Konak Hücrelere Bakteriyel Yapışmanın Otomatik, Yüksek Verimli Tespiti

Özet

Otomatik istatistiksel analiz yöntemleri ile birlikte yüksek verimli floresan etiketleme görüntüleme kullanılarak fenotipik yapışma esas alınarak konak-bakteriyel patojen etkileşimlerinin tespiti, konak hücrelerle potansiyel bakteriyel etkileşimlerin hızlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlar.

Özet

Ortaya çıkan bakteriyel patojenlerin tanımlanması insan sağlığı ve güvenliği için kritik öneme sahiptir. Konak hücrelere bakteriyel yapışmak bakteriyel enfeksiyonlarda önemli bir adımdır ve potansiyel tehdidin ayırt edici bir özelliğidir. Bu nedenle, bakterilerin konak hücrelere yapışmasını incelemek bakteri tehdidi değerlendirmesinin bir bileşeni olarak kullanılabilir. Konak hücrelere bakteri yapışmasını numaralandırmak için standart bir yöntem, bakterileri konak hücrelerle birlikte kuluçkaya yatırmak, yapışık bakterileri hasat etmek, hasat edilen hücreleri katı ortamda kaplamak ve ardından elde edilen koloni oluşturan birimleri (CFU) saymaktır. Alternatif olarak, konak hücrelere bakteriyel yapışma immünoforezans mikroskopi tabanlı yaklaşımlar kullanılarak değerlendirilebilir. Bununla birlikte, bu yaklaşımları uygulamak için geleneksel stratejiler zaman alıcı ve verimsizdir. Burada yakın zamanda geliştirilen otomatik floresan mikroskopi tabanlı görüntüleme yöntemi açıklanmıştır. Yüksek verimli görüntü işleme ve istatistiksel analiz ile birleştirildiğinde, yöntem konak hücrelere yapışan bakterilerin hızlı bir şekilde ölçülmesini sağlar. Protokolü göstermek için gram negatif Pseudomonas aeruginosa ve Gram-pozitif Listeria monocytogenes ve buna karşılık gelen negatif kontroller olmak üzere iki bakteri türü test edildi. Sonuçlar, bu yaklaşımın yapışan bakterileri hızlı ve doğru bir şekilde numaralandırmasını ve deneysel iş yüklerini ve zaman çizelgelerini önemli ölçüde azalttığını göstermektedir.

Giriş

Bakteriyel yapışma, bakterilerin diğer hücrelere veya yüzeylere bağlandığı bir işlemdir. Bakteriyel patojenler tarafından enfeksiyonun başarılı bir şekilde kurulması, konak hücrelere yapışıklık, dokuların kolonizasyonu ve bazı durumlarda konak hücrelerin istilası^1,2^,3gerektirir. Ortaya çıkan bulaşıcı hastalıklar, son COVID-19 pandemisi⁴,^5,6tarafından kanıtlanan büyük halk sağlığı tehditleri oluşturmaktadır. Daha da önemlisi, yeni veya gelişmekte olan patojenler genomik tabanlı yaklaşımlar kullanılarak kolayca ayırt edilemeyebilir, özellikle patojenin tespit edilmekten kaçınmak için tasarlandığı veya patojenik olarak tanımlayan genomik imzalar içermediği durumlarda. Bu nedenle, konak hücrelere bakteriyel yapışım gibi patojenliğin ayırt edici özelliklerini doğrudan değerlendiren yöntemler kullanılarak potansiyel patojenlerin tanımlanması patojen tanımlamasında kritik bir rol oynayabilir.

