Rilevamento automatizzato e ad alto rendimento dell'aderenza batterica alle cellule ospiti

Riepilogo

Il rilevamento delle interazioni patogeno ospite-batterico basate sull'aderenza fenotipica utilizzando l'imaging di etichettatura a fluorescenza ad alto rendimento insieme a metodi di analisi statistica automatizzati consente una rapida valutazione delle potenziali interazioni batteriche con le cellule ospiti.

Abstract

L'identificazione di patogeni batterici emergenti è fondamentale per la salute e la sicurezza umana. L'aderenza batterica alle cellule ospiti è un passo essenziale nelle infezioni batteriche e costituisce un segno distintivo di potenziale minaccia. Pertanto, l'esame dell'aderenza dei batteri alle cellule ospiti può essere utilizzato come componente della valutazione della minaccia batterica. Un metodo standard per enumerare l'aderenza batterica alle cellule ospiti è quello di co-incubare i batteri con le cellule ospiti, raccogliere i batteri aderenti, placcare le cellule raccolte su mezzi solidi e quindi contare le unità formanti colonie risultanti (CFU). In alternativa, l'aderenza batterica alle cellule ospiti può essere valutata utilizzando approcci basati sulla microscopia a immunofluorescenza. Tuttavia, le strategie convenzionali per l'attuazione di questi approcci richiedono molto tempo e sono inefficienti. Qui viene descritto un metodo di imaging automatizzato basato sulla microscopia a fluorescenza sviluppato di recente. Se combinato con l'elaborazione delle immagini ad alto rendimento e l'analisi statistica, il metodo consente una rapida quantificazione dei batteri che aderiscono alle cellule ospiti. Due specie batteriche, Gram-negative Pseudomonas aeruginosa e Gram-positive Listeria monocytogenes e corrispondenti controlli negativi, sono state testate per dimostrare il protocollo. I risultati mostrano che questo approccio enumera rapidamente e accuratamente i batteri aderenti e riduce significativamente i carichi di lavoro e le tempistiche sperimentali.

Introduzione

L'adesione batterica è un processo in cui i batteri si attaccano ad altre cellule o superfici. L'instaurazione di successo dell'infezione da parte di agenti patogeni batterici richiede l'adesione alle cellule ospiti, la colonizzazione dei tessuti e, in alcuni casi, l'invasione delle cellule ospiti^1,2,3. Le malattie infettive emergenti costituiscono gravi minacce per la salute pubblica, come evidenziato dalla recente pandemia di COVID-19^4,5,6. È importante sottolineare che i patogeni nuovi o emergenti potrebbero non essere facilmente individuati utilizzando approcci basati sulla genomica, specialmente nei casi in cui l'agente patogeno è stato progettato per eludere il rilevamento o non contiene firme genomiche che lo identificano come patogeno. Pertanto, l'identificazione di potenziali agenti patogeni utilizzando metodi che valutano direttamente i segni distintivi della patogenicità, come l'aderenza batterica alle cellule ospiti, può svolgere un ruolo critico nell'identificazione dei patogeni.

L'aderenza batterica alle cellule ospiti è stata utilizzata per valutare i meccanismi di patogenesi batterica per decenni^1,7. L'imaging microscopico^8,9 e l'enumerazione dell'unità di formazione di colonie batteriche (CFU)^10,11,12,13 mediante placcatura post-infezione sono due metodi di laboratorio ben sviluppati per testare l'aderenza microbica e/o l'infezione delle cellule ospiti^14. Considerando la dimensione della scala micrometrica delle cellule batteriche, l'enumerazione delle cellule batteriche aderenti richiede generalmente l'uso di tecniche avanzate di microscopia ad alto ingrandimento, nonché approcci di imaging ad alta risoluzione, tra cui microscopia elettronica, microscopia ad espansione (ExM)^15,16e imaging tridimensionale¹⁷ . In alternativa, l'enumerazione dei batteri legati o internalizzati all'interno delle cellule ospiti può essere eseguita placcando la serie di diluizione dei batteri raccolti su agar solido e contando le CFU risultanti^10,12,13. Questo metodo è laborioso e include molti passaggi manuali, che introduce difficoltà nello stabilire una procedura standardizzata o automatizzata richiesta per le analisi ad alto rendimento^18,19. Pertanto, lo sviluppo di nuovi metodi per valutare l'attaccamento delle cellule ospiti affronterebbe le attuali limitazioni nel campo.

Uno di questi metodi è descritto qui che utilizza la microscopia automatizzata ad alto throughput, combinata con l'elaborazione delle immagini ad alto throughput e l'analisi statistica. Per dimostrare l'approccio, sono stati eseguiti esperimenti con diversi patogeni batterici, tra cui Pseudomonas aeruginosa, un patogeno batterico Gram-negativo opportunistico di esseri umani, animali e piante^14,20, che si trova spesso a colonizzare il tratto respiratorio di pazienti con funzioni di difesa dell'ospite compromesse. Questo approccio ha ottimizzato il processo di imaging microscopico descritto in precedenti studi^14,20. Il rilevamento dell'imaging è stato semplificato da cellule ospiti e batteri marcati con fluorescenza per tracciare rapidamente la vicinanza di essi, il che ha ridotto drasticamente il carico di lavoro della microscopia per ottenere immagini ad alta risoluzione per distinguere i batteri. Inoltre, l'analisi statistica automatizzata delle immagini nel conteggio delle cellule ospiti e dei batteri ha sostituito l'esperimento pratico di placcatura CFU batterica per stimare il rapporto tra conta batterica aderente per cellula ospite. Per confermare la compatibilità di questo metodo, sono stati testati anche più ceppi batterici e tipi di cellule ospiti, come Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus , Bacillus cereus e Klebsiella pneumoniae, così come le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC), e i risultati supportano la diversità e l'efficacia del metodo.

Protocollo

1. Coltura cellulare A549

1. Mantenere la linea cellulare A549 in mezzo F-12K integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS) e incubare a 37 °C, 5% CO₂.
2. Cambiare il mezzo ogni 3-4 giorni e passare all'85% -95% di confluenza.
3. Brevemente, sciacquare le cellule con 1 x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, pH 7,4, se non diversamente indicato) e trattare con 1 ml di 0,25% di tripsina-0,53 mM soluzione di acido etilendiamminatetraacetico (EDTA) (immergendo lo strato cellulare) per circa 2 minuti a 37 °C.
4. Aggiungere ulteriori 6 mL di terreno di crescita completo (F-12K medio + 10% FBS) per interrompere l'attività della proteasi. Quindi, placcare le cellule in un pallone sterile di coltura tissutale di polistirene T-75 con un rapporto di sottocoltivazione di 1: 3-1: 8. Il volume finale della cultura è di 12 ml.
5. Seminare circa 1 x 10⁴ cellule A549 (concentrazione cellulare: ~1 x 10⁵ cellule/ml) su ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti il giorno prima dei test di aderenza.

