישה, בוצעו ניסויים עם מספר פתוגנים חיידקיים, כולל פסאודומונס ארוגינוזה, פתוגן חיידקי גרם שלילי אופורטוניסטי של בני אדם, בעלי חיים וצמחים^14,20, אשר נמצא לעתים קרובות ליישב את דרכי הנשימה של חולים עם תפקודי הגנה מארח לקוי. גישה זו מיטבה את תהליך ההדמיה המיקרוסקופית המתוארת במחקרים קודמים^14,20. זיהוי ההדמיה היה פשוט יותר על ידי תאים מארחים ובקטריה המסומנים על ידי פלואורסצנטיות כדי לעקוב במהירות אחר הקרבה שלהם, מה שהפחית באופן דרמטי את עומס העבודה של המיקרוסקופיה כדי לקבל תמונות ברזולוציה גבוהה עבור חיידקים ייחודיים. בנוסף, הניתוח הסטטיסטי האוטומטי של תמונות בספירת תאים מארחים וחיידקים החליף את הניסוי הידני של ציפוי CFU חיידקי כדי להעריך את היחס בין ספירת חיידקים חסידים לתא מארח. כדי לאשר את התאימות של שיטה זו, זנים חיידקיים מרובים וסוגי תאים מארחים נבדקו גם, כמו ליסטריה מונוציטוגנים, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, ו Klebsiella דלקת ריאות, כמו גם תאי אנדותל וריד הטבור האנושי (HUVECs), והתוצאות תומכות במגוון וביעילות של השיטה.

Protocol

1. תרבית תאים A549

1. לשמור על קו התא A549 ב F-12K בינוני בתוספת עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) ודגרה ב 37 °C (5°F), 5% CO₂.
2. לשנות את המדיום כל 3-4 ימים ועבר ב 85%-95% השפעה.
3. בקצרה, לשטוף את התאים עם 1 x תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS, pH 7.4, אלא אם צוין אחרת) ולטפל עם 1 מיליליטר של 0.25% טריפסין-0.53 mM חומצה אתילנדימינטראטראצטית (EDTA) פתרון (שקוע שכבת התא) במשך כ 2 דקות ב 37 °C .C.
4. הוסף 6 מ"ל נוספים של מדיום צמיחה מלא (F-12K בינוני + 10% FBS) כדי לעצור את פעילות הפרוטאז. לאחר מכן, צלחת התאים בפוליסטירן סטרילי T-75 רקמה תרבית בקבוקון ביחס תת-קטיביציה של 1:3-1:8. הכרך הסופי של התרבות הוא 12 מ"ל.
5. זרע כ 1 x 10⁴ תאי A549 (ריכוז תאים: ~ 1 x 10⁵ תאים / מ"ל) על כל באר של צלחת 96 באר יום לפני דבקות.

2. צמיחה והכתמה חיידקית

1. בצע את כל עבודת החיידקים בקבינט בטיחות ביולוגית, מעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2.
2. לחסן את כל תרביות החיידקים, כולל P. aeruginosa (PAO1), Escherichia. coli, L. monocytogenes, ו- B. subtilis, וכו ', ממלאי הגליצריל הקפוא ולגדל אותם במרק סויה טריפטי (TSB, 3 מ"ל) באינקובטור רועד ב 37 °C בלילה נשמר ב 250 סל"ד.
3. למחרת, להשתמש 1:100 דילול של תרבות הלילה כדי לחסן תת תרבות ולהגדיל אותם TSB (1 מ"ל) עבור 3 שעות לשלב המעריכי, למדוד את OD ב 600 ננומטר (OD₆₀₀₎כדי לאשר. ודא כי OD₆₀₀ הוא בטווח של 0.4-0.6.
4. לפני ביצוע בדיקת דבקות מארח חיידקים, צלחת דילול סדרתי של השעיית חיידקים על לוחות TSB-אגר, לדגור אותם לילה ב 37 °C (50 °F), ולאחר מכן להקים את CFUs חיידקי ממספר המושבות. עבור P. aeruginosa, OD₆₀₀ של 1.0 מתאים 2 x 10⁸ תאים חיידקיים קיימא / מ"ל, ועל L. monocytogenes, OD₆₀₀ של 1.0 מתאים 9 x 10⁸ תאים חיידקיים קיימא / מ"ל.
5. לקצור את תרביות החיידקים בשלב מעריכי על ידי צנטריפוגה ב 13,000 x גרם במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר (RT), ולאחר מכן לשטוף אותם פעם אחת באמצעות 1x PBS (1 מ"ל). Resuspend כדורי חיידקים ב 1 מ"ל של 1x PBS ולקבוע את הריכוזים על ידי מדידת OD₆₀₀ של השעיות חיידקים. לדוגמה, P. aeruginosa עם OD₆₀₀ של 0.5 מייצג ריכוז של 1 x 10⁸ תאים חיידקיים / מ"ל.
6. מכתימים את ההשעיה החיידקית באמצעות צבע פלואורסצנטי ירוק או אדום ב- RT למשך 30 דקות עם סיבוב עדין בחושך. בשביל זה, להוסיף 2 μL של 500-קיפול מרוכז מלאי כתמים צבע לתוך 1 מ"ל של השעיה חיידקית כדי לדלל את הצבע פי 1. כדי לשטוף את צבע הכתמים, צנטריפוגה החיידקים מוכתמים ב 13,000 x גרם במשך 2 דקות ו resuspend הכדור ב 1 מ"ל של 1x PBS במשך שלוש פעמים.
   הערה: אם פלואורסצנטיות - (GFP-, RFP-, mCherry-, וכו ') חיידקים מתויגים משמשים בניסוי, אז לדלג על שלב זה כתם חיידקי. GFP- מתויג P. aeruginosa ו צביעה פלואורסצנטית אדומה מוכתמת L. מונוציטוגנים שימשו בפרוטוקול זה.
7. לאסוף את תאי החיידקים המוכתמים או חיידקים מתויג GFP על ידי צנטריפוגה ב 13,000 x גרם במשך 2 דקות. יש תחודשו ב-F-12K בינוני טרי (1 מ"ל) ותמדדו את ה-OD₆₀₀ של כל תרבות. לאחר מכן לדלל את התרבויות לריכוזים הרצויים בהתבסס על ריבוי הזיהום (MOI) וריכוז התא המארח. הכרך הסופי המשמש בניסוי זה הוא 500 μL.
   הערה: לדוגמה, אם ריכוז התא המארח שנספר באמצעות מכתים כחול טריפאן הוא 1 x 10⁵ תאים / מ"ל, הריכוז הרצוי של תאים חיידקיים ב- MOI של 100 יהיה 1 x 10⁷ תאים / מ"ל. ריכוז P. aeruginosa ב 0.5 OD₆₀₀ הוא 1 x 10⁸/mL. כדי להשיג את הריכוז הרצוי, לדלל את P. aeruginosa תרבות פי 10, להוסיף 50 μL של תרבות resuspended כדי 450 μL של בינוני F-12K טרי.

3. דבקות חיידקית והכתמת תאים מארחים

1. ראשית, לשטוף את המונו-שכבתים של תאי A549 זרע שלוש פעמים עם PBS חם 1x. עבור כל שטיפה, להוסיף 100 μL של 1x PBS לכל באר, בעדינות pipette למעלה ולמטה שלוש פעמים, להיפטר 1x PBS או לחכות 10 s לאחר תוספת ולאחר מכן ואקום כדי להסיר 1x PBS. כדי לקבוע את הקינטיקה של אסוציאציה חיידקית, לכסות את התאים עם 100 μL של ריכוזים הרצויים של השעיה חיידקית עם MOIs שונים (0, 1, 10, ו 100). ספין את החיידקים ב 200 x g במשך 10 דקות ודגורת תאי A549 נגועים ב 37 °C (5 °F), 5% CO₂ עבור שעה אחת נוספת.
   הערה: בניסוי זה, לכל תנאי היה טריפליקט טכני.
2. הסר את החיידקים הלא מאוגדים על ידי שטיפת המונו-שכבתיות חמש פעמים עם PBS חם 1x כמתואר לעיל. הוסף 100 μL של 4% פורמלדהיד (ב 1x PBS) לתוך כל באר של לוחות 96-well כדי לתקן את התאים. תן את הצלחות לשבת על קרח במשך 15 דקות ולאחר מכן לשטוף את פתרון הקיבעון באמצעות 1x PBS שלוש פעמים.
3. כדי להכתים את הגרעינים, להוסיף 50 ננוגרם / מ"ל של 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) ודגרה זה במשך 10 דקות ב RT. לאחר הדגירה, לשטוף את הבארות שלוש פעמים באמצעות 1x PBS. לכסות את תאי A549 נגועים עם 100 μL של 1x PBS כדי למנוע ייבוש. מעבד לשלב הבא או לאחסן את הצלחת ב 4 °C (5 °F) עד 2 ימים בחושך.