Konak hücrelere bakteriyel yapışma, onlarca yıldır bakteriyel patogenez mekanizmalarını değerlendirmek için kullanılmıştır^1,7. Mikroskobik görüntüleme^8,9 ve bakteriyel koloni oluşturan ünitenin (CFU) 10 ,^11,12,13 enfeksiyon sonrası kaplama ile numaralandırılması, konak hücrelerin mikrobiyal yapışma ve/veya enfeksiyonunu test etmek için iyi geliştirilmiş iki laboratuvar yöntemidir^14. Bakteri hücrelerinin mikrometre ölçek büyüklüğü göz önüne alındığında, yapışık bakteri hücrelerinin numaralandırılması genellikle gelişmiş yüksek büyütme mikroskopi tekniklerinin yanı sıra elektron mikroskopisi, genleşme mikroskopisi (ExM)^15,16ve üç boyutlu görüntüleme dahil olmak üzere yüksek çözünürlüklü görüntüleme yaklaşımlarının kullanılmasını gerektirir¹⁷ . Alternatif olarak, konak hücrelere bağlı veya içselleştirilmiş bakterilerin numaralandırması, hasat edilen bakterilerin seyreltme serisini katı agar üzerine kaplayarak ve sonuçta elde edilen CFO'lar^{10 , 12,13}sayarak gerçekleştirilebilir. Bu yöntem zahmetlidir ve yüksek verimli analizler için gerekli standartlaştırılmış veya otomatik bir prosedür oluşturmada zorluklar getiren birçok manuel adım içerir^18,19. Bu nedenle, konak hücre ekini değerlendirmek için yeni yöntemlerin geliştirilmesi alandaki geçerli sınırlamaları giderir.

Burada, yüksek verimli görüntü işleme ve istatistiksel analiz ile birlikte otomatik yüksek verimli mikroskopi kullanan bu tür bir yöntem açıklanmıştır. Yaklaşımı göstermek için, pseudomonas aeruginosada dahil olmak üzere çeşitli bakteriyel patojenlerle deneyler yapıldı, insanların, hayvanların ve bitkilerin fırsatçı bir Gram-negatif bakteriyel patojeni^14,20, sık sık konak savunma fonksiyonları bozulmuş hastaların solunum yollarını kolonileştirdiği tespit edildi. Bu yaklaşım, önceki çalışmalarda açıklanan mikroskobik görüntüleme sürecini optimize etti^14,20. Görüntüleme algılaması, floresan etiketli konak hücreler ve bakteriler tarafından, bunların yakınlığını hızla izlemek için basitleştirildi ve bu da bakterileri ayırt etmek için yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etmek için mikroskopi iş yükünü önemli ölçüde azalttı. Buna ek olarak, konak hücre ve bakterilerin sayımındaki görüntülerin otomatik istatistiksel analizi, konak hücre başına yapışık bakteri sayısının oranını tahmin etmek için bakteriyel CFU kaplamanın elden deneyinin yerini almıştır. Bu yöntemin uyumluluğunu doğrulamak için Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus ve Klebsiella pneumoniae gibi birden fazla bakteri türü ve konak hücre tipinin yanı sıra insan göbek ve damar endotel hücreleri (HUVEC) de test edilmiştir ve sonuçlar yöntemin çeşitliliğini ve etkinliğini desteklememektedir.

Protokol

1. A549 hücre kültürü

1. %10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş F-12K ortamında A549 hücre hattını koruyun ve 37 °C, %5 CO_2'dekuluçkaya yatırın.
2. Ortamı her 3-4 günde bir değiştirin ve % 85-% 95 izdiahta geçiş.
3. Kısaca, hücreleri 1 x fosfat tamponlu salin (AKSI belirtilmedikçe pS, pH 7.4) ile durulayın ve 1 ml%0.25 Trypsin-0.53 mM etileniaminetetraasetik asit (EDTA) çözeltisi (hücre tabakasını batırarak) ile yaklaşık 2 dakika boyunca 37 °C'de tedavi edin.
4. Proteaz aktivitesini durdurmak için ek 6 mL tam büyüme ortamı (F-12K orta + % 10 FBS) ekleyin. Daha sonra, steril bir polistiren T-75 doku kültürü şişeskindeki hücreleri 1:3-1:8 alt kültür oranında plakala. Kültürün son hacmi 12 mL'dir.
5. Yapışma testlerinden bir gün önce 96 kuyu plakasının her kuyusuna yaklaşık 1 x 10^{4 A549} hücresi (hücre konsantrasyonu: ~1 x 10 5 hücre/mL) tohumlayın.

2. Bakteriyel büyüme ve lekeleme

1. Tüm bakteriyel çalışmaları biyogüvenlik kabini, Biyogüvenlik Seviye 2 laboratuvarında gerçekleştirin.
2. P. aeruginosa (PAO1), Escherichia. coli, L. monocytogenes ve B. subtilis, vb. dahil olmak üzere tüm bakteri kültürlerini donmuş gliserol stoğundan aşılayın ve 37 °C'de bir gecede 250 r'de tutulan sarsıcı bir inkübatörde Tryptic Soy Broth'ta (TSB, 3 mL) yetiştirin.
3. Ertesi gün, bir alt kültürü aşılamak için geceleme kültürünün 1:100 seyreltilmesini kullanın ve üstel faza 3 saat boyunca TSB'de (1 mL) yetiştirin, onaylamak için OD'yi 600 nm (OD₆₀₀₎olarak ölçün. OD_600'ün 0,4-0,6 aralığında olduğundan eminolun.
4. Bakteri-konak yapışma tahlilini gerçekleştirmeden önce, bakteriyel süspansiyonun plaka seri seyreltmeleri TSB-agar plakalarına, 37 ° C'de bir gecede kuluçkaya yatırın ve daha sonra bakteri cfo'larını koloni sayısından kurun. P. aeruginosaiçin,_1.0'ın OD 600'ü 2 x 10⁸ uygulanabilir bakteri hücrelerine /mL'ye ve L. monocytogenesiçin 1.0'ın_600'ü 9 x 10 8 uygulanabilir bakteri hücrelerine /mL'ye karşılık gelir.
5. Bakteri kültürlerini oda sıcaklığında (RT) 2 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüjleme ile üstel fazda hasat edin, ardından 1x PBS (1 mL) kullanarak bir kez yıkayın. Bakteri peletlerini 1 mL 1x PBS'de yeniden dirildi ve OD₆₀₀ bakteri süspansiyonlarını ölçerek konsantrasyonları belirledi. Örneğin,_{0,5'in OD 600'üne} sahip P. aeruginosa, 1 x 10⁸ bakteri hücresi /mL konsantrasyonu temsil eder.
6. Karanlıkta yumuşak dönüş ile 30 dakika boyunca RT'de yeşil veya kırmızı floresan boya kullanarak bakteri süspansiyonu lekelenin. Bunun için, boyayı 1 kat seyreltmek için 1 mL bakteriyel süspansiyona 500 kat konsantre stok boyama boyasının 2 μL'sini ekleyin. Boyama boyasını yıkamak için, lekeli bakterileri 2 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüj edin ve peleti 1 mL 1x PBS'de üç kez yeniden ıslatın.
   NOT: Deneyde floresan - (GFP-, RFP-, mCherry- vb.) etiketli bakteriler kullanılıyorsa, bu bakteriyel boyama adımını atlayın. Bu protokolde GFP etiketli P. aeruginosa ve kırmızı floresan boya lekeli L. monocytogenes kullanılmıştır.
7. Lekeli bakteri hücrelerini veya GFP etiketli bakterileri 2 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüjleme ile toplayın. Taze F-12K ortamında (1 mL) yeniden dürt ve her kültürün_{OD 600'lerini} ölçün. Daha sonra, enfeksiyonun çokluğuna (MOI) ve konak hücre konsantrasyonuna bağlı olarak kültürleri istenen konsantrasyonlara seyreltin. Bu deneyde kullanılan son hacim 500 μL'dir.
   NOT: Örneğin, Trypan Blue boyama kullanılarak sayılan konak hücre konsantrasyonu 1 x 10⁵ hücre/mL ise, 100 MOI'de istenen bakteri hücresi konsantrasyonu 1 x 10⁷ hücre/mL olacaktır. 0.5 OD 600'de P. aeruginosa konsantrasyonu₁ x 10 8 /mL'dir. İstenilen konsantrasyonu elde etmek için, P. aeruginosa kültürünü 10 kat seyreltin, 450 μL taze F-12K ortama 50 μL resüspended kültür ekleyin.