2. Crescita batterica e colorazione

1. Eseguire tutti i lavori batterici in un armadio di biosicurezza, laboratorio di livello di biosicurezza 2.
2. Inoculare tutte le colture batteriche, tra cui P. aeruginosa (PAO1), Escherichia. coli, L. monocytogenes e B. subtilis, ecc., dal brodo di glicerolo congelato e coltivarle in brodo di soia tripttico (TSB, 3 ml) in un incubatore vibrante a 37 ° C durante la notte mantenuto a 250 giri / min.
3. Il giorno successivo, utilizzare una diluizione 1:100 della coltura notturna per inoculare una sottocoltura e coltivarli in TSB (1 mL) per 3 ore alla fase esponenziale, misurare l'OD a 600 nm (OD₆₀₀) per confermare. Assicurarsi che l'OD₆₀₀ sia compreso tra 0,4 e 0,6.
4. Prima di eseguire il test di aderenza batterio-ospite, le diluizioni seriali in piastre di sospensione batterica su piastre di TSB-agar, incubarle durante la notte a 37 ° C e quindi stabilire le CFU batteriche dal numero di colonie. Per P. aeruginosa, un OD₆₀₀ di 1,0 corrisponde a 2 x 10⁸ cellule batteriche vitali / mL, e per L. monocytogenes, un OD₆₀₀ di 1,0 corrisponde a 9 x 10⁸ cellule batteriche vitali / mL.
5. Raccogliere le colture batteriche in fase esponenziale mediante centrifugazione a 13.000 x g per 2 minuti a temperatura ambiente (RT), quindi lavarle una volta utilizzando 1x PBS (1 mL). Sospendere i pellet batterici in 1 mL di 1x PBS e determinare le concentrazioni misurando OD₆₀₀ di sospensioni batteriche. Ad esempio, P. aeruginosa con OD₆₀₀ di 0,5 rappresenta una concentrazione di 1 x 10⁸ cellule batteriche/ml.
6. Macchiare la sospensione batterica usando un colorante fluorescente verde o rosso a RT per 30 minuti con una rotazione delicata al buio. Per questo, aggiungere 2 μL del colorante colorante colorante concentrato 500 volte in 1 mL di sospensione batterica per diluire il colorante 1 volta. Per lavare via il colorante colorante, centrifugare i batteri colorati a 13.000 x g per 2 minuti e risospesare il pellet in 1 mL di 1x PBS per tre volte.
   NOTA: se nell'esperimento vengono utilizzati batteri con tag di fluorescenza (GFP, RFP, mCherry, ecc.), saltare questa fase di colorazione batterica. In questo protocollo sono stati utilizzati P. aeruginosa con tag GFP e L. monocytogenes colorante fluorescente rosso.
7. Raccogliere le cellule batteriche colorate o i batteri marcati con GFP mediante centrifugazione a 13.000 x g per 2 minuti. Risospesare in mezzo fresco F-12K (1 mL) e misurare l'OD₆₀₀ di ogni coltura. Successivamente diluire le colture alle concentrazioni desiderate in base alla molteplicità dell'infezione (MOI) e alla concentrazione della cellula ospite. Il volume finale utilizzato in questo esperimento è di 500 μL.
   NOTA: Ad esempio, se la concentrazione di cellule ospiti contata utilizzando la colorazione Trypan Blue è 1 x^{10 5} cellule / mL, la concentrazione desiderata di cellule batteriche a un MOI di 100 sarà 1 x 10⁷ cellule / mL. La concentrazione di P. aeruginosa a 0,5 OD₆₀₀ è 1 x 10⁸/mL. Per ottenere la concentrazione desiderata, diluire la coltura di P. aeruginosa 10 volte, aggiungere 50 μL di coltura risospesa a 450 μL di mezzo fresco F-12K.

3. Aderenza batterica e colorazione delle cellule ospiti

1. In primo luogo, lavare i monostrati di celle A549 seminati tre volte con PBS caldo 1x. Per ogni lavaggio, aggiungere 100 μL di 1x PBS a ciascun pozzetto, pipettare delicatamente su e giù tre volte, smaltire 1x PBS o attendere 10 s dopo l'aggiunta e quindi aspirare per rimuovere 1x PBS. Per determinare la cinetica dell'associazione batterica, sovrapporre le cellule con 100 μL di concentrazioni desiderate di sospensione batterica con diversi MOS (0, 1, 10 e 100). Abbassare i batteri a 200 x g per 10 minuti e incubare le cellule A549 infette a 37 °C, 5% CO₂ per ulteriori 1 ora.
   NOTA: In questo esperimento, ogni condizione aveva un tripliceto tecnico.
2. Rimuovere i batteri non legati lavando i monostrati cinque volte con PBS caldo 1x come descritto sopra. Aggiungere 100 μL di formaldeide al 4% (in 1x PBS) in ciascun pozzetto delle piastre a 96 pozzetti per fissare le cellule. Lasciare riposare le piastre sul ghiaccio per 15 minuti e quindi lavare via la soluzione di fissaggio usando 1x PBS tre volte.
3. Per macchiare i nuclei, aggiungere 50 ng/mL di 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e incubarlo per 10 minuti a RT. Dopo l'incubazione, lavare i pozzetti tre volte usando 1x PBS. Coprire le cellule A549 infette con 100 μL di 1x PBS per evitare l'essiccazione. Procedere per la fase successiva o conservare la piastra a 4 °C per un massimo di 2 giorni al buio.

