Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этой рукописи описывается, как оценить иммуногенность in vivo внеклеточных везикул опухолевых клеток (EV) с помощью проточной цитометрии. EV, полученные из опухолей, подвергающихся иммуногенной гибели клеток, вызванной лечением, кажутся особенно актуальными при иммунооперации опухолей. Этот протокол иллюстрирует оценку оксалиплатин-индуцированных иммуностимулирующих опухолевых EV, но может быть адаптирован к различным условиям.

Аннотация

Иммуногенная гибель клеток опухолей, вызванная химиотерапией или облучением, может вызывать специфические для опухоли ответы Т-клеток, высвобождая связанные с опасностью молекулярные паттерны и индуцируя выработку интерферона I типа. Иммунотерапия, включая ингибирование контрольных точек, в первую очередь полагается на ранее существовавшие опухолеспецифические Т-клетки для раскрытия терапевтического эффекта. Таким образом, синергетические терапевтические подходы, которые используют иммуногенную гибель клеток в качестве внутренней противораковой вакцины, могут улучшить их реакцию. Однако спектр иммуногенных факторов, высвобождаемых клетками при стрессе, вызванном терапией, остается неполностью охарактеризованным, особенно в отношении внеклеточных везикул (EV). Считается, что EV, наноразмерные мембранные частицы, испускаемые практически из всех клеток, облегчают межклеточную связь и, при раке, опосредуют перекрестное праймирование против опухолевых антигенов. Для оценки иммуногенного эффекта EV, полученных из опухолей в различных условиях, ищутся адаптируемые, масштабируемые и валидные методы. Таким образом, в настоящем документе представлен относительно простой и надежный подход к оценке иммуногенности EV in vivo . Протокол основан на анализе проточной цитометрии селезеночных Т-клеток после иммунизации in vivo мышей EV, выделенных путем анализа на основе осаждения из культур опухолевых клеток в условиях терапии или стационарного состояния. Например, эта работа показывает, что воздействие оксалиплатина на клетки мышиной меланомы B16-OVA привело к высвобождению иммуногенных EV, которые могут опосредуть активацию опухолеспособных цитотоксических Т-клеток. Следовательно, скрининг EV с помощью иммунизации in vivo и проточной цитометрии выявляет условия, при которых могут возникать иммуногенные EV. Выявление условий иммуногенного высвобождения EV обеспечивает важную предпосылку для тестирования терапевтической эффективности EV против рака и изучения основных молекулярных механизмов, чтобы в конечном итоге раскрыть новое понимание роли EV в иммунологии рака.

Введение

Иммунная система играет ключевую роль в борьбе с раком, как при инспирировании ингибирования иммунных контрольных точек, так и для эффективности традиционных методов лечения рака. Опухолевые клетки, поддающиеся генотоксической терапии, такой как химиотерапевтические агенты оксалиплатин и доксорубицин, или ионизирующее лучевое лечение, могут высвобождать антигены и связанные с опасностью молекулярные паттерны (DAMP), которые потенциально инициируют адаптивный противоопухолевый иммунный ответ1. Наиболее известные DAMP, в контексте иммуногенной гибели клеток, включают сигналы find-me, такие как хемотаксическая АТФ, сигналы eat-me, такие как воздей....

протокол

В начале экспериментов мышам было не менее 6 недель и они содержались в определенных условиях, свободных от патогенов. Настоящий протокол соответствует институциональным этическим нормам и действующим местным нормам. Исследования на животных были одобрены местным регулирующим органом (Regierung von Oberbayern, Мюнхен, Германия). Возможные предубеждения, связанные с полом, не были исследованы в этих исследованиях.

1. Генерация и выделение EV, полученных из опухолевых клеток после воздействия химиотерапии

  1. Культивировать мышиные клетки меланомы B16, экспрессирующие овальбумин (B16-OVA) в DMEM (содержащий 4 мМ L-глутамина и 4,5 г/л D-....

Результаты

Этот протокол предназначен для облегчения простой и легко воспроизводимой оценки иммуногенности ЭВ, полученных из опухоли. Таким образом, мышей прививают EV, полученными из культур опухолевых клеток in vitro , экспрессирующих модельный антиген куриного овальбумина (OVA). Последующий им.......

Обсуждение

Этот протокол обеспечивает иммунологическую оценку in vivo EV, полученных из клеток меланомы при стрессе, вызванном химиотерапией, при адаптации к EV, испускаемым различными видами рака при различных методах лечения. Например, иммунизация мышей EV, полученными из клеток B16-OVA, обработанн.......

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что конфликта интересов нет.

Благодарности

Это исследование было поддержано Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Немецкий исследовательский фонд) - Projektnummer 360372040 - SFB 1335 и Projektnummer 395357507 - SFB 1371 (H.P.), исследовательским грантом Мехтильд Харф от Фонда DKMS за дарение жизни (H.P.), премией молодого исследователя От Исследовательского альянса меланомы (для S.H.), стипендией Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (для F.S.), Посевной фонд Технического университета Мюнхена (S.H.) и исследовательский грант Фонда Вильгельма Сандера (2021.041.1, S.H.). H.P. поддерживается Программой молодых исследователей EMBO.

ВКЛАД АВТОРА:

F....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-CD3 FITCBiolegend100204Clone 17A2
Anti-CD4 PacBlueBiolegend100428Clone GK1.5
Anti-CD8 APCBiolegend100712Clone 53-6.7
Anti-IFNγ PEeBioscienceRM90022Clone XMG1.2
Brefeldin ABiolegend420601Brefeldin A Solution (1,000x)
Cell Strainer, 100 µmGreiner542000EASYstrainer 100 µm
DMEMSigma-AldrichD6429Dulbecco's Modified Eagle's Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM)
FBS Good FortePAN BIOTECHP40-47500Fetal Calf Serum (FCS)
Fixable Viability Dye eFluor 506eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific65-0866-14
Fixation/Permeabilization ConcentrateeBioscience00-5123-43Fixation/Permeabilization Concentrate (10x)
Fixation/Permeabilization DiluenteBioscience00-5223-56
IonomycinSigma-Aldrich407952From Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1, ≥ 97% (HPLC)
L-GlutamineGibco25030-032L-Glutamine (200 mM)
OvalbuminInvivoGenvac-povaOvalbumine with < 1 EU/mg endotoxin - CAS 9006-59-1
OxaliplatinPharmacy of MRI hospital
PBSSigma-AldrichD8537Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride
Penicillin-StreptomycinGibco1514-122Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL)
PMASigma-AldrichP1585Phorbol 12-myristate 13-acetate, ≥ 99% (HPLC)
PVDF filter, 0,22 µm, for syringesMerck MilliporeSLGV033RSMillex-GV Filter Unit 0.22 µm Durapore PVDF Membrane
Red Blood Cell Lysis BufferInvitrogen00-4333-57
RPMI 1640Thermo Fischer Scientific11875Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES
Syringe, 26 GBD Biosciences3055011 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm)
Total Exosome Isolation ReagentInvitrogen4478359For isolation from cell culture media
β-MercaptoethanolThermo Fischer Scientific31350β-Mercaptoethanol (50 mM)

Ссылки

  1. Kroemer, G., Galluzzi, L., Kepp, O., Zitvogel, L. Immunogenic cell death in cancer therapy. Annual Review of Immunology. 31, 51-72 (2013).
  2. Kepp, O., et al. Consensus guidelines for the detection of immunogenic cell death.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

175

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены