体内 通过脾T细胞流式细胞术筛选肿瘤来源的细胞外囊泡的免疫原性

摘要

本手稿描述了如何使用流式细胞术评估肿瘤细胞来源的细胞外囊泡（EV）的 体内 免疫原性。来自接受治疗诱导的免疫原性细胞死亡的肿瘤的EV似乎与肿瘤免疫监测特别相关。该协议是奥沙利铂诱导的免疫刺激性肿瘤EV评估的例证，但可以适应各种环境。

摘要

由化疗或照射引起的肿瘤免疫原性细胞死亡可以通过释放危险相关的分子模式并诱导I型干扰素的产生来触发肿瘤特异性T细胞反应。免疫疗法，包括检查点抑制，主要依靠预先存在的肿瘤特异性T细胞来展开治疗效果。因此，利用免疫原性细胞死亡作为内在抗癌疫苗的协同治疗方法可以提高其反应性。然而，细胞在治疗诱导的压力下释放的免疫原性因子谱仍然不完全表征，特别是关于细胞外囊泡（EV）。EV，即几乎所有细胞发射的纳米级膜颗粒，被认为可以促进细胞间通讯，并且在癌症中已被证明可以介导对肿瘤抗原的交叉启动。为了评估衍生自肿瘤的EV在各种条件下的免疫原性作用，寻求适应性强，可扩展和有效的方法。因此，本文提出了一种相对简单和稳健的方法来评估EV的 体内 免疫原性。该协议基于对EV小鼠 进行体内 免疫后脾T细胞的流式细胞术分析，通过基于沉淀的测定在治疗或稳态条件下从肿瘤细胞培养物中分离。例如，这项工作表明，B16-OVA小鼠黑色素瘤细胞的奥沙利铂暴露导致免疫原性EV的释放，这些EV可以介导肿瘤反应性细胞毒性T细胞的激活。因此， 通过体内 免疫和流式细胞术筛查EV可确定免疫原性EV可能出现的条件。确定免疫原性EV释放的条件为测试EV对癌症的治疗功效和探索潜在的分子机制提供了必要的先决条件，以最终揭示EV在癌症免疫学中的作用的新见解。

引言

免疫系统在抗击癌症方面起着举足轻重的作用，无论是在免疫检查点抑制的刺激下，还是在常规癌症治疗的功效下。肿瘤细胞屈服于基因毒性疗法，如化疗药物奥沙利铂和阿霉素，或电离放射治疗，可以释放抗原和危险相关分子模式（DAMPs），从而可能引发适应性抗肿瘤免疫反应¹。在免疫原性细胞死亡的背景下，最突出的DAMP包括fin-me信号，如趋化ATP，eat-me信号，如钙网蛋白的暴露，促进抗原呈递细胞对肿瘤细胞的摄取，以及HMGB1的释放，激活模式识别受体，从而增强肿瘤抗原的交叉呈递²。此外， 通过 肿瘤来源的免疫原性核酸或其他刺激诱导的I型干扰素（IFN-I）被树突状细胞感知，使它们能够有效地启动肿瘤特异性细胞毒性T细胞^3，4。临床上，活化和增殖的CD8 ⁺ T细胞浸润肿瘤为许多癌症患者的生存期提供了独立的预后因素。IFN-γ从这些活化的T细胞中释放出来，介导对癌细胞的直接抗增殖作用，并驱动Th1极化和细胞毒性T细胞分化，从而有助于对癌症的有效免疫监测^5，6。奥沙利铂是一种真正的免疫原性细胞死亡诱导剂，介导这种针对癌症的适应性免疫反应⁷。然而，肿瘤细胞在治疗诱导的压力下释放的大量初始免疫原性信号仍有待完全揭开。尽管癌症免疫疗法取得了重大进展，但将其益处扩大到更大比例的患者仍然是一个挑战。更详细地了解启动T细胞活化的免疫原性信号可以指导新疗法的开发。

一组异质的膜封闭结构，称为细胞外囊泡（EV），似乎充当细胞间通信设备。几乎所有细胞类型都发射的EV将功能蛋白，RNA，DNA和其他分子携带到受体细胞中，或者可能通过与细胞表面的受体结合来改变细胞的功能状态。它们的生物活性货物因生成细胞的类型和功能状态而显着变化⁸。在癌症免疫学中，从肿瘤细胞释放的EV主要被视为对抗免疫疗法，因为它们最终会促进侵入性生长，形成转移性生态位⁹并抑制免疫反应¹⁰。相比之下，一些研究表明，EV可以将肿瘤抗原转移到树突状细胞上，以实现有效的交叉呈现^11，12。如果EV在治疗诱导的压力下出现，则可提供免疫刺激性核酸，从而促进抗肿瘤免疫反应^13，14。最近，在肿瘤微环境中感知这种RNA和DNA先天免疫配体已被证明可以显着调节对检查点阻断的反应性^15，16，17。因此，肿瘤细胞在不同治疗诱导应激下释放的EV的免疫原性作用需要进一步阐明。由于电动汽车是一个年轻但不断增长的研究领域，因此方法的标准化仍在进行中。因此，共享知识对于提高电动汽车与癌症免疫学之间相互作用的研究可重复性至关重要。考虑到这一点，本文描述了一种简单的方案来评估肿瘤衍生的EV 在体内的免疫原性作用。