3. Bakteriyel yapışma ve konak hücre boyama

1. İlk olarak, tohumlu A549 hücre monolayerlerini ılık 1x PBS ile üç kez yıkayın. Her yıkama için, her kuyuya 100 μL 1x PBS ekleyin, üç kez hafifçe pipet yukarı ve aşağı, 1x PBS atın veya eklemeden sonra 10 s bekleyin ve ardından 1x PBS'yi çıkarmak için vakumlayın. Bakteri ilişkisinin kinetiğini belirlemek için, hücreleri farklı MTI'lerle (0, 1, 10 ve 100) istenen 100 μL bakteri süspansiyon konsantrasyonuna sahip kapla. Bakterileri 200 x g'da 10 dakika döndürün ve enfekte olmuş A549 hücrelerini 37 °C'de kuluçkaya yatırın, 1 saat daha% 5 CO_2.
   NOT: Bu deneyde, her durumun teknik bir üçeye özeli vardı.
2. Yukarıda açıklandığı gibi sıcak 1x PBS ile monolayerleri beş kez yıkayarak ilişkisiz bakterileri temizleyin. Hücreleri sabitlemek için 96 kuyu plakalarının her kuyusuna 100 μL% 4 formaldehit (1x PBS olarak) ekleyin. Plakaları 15 dakika boyunca buzun üzerine oturtun ve ardından 1x PBS kullanarak sabitleme çözeltisini üç kez yıkayın.
3. Çekirdeği lekelemek için, 4′, 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) 50 ng / mL ekleyin ve RT'de 10 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, kuyuları 1x PBS kullanarak üç kez yıkayın. Kurumasını önlemek için enfekte olmuş A549 hücrelerini 100 μL 1x PBS ile örtün. Bir sonraki adım için işlem yapın veya plakayı karanlıkta 2 güne kadar 4 °C'de saklayın.

4. Otomatik floresan görüntüleme, işleme ve analiz

1. Veri bütünlüğünü korumak için, görüntüleri 20x büyütmede yakalamak için her kuyunun beş konumunu rastgele ve manuel olarak seçin. Sırasıyla DAPI ve GFP kanalları altında A549 hücrelerinin ve bakterilerinin floresan görüntülerini yakalayın. Kırmızı floresan boya ile lekelenmiş bakteriler için PE-Cy5 kanalını kullanın.
2. Daha iyi bir çözünürlüğe sahip olmak için, arka plan düzleştirme ve dekonvolüzyon için tüm görüntüleri işleyin. Görüntü dekonvolüyonunun nokta yayılma işlevini (PSF) hedefe göre yumuşatmak ve otomatik olarak ölçmek için parametreleri yuvarlanan topun 68 μm çapı olarak ayarlayın.
3. Tüm nitelikli hücreleri ve bakterileri saymak için konak hücrelerin ve bakterilerin floresan yoğunluğunu ölçün ve konak hücre ve bakterilerin en zayıf floresan yoğunluğunu hücre sayısı eşikleri olarak ayarlayın. A549 hücresinin çapı 10,59-14,93 μm²¹olduğu için yapışan bakteri olarak 15 μm mesafedeki bir konak hücreye yakın tüm bakterileri sayın.
   NOT: Görüntüleme sistemindeki varsayılan bir ayar, çapları 5-100 μm arasında değişen konak hücreleri ve boyut (genişlik ve uzunluk) olarak 0,2-5 μm arasında değişen bakterileri seçici olarak sayar.
4. Yukarıda belirtilen manuel görüntü işleme sonuçlarına bağlı olarak, otomatik görüntülerin geri kalanına görüntü yumuşatma, dekonvolüsyon, nesne boyutları, mesafe ve floresan yoğunluklarının parametrelerini uygulayın. Otomatik analizden sonra, bakteriyel yapışmayı belirlemek için toplam konak hücre sayıları, hücre boyutları ve şekilleri, toplam bakteri sayısı ve en önemli gösterge olan konak hücre başına ortalama bakteri sayısı gibi kritik okumaları göz önünde bulundurun.
5. Veri ihracatı ve istatistiksel analiz
   1. Analiz edilen sonuçları tüm görüntülerden bir elektronik tabloya (ör. 'xlsx' biçimi) dışa aktarın. Otomatik sistem iki sonuç kümesi oluşturur: 1) her görüntüden ortalama yapışan bakteri sayısı; 2) tek bir hücreye yapışan bakteri sayısı, konak boyutu ve konak hücre ve bakterilerin ortalama floresan yoğunluğu gibi her bir konak hücrenin bilgilendirici verileri, ilgili görüntüden.
   2. Negatif kontrollere kıyasla bakteriyel yapışma seviyesini temsil etmek için tüm görüntülerden yapışık bakteri sayısının ortalama sayısını ve standart sapmasını hesaplayın. Bu yöntemde E. coli ve B. subtilis sırasıyla Gram-negatif ve Gram-pozitif bakteriyel yapışma testlerinde negatif kontrol görevi gördü. Üç bağımsız deney için tedavi genelinde veri noktaları arasında önemli bir varyasyon sınamak için iki yönlü ANOVA'lar gerçekleştirin.