4. הדמיה, עיבוד וניתוח פלואורסצנטיות אוטומטיים

1. כדי לשמור על שלמות הנתונים, בחר באופן אקראי ובאופן ידני חמישה מיקומים של כל באר כדי ללכוד את התמונות בהגדלה של פי 20. ללכוד את התמונות הפלואורסצנטיות של תאי A549 וחיידקים תחת ערוצי DAPI ו- GFP, בהתאמה. השתמש בערוץ PE-Cy5 עבור החיידקים מוכתמים על ידי צבע פלואורסצנטי אדום.
2. כדי לקבל רזולוציה טובה יותר, לעבד את כל התמונות עבור שיטוח רקע ופירוק. הגדר את הפרמטרים כקוטר 68 מיקרומטר של הכדור המתגלגל להחלקת ומדידת אוטומטית של פונקציית התפשטות הנקודות (PSF) של דה-וולבולציה של תמונה בהתבסס על המטרה.
3. כדי לספור את כל התאים והחיידקים המוסמכים, למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות של התאים המארחים והחיידקים ולהגדיר את עוצמת הפלואורסצנטיות החלשה ביותר של תאים וחיידקים מארחים כסף לספירת התאים. לספור את כל החיידקים קרוב לתא מארח בתוך 15 מיקרומטר מרחק כמו חיידקים דבק כמו הקוטר של תא A549 הוא 10.59-14.93 מיקרומטר²¹.
   הערה: הגדרת ברירת מחדל במערכת ההדמיה סופרת באופן סלקטיבי את התאים המארחים עם קטרים הנעים בין 5-100 מיקרומטר וחיידקים הנעים בין 0.2-5 מיקרומטר בגודל (רוחב ואורך).
4. בהתבסס על תוצאות עיבוד התמונה הידניות שהוזכרו לעיל, החל את הפרמטרים של החלקת תמונה, דה-אבון-וולטינג, גדלי אובייקטים, מרחק ועוצמות פלואורסצנטיות לשאר התמונות האוטומטיות. לאחר הניתוח האוטומטי, שקול קריאות קריטיות, כגון ספירת תאים מארחים כוללת, גדלי תאים וצורות, ספירת חיידקים כוללת, וספירת החיידקים הממוצעת לכל תא מארח, שהיה האינדיקטור החשוב ביותר, כדי לקבוע דבקות חיידקית.
5. ייצוא נתונים וניתוח סטטיסטי
   1. יצא את התוצאות שנותחו מכל התמונות לגיליון אלקטרוני (למשל, תבנית 'xlsx'). המערכת האוטומטית מייצרת שתי קבוצות של תוצאות: 1) ספירת החיידקים החסידית הממוצעת מכל תמונה; 2) הנתונים האינפורמטיביים של כל תא מארח יחיד, כגון ספירת חיידקים חסידים על תא בודד, גודל המארח ועוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת של התא המארח והחיידקים, מהתמונה המתאימה.
   2. חשב את המספר הממוצע ואת סטיית התקן של ספירת חיידקים חסידים מכל התמונות כדי לייצג את רמת הדבקות החיידקית בהשוואה לבקרות שליליות. בשיטה זו, E. coli ו- B. subtilis שימשו בקרות שליליות בבדיקת דבקות חיידקית גראם שלילית וסבתא חיובית, בהתאמה. בצע ANOVAs דו-כיווני כדי לבדוק שונות משמעותית בין נקודות נתונים על פני טיפול עבור שלושה ניסויים עצמאיים.

תוצאות

כדי לפתח את בדיקת דבקות חיידקית מבוססת הדמיית פלואורסצנטיות, זן P. aeruginosa PAO1 ומקבילו לדבקות שלילית E. coli שימשו לבדיקת יעילות הפרוטוקול, כמו הדבקות של חיידקים אלה לתאי A549 דווח^14,20,22. ראשית, GFP - שכותרתו P. aeruginosa (PAO1) ו- GFP שכותרתו E. ...

Discussion

הפרוטוקול מתאר גישה אוטומטית לספירת התקשרות חיידקית לתאים מארחים. לגישה המתוארת יש כמה יתרונות אטרקטיביים על פני שיטות קונבנציונליות. ראשית, גישה זו מאפשרת כימות מדויק של מספר תאי הפתוגן המיקרוביאליים המחוברים לתאים מארחים בודדים. חשוב לציין, כימות זה יכול להתבצע ללא צורך בקציר חיידקים ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x PBS	VWR	45001-130
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher	62248	Host cell staining dye
96 well plate	Corning	3882	Half area well, flat clear bottom
A549 cells	ATCC	CCL 185	Mammalian cell line
BactoView Live Red	Biotium	40101	Bacteria staning dye
Centrifuge	Eppendorf	5810R
CFSE cell division tracker	BioLegend	423801
Cytation 5	BioTek	Cytation 5	Cell imaging multi-mode reader
E. coli			Laboratory stock
EGM bulletKit	Lonza	CC-3124	HUVEC cell culture medium
EHEC			NIST collections
F-12k medium	ATCC	302004	A549 cell culture medium
Fetal bovine serum	Corning	35-016-CV
HUVEC			Laboratory stock
L. monocytogenes			NIST collections
OD600 DiluPhotometer	IMPLEN
P. aeruginosa			Dr. Lori Burrows laboratory stock
P. aeruginosa ΔpilA			Dr. Lori Burrows laboratory stock
S. agalactiae			NIST collections
S. aureus	BEI	NR-46543
S. aureus ΔsaeR	BEI	NR-48164
S. rubidaea			NIST collections
Typical soy broth	Growcells	MBPE-4040