该评估是通过生成肿瘤衍生的EV，用这些EV免疫受体小鼠， 并通过 流式细胞术分析脾T细胞来进行的。理想情况下，EV的产生是通过在无EV的细胞培养基中接种小鼠肿瘤细胞以获得高纯度来进行的。用特定的细胞应激刺激（例如化疗）处理细胞，以比较治疗诱导的EV与相应肿瘤衍生EV的基线免疫原性的影响。电动汽车的分离可以通过各种技术进行，这些技术应根据 体内 适用性和当地可用性进行选择。以下方案描述了使用用于EV纯化的商用试剂盒的基于沉淀的测定。用这些EV对小鼠进行两次免疫。第一次注射后14天，从脾脏中提取T细胞， 并通过 流式细胞术分析IFN-γ的产生，以评估全身免疫反应。有了这个，在不同治疗方案下出现的肿瘤衍生的EV诱导抗肿瘤T细胞反应的潜力被相对容易，快速和高有效性^地评估13。因此，该方法适用于在各种条件下对衍生自癌细胞的EV进行免疫学筛选。

研究方案

在实验开始时，小鼠至少6周龄，并在特定的无病原体条件下维持。本议定书符合机构道德标准和现行地方法规。动物研究得到了当地监管机构（德国慕尼黑上巴伐利亚大学）的批准。这些研究中没有调查可能的性别相关偏倚。

1. 化疗后肿瘤细胞衍生EV的生成和分离

1. 在DMEM（含有4mM L-谷氨酰胺和4.5g / L D-葡萄糖）中培养表达卵清蛋白（B16-OVA）的小鼠B16黑色素瘤细胞，并在37°C下补充FCS（10%v / v），青霉素（100单位/ mL）和链霉素（100μg/ mL），直到细胞稳定生长并约90%汇合。
   注意:使用细胞培养罩在无菌条件下完全执行这部分方案。对于其他癌症实体的分析，表达强效抗原的细胞系更适合评估抗原特异性T细胞反应，因为它们允许特异性 离体 抗原再刺激。
2. 为了制备EV产生所需的细胞培养基，通过在4°C下以100，000× g 超速离心24小时，在FCS内耗尽牛EV，然后丢弃沉淀。或者，事先选择动物EV中低含量的商业制剂。
3. 收获B16-OVA细胞并在PBS中洗涤两次，然后在EV耗尽的培养基中以400，000个细胞/ mL的浓度接种。
   注意:使细胞浓度适应所研究细胞系的生长动态，以便细胞不会过度生长。
4. 通过每mL加入30μg奥沙利铂来处理B16-OVA细胞，并在37°C下孵育24小时。 不处理控制条件。首次使用基因毒性物质时，使用细胞活力测定法（如台盼蓝排除法）滴定所需的细胞毒性功效¹⁸。
   注意:该测定还可以评估用其他免疫调节物质或除化疗药物以外的电离照射处理的细胞培养物中产生的EV。
   注意:奥沙利铂会引起皮肤和严重的眼睛刺激，并可能引起过敏性皮肤反应和呼吸道刺激。奥沙利铂被怀疑致癌。作为预防措施，使用个人防护装备，包括足够的手套，护目镜，口罩和衣服，并在重复使用前进行清洁。避免吸入，处理后彻底洗手。避免释放到环境中，并根据现行法规处理奥沙利铂。从安全数据表中获取详细信息。
5. 收集细胞培养物上清液。首先在4°C下以400× g 离心5分钟，然后在4°C下以2，000× g 离心30分钟，每次丢弃沉淀。最后，通过220 nm PVDF膜过滤。每个步骤都使用新鲜的管子去除任何细胞碎片。
   注意:在此阶段，含EV的上清液可以在恢复方案之前在4°C下储存一天。但是，强烈建议立即进行EV纯化，以遵守所述时间表。
6. 将1 mL上清液与0.5 mL特定市售外泌体分离试剂（ 见材料表）混合在V形1.5 mL管中。彻底上下移液或涡流，以产生均匀的溶液。在4°C下孵育过夜。
7. 在4°C下以10，000× g 离心60分钟。 小心丢弃上清液。通过将1.5 mL管倒置在纸巾上，并通过带有细头的移液器抽吸而不接触底部的EV沉淀来去除剩余的滴剂。
   1. 彻底除去所有液体，以防止EV沉淀不受控制地稀释。此外，快速执行这些任务以防止颗粒变干。
8. 通过上下移液，将EV重悬在冷PBS中，而不会用吸头从管壁上刮伤沉淀。现在，将悬架从第一个管子一步一步转移到最后一个管子，以汇集电动汽车。
   注意:使用PBS的体积等于5μL乘以管数。5μL最终悬浮液含有从化疗或稳定状态下的400，000个细胞释放的分离的EV。
9. 优选地，直接使用电动汽车。如果无法做到这一点，请将EV悬浮液在-80°C下储存在硅化容器中长达28天，直到施用。
   注意:此处和其他几篇出版物中描述的EV在-80°C下储存时不会失去各自的生物学功能¹⁹。
10. 根据 MISEV2018 指南对 EV 分离物进行定量和表征²⁰。
    注:可能的定量方法包括纳米颗粒跟踪分析（NTA）²¹ 和EV膜结合蛋白的检测²²。进一步表征EV的可能方法包括电子显微镜²³ 和蛋白质印迹²⁰。

2. EV小鼠免疫

1. 计划C57BL / 6小鼠（或对应于肿瘤细胞系的其他同源小鼠）的 体内 实验，包括分别接受来自处理细胞，未处理细胞和PBS（载体）的EV的治疗组。
   注意:优选地，在6-8周龄时使用小鼠，以防止生理衰老减弱免疫反应²⁴。
2. 为相应治疗组中的每只小鼠混合5μLEV悬浮液和55μL冷PBS，以用从4.0 x ¹⁰⁵ B16-OVA细胞分离的EV进行免疫接种。
   注意:这个数量的EV对应于通过纳米颗粒跟踪分析测量的大约2 x ¹⁰⁹ 个颗粒（数据未显示）。OVA蛋白与佐剂（例如LPS）混合可作为有效的疫苗阳性对照。
   1. 将注射器（针头尺寸26-30 G）分别装满60μL稀释的EV或PBS，并立即放在冰上。
      注意:在方案中，注射的EV的量被归一化为释放EV的肿瘤细胞的数量，以实验考虑奥沙利铂对肿瘤细胞EV生物发生的定性和定量影响。对于一些读者来说，根据他们的科学问题，归一化到特定浓度的生产电动汽车可能更适合他们的实验设置。
3. 将EV或PBS皮下接种到小鼠大腿的内侧，并在7天后重复免疫。在第一次治疗后十四天，处死小鼠，例如，通过宫颈脱位来分析免疫反应。
   注意:根据当地标准，可以使用替代的皮下注射途径。

3. 脾T细胞的流式细胞术分析

1. 准备并冷却完整的RPMI（cRPMI），用食品接触物质（10%v / v），青霉素（100单位/ mL），链霉素（100μg/ mL），L-谷氨酰胺（2mM）和β巯基乙醇（50μM）补充RPMI-1640。
2. 从打开的腹腔中切除脾脏。用湿润的100μm细胞过滤器和注射器的塑料柱塞捣碎脾脏，并将脾细胞冲洗到50 mL管中，加入5-10 mL cRPMI。在4°C下以400× g 离心5分钟并弃去上清液。
   注意:尽可能将细胞放在冰上。为了分析局部而不是脾脏免疫反应，按照相同的方案切除引流的腘窝和腹股沟淋巴结。在这种情况下，跳过红细胞裂解的下一步。
3. 为了从细胞悬浮液中除去红细胞，用2mL红细胞裂解缓冲液重悬沉沉淀（ 见材料表）并在室温下孵育5分钟。然后，通过添加cRPMI停止反应。在4°C下以400× g 离心5分钟并弃去上清液。
4. 对于接种，将细胞沉淀重悬于cRPMI中并计数细胞，以将200，000个细胞和200μL cRPMI的一式三份放入每个孔中，使用具有U形底部的96孔板。在37°C下孵育48小时。
   注意:为了解决活化T细胞的抗原特异性，分别加入1μg/ mL可溶性卵清蛋白（或与正在研究的细胞系相对应的另一种肿瘤抗原）或在没有额外刺激的情况下离开。添加免疫优势肽表位SIINFEKL，而不是全长卵清蛋白，可以缩短潜伏期。除流式细胞术外，还可以在孵育48小时后分析小鼠的血清和细胞培养物上清液中的各种细胞因子。
5. 48小时后，为了通过阻断高尔基体介导的蛋白质分泌来增强细胞内IFN-γ染色，将Brefeldin A（5 ng / mL），PMA（20ng / mL）和Ionomycin（1μg / mL）加入细胞培养物中。在37°C下孵育4小时。
6. 在染色表面生物标志物之前，将脾细胞转移到具有V形底部的96孔板中，并用PBS洗涤两次。然后，加入与本地可用的流式细胞仪兼容的荧光抗体，针对表面生物标志物CD3，CD8和CD4（见 材料表），稀释1:400，加上可固定的活性染料，在PBS中以1:1，000稀释。将沉淀的脾细胞重悬于染色溶液中，并在4°C下孵育30分钟，避光。
7. 对于脾细胞的固定和透化，在FACS缓冲液中洗涤两次（PBS加3%v / v FCS），然后每孔重悬100μL固定/透化缓冲液（见 材料表）。在4°C下孵育30分钟，避光。
8. 对于细胞内IFN-γ染色，在固定/透化缓冲液中洗涤脾细胞，并用荧光抗体重悬抗IFN-γ，在缓冲液中以1:200稀释。在4°C下孵育至少1小时（最多12小时），避光。
9. 在通过流式细胞术测量样品之前，在固定/透化缓冲液中洗涤两次脾细胞，并在FACS缓冲液中重悬。根据 图2所示的门控策略分析细胞毒性T细胞的活化。
   1. 首先，为了检测单个细胞，将FSC-H与FSC-A进行印迹。然后，为了检测淋巴细胞，将SSC与FSC-A相印迹。随后，选择活的CD3 ⁺，CD4^-，CD8 ⁺ 细胞并确定其IFN-γ产生亚群，以量化脾脏中细胞毒性T细胞的活化。
      注:包括荧光减一（FMO）染色剂，除针对IFN-γ的荧光染料外，所有荧光染料均为阴性技术对照。

结果

该协议旨在促进对肿瘤衍生EV的免疫原性进行直接且易于重复的评估。因此，将小鼠接种来自表达模型抗原鸡卵清蛋白（OVA）的肿瘤细胞 体外 培养物的EV。随后的免疫反应 通过 流式细胞术在脾T细胞中分析。

图 1 概述了整个协议的实际步骤。由于该工作侧重于免疫原性细胞死亡，交叉展示和EV诱导的抗肿瘤免疫，因此该方案仅限于CD8 +细胞?...

讨论

该协议提供了在化疗诱导的压力下从黑色素瘤细胞衍生的EV的免疫 学体内 评估，同时适应各种治疗下各种癌症释放的EV。例如，用来自奥沙利铂处理的B16-OVA细胞的EV免疫小鼠，扩增脾脏中产生IFN-γ的CD8 ⁺ T细胞，这些细胞通过与卵清蛋白 的离体 孵育进一步刺激，表明肿瘤特异性免疫反应。因此，通过该协议筛查免疫原性EV有助于更全面地了解常规癌症疗法，并能够对EV在癌症?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-CD3 FITC	Biolegend	100204	Clone 17A2
Anti-CD4 PacBlue	Biolegend	100428	Clone GK1.5
Anti-CD8 APC	Biolegend	100712	Clone 53-6.7
Anti-IFNγ PE	eBioscience	RM90022	Clone XMG1.2
Brefeldin A	Biolegend	420601	Brefeldin A Solution (1,000x)
Cell Strainer, 100 µm	Greiner	542000	EASYstrainer 100 µm
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429	Dulbecco's Modified Eagle's Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM)
FBS Good Forte	PAN BIOTECH	P40-47500	Fetal Calf Serum (FCS)
Fixable Viability Dye eFluor 506	eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific	65-0866-14
Fixation/Permeabilization Concentrate	eBioscience	00-5123-43	Fixation/Permeabilization Concentrate (10x)
Fixation/Permeabilization Diluent	eBioscience	00-5223-56
Ionomycin	Sigma-Aldrich	407952	From Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1, ≥ 97% (HPLC)
L-Glutamine	Gibco	25030-032	L-Glutamine (200 mM)
Ovalbumin	InvivoGen	vac-pova	Ovalbumine with < 1 EU/mg endotoxin - CAS 9006-59-1
Oxaliplatin	Pharmacy of MRI hospital
PBS	Sigma-Aldrich	D8537	Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride
Penicillin-Streptomycin	Gibco	1514-122	Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL)
PMA	Sigma-Aldrich	P1585	Phorbol 12-myristate 13-acetate, ≥ 99% (HPLC)
PVDF filter, 0,22 µm, for syringes	Merck Millipore	SLGV033RS	Millex-GV Filter Unit 0.22 µm Durapore PVDF Membrane
Red Blood Cell Lysis Buffer	Invitrogen	00-4333-57
RPMI 1640	Thermo Fischer Scientific	11875	Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES
Syringe, 26 G	BD Biosciences	305501	1 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm)
Total Exosome Isolation Reagent	Invitrogen	4478359	For isolation from cell culture media
β-Mercaptoethanol	Thermo Fischer Scientific	31350	β-Mercaptoethanol (50 mM)