Sonuçlar

Floresan görüntüleme bazlı bakteriyel yapışma testini geliştirmek için, P. aeruginosa suşu PAO1 ve negatif yapışma muadili E. coli, protokol etkinliğini test etmek için kullanıldı, çünkü bu bakterilerin A549 hücrelerine yapışma^14,20,22bildirilmiştir. İlk olarak, GFP etiketli P. aeruginosa (PAO1) ve GFP etiketli E. coli, sırasıyla çeşitli MOI'lerde insan ölümsüzle?...

Tartışmalar

Protokol, konak hücrelere bakteriyel bağlanmayı numaralandırmak için otomatik bir yaklaşım açıklar. Açıklanan yaklaşımın geleneksel yöntemlere göre birkaç çekici avantajı vardır. İlk olarak, bu yaklaşım, tek tek konak hücrelere bağlı mikrobiyal patojen hücrelerinin sayısının kesin olarak ölçülmesini sağlar. Daha da önemlisi, bu niceleme zahmetli bakteriyel hasat, seri seyreltmeler, katı ortamlarda kaplama ve CFO^{10, 11,12}

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x PBS	VWR	45001-130
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher	62248	Host cell staining dye
96 well plate	Corning	3882	Half area well, flat clear bottom
A549 cells	ATCC	CCL 185	Mammalian cell line
BactoView Live Red	Biotium	40101	Bacteria staning dye
Centrifuge	Eppendorf	5810R
CFSE cell division tracker	BioLegend	423801
Cytation 5	BioTek	Cytation 5	Cell imaging multi-mode reader
E. coli			Laboratory stock
EGM bulletKit	Lonza	CC-3124	HUVEC cell culture medium
EHEC			NIST collections
F-12k medium	ATCC	302004	A549 cell culture medium
Fetal bovine serum	Corning	35-016-CV
HUVEC			Laboratory stock
L. monocytogenes			NIST collections
OD600 DiluPhotometer	IMPLEN
P. aeruginosa			Dr. Lori Burrows laboratory stock
P. aeruginosa ΔpilA			Dr. Lori Burrows laboratory stock
S. agalactiae			NIST collections
S. aureus	BEI	NR-46543
S. aureus ΔsaeR	BEI	NR-48164
S. rubidaea			NIST collections
Typical soy broth	Growcells	MBPE-4040