4. Imaging, elaborazione e analisi automatizzati a fluorescenza

1. Per mantenere l'integrità dei dati, scegli in modo casuale e manuale cinque posizioni di ciascun pozzo per acquisire le immagini con ingrandimento 20x. Cattura le immagini fluorescenti di cellule e batteri A549 rispettivamente sotto i canali DAPI e GFP. Utilizzare il canale PE-Cy5 per i batteri macchiati dal colorante fluorescente rosso.
2. Per avere una risoluzione migliore, elabora tutte le immagini per l'appiattimento e la deconvoluzione dello sfondo. Impostare i parametri come 68 μm di diametro della sfera di rotolamento per levigare e misurare automaticamente la funzione di diffusione del punto (PSF) della deconvoluzione dell'immagine in base all'obiettivo.
3. Per contare tutte le cellule e i batteri qualificati, misurare l'intensità di fluorescenza delle cellule ospiti e dei batteri e impostare l'intensità di fluorescenza più debole delle cellule ospiti e dei batteri come soglie per il conteggio cellulare. Contare tutti i batteri vicini a una cellula ospite entro 15 μm di distanza come batteri aderenti come il diametro della cellula A549 è 10,59-14,93 μm²¹.
   NOTA: un'impostazione predefinita nel sistema di imaging conta selettivamente le cellule ospiti con diametri compresi tra 5-100 μm e batteri di dimensioni comprese tra 0,2 e 5 μm (larghezza e lunghezza).
4. In base ai risultati dell'elaborazione manuale delle immagini sopra menzionati, applicare i parametri di levigatura dell'immagine, deconvoluzione, dimensioni degli oggetti, distanza e intensità di fluorescenza al resto delle immagini automatizzate. Dopo l'analisi automatizzata, considerare le letture critiche, come la conta totale delle cellule ospiti, le dimensioni e le forme delle cellule, le conteggie batteriche totali e la conta batterica media per cellula ospite, che era l'indicatore più importante, per determinare l'aderenza batterica.
5. Esportazione dei dati e analisi statistica
   1. Esporta i risultati analizzati da tutte le immagini in un foglio di calcolo (ad esempio, formato "xlsx"). Il sistema automatizzato genera due serie di risultati: 1) la conta batterica media aderente da ciascuna immagine; 2) i dati informativi di ogni singola cellula ospite, come la conta batterica aderente su una singola cellula, la dimensione dell'ospite e l'intensità media di fluorescenza della cellula ospite e dei batteri, dall'immagine corrispondente.
   2. Calcola il numero medio e la deviazione standard delle conteggiche batteriche aderenti da tutte le immagini per rappresentare il livello di aderenza batterica rispetto ai controlli negativi. In questo metodo, E. coli e B. subtilis sono serviti come controlli negativi nel testare l'aderenza batterica Gram-negativa e Gram-positiva, rispettivamente. Eseguire ANOVA bidirezionali per testare variazioni significative tra i punti dati durante il trattamento per tre esperimenti indipendenti.

Risultati

Per sviluppare il test di aderenza batterica basato sull'imaging a fluorescenza, P. aeruginosa ceppo PAO1 e la sua controparte ad aderenza negativa E. coli sono stati utilizzati per testare l'efficacia del protocollo, poiché l'aderenza di questi batteri alle cellule A549 era stata riportata^14,20,22. In primo luogo, P. aeruginosa (PAO1) marcata GFP e E. coli marcata GFP sono state co-incubate ...

Discussione

Il protocollo descrive un approccio automatizzato per enumerare l'attaccamento batterico alle cellule ospiti. L'approccio descritto presenta diversi vantaggi interessanti rispetto ai metodi convenzionali. In primo luogo, questo approccio consente la quantificazione precisa del numero di cellule patogene microbiche che sono attaccate alle singole cellule ospiti. È importante sottolineare che questa quantificazione può essere eseguita senza la necessità di laboriose raccolte batteriche, diluizioni seriali, placcatura su...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x PBS	VWR	45001-130
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher	62248	Host cell staining dye
96 well plate	Corning	3882	Half area well, flat clear bottom
A549 cells	ATCC	CCL 185	Mammalian cell line
BactoView Live Red	Biotium	40101	Bacteria staning dye
Centrifuge	Eppendorf	5810R
CFSE cell division tracker	BioLegend	423801
Cytation 5	BioTek	Cytation 5	Cell imaging multi-mode reader
E. coli			Laboratory stock
EGM bulletKit	Lonza	CC-3124	HUVEC cell culture medium
EHEC			NIST collections
F-12k medium	ATCC	302004	A549 cell culture medium
Fetal bovine serum	Corning	35-016-CV
HUVEC			Laboratory stock
L. monocytogenes			NIST collections
OD600 DiluPhotometer	IMPLEN
P. aeruginosa			Dr. Lori Burrows laboratory stock
P. aeruginosa ΔpilA			Dr. Lori Burrows laboratory stock
S. agalactiae			NIST collections
S. aureus	BEI	NR-46543
S. aureus ΔsaeR	BEI	NR-48164
S. rubidaea			NIST collections
Typical soy broth	Growcells	MBPE-4040