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기사 소개

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요약

이 원고는 유세포 분석기를 사용하여 종양 세포 유래 세포밖 소포 (EVs)의 생체 내 면역원성을 평가하는 방법을 설명합니다. 치료를 받는 종양으로부터 유래된 EVs-유도된 면역원성 세포 사멸은 종양 면역감시에 특히 관련있는 것으로 보인다. 이 프로토콜은 옥살리플라틴-유도된 면역자극성 종양 EVs의 평가를 예시하지만, 다양한 설정에 적응될 수 있다.

초록

화학요법 또는 방사선 조사에 의해 야기된 종양의 면역원성 세포 사멸은 위험-관련 분자 패턴을 방출하고 타입 I 인터페론의 생산을 유도함으로써 종양 특이적 T 세포 반응을 촉발시킬 수 있다. 체크포인트 억제를 포함한 면역요법은 주로 치료 효과를 전개하기 위해 기존의 종양 특이적 T 세포에 의존한다. 따라서, 면역원성 세포 사멸을 내재적 항암 백신으로서 이용하는 상승적 치료 접근법은 그들의 반응성을 향상시킬 수 있다. 그러나, 치료-유도된 스트레스 하에서 세포에 의해 방출되는 면역원성 인자의 스펙트럼은 특히 세포밖 소포(EVs)와 관련하여 불완전하게 특성화되어 있다. 거의 모든 세포에서 방출되는 나노 규모의 막성 입자 인 EVs는 세포 간 통신을 용이하게하는 것으로 간주되며, 암에서는 종양 항원에 대한 교차 프라이밍을 매개하는 것으로 나타났습니다. 다양한 조건하에서 종양으로부터 유래된 EVs의 면역원성 효과를 평가하기 위해, 적응가능하고, 확장 가능하고, 유효한 방법들이 요구된다. 따라서, 본원에서 EVs'의 생체내 면역원성을 평가하기 위해 비교적 쉽고 강력한 접근법이 제시된다. 이 프로토콜은 EVs로 마우스를 생체내 면역화한 후 비장 T 세포의 유세포 분석 분석에 기초하며, 치료 또는 정상 상태 조건 하에서 종양 세포 배양물로부터 침전 기반 분석에 의해 단리된다. 예를 들어, 이 연구는 B16-OVA 뮤린 흑색종 세포의 옥살리플라틴 노출이 종양 반응성 세포독성 T 세포의 활성화를 매개할 수 있는 면역원성 EVs의 방출을 가져왔다는 것을 보여준다. 따라서, 생체내 면역화 및 유동 세포측정법을 통한 EV의 스크리닝은 면역원성 EV가 출현할 수 있는 조건을 식별한다. 면역원성 EV 방출의 조건을 확인하는 것은 암에 대한 EV의 치료 효능을 테스트하고 암 면역학에서 EV의 역할에 대한 새로운 통찰력을 궁극적으로 공개하기 위해 근본적인 분자 메커니즘을 탐구하는 데 필수적인 전제 조건을 제공합니다.

서문

면역 체계는 면역 체크포인트 억제에 의해 유발될 때와 종래의 암 치료법의 효능에 대해 암과의 싸움에서 중추적인 역할을 한다. 화학요법제인 옥살리플라틴 및 독소루비신과 같은 유전독성 요법에 굴복하거나 이온화 방사선 치료로 인해 항원 및 잠재적으로 적응성 항종양 면역 반응을 개시하는 위험 관련 분자 패턴(DAMP)을 방출할 수 있다1. 면역원성 세포 사멸의 맥락에서 가장 두드러진 DAMPs는 화학주성 ATP와 같은 find-me 신호, 칼레티쿨린의 노출과 같은 먹거리-나 신호, 항원 제시 세포에 의한 종양 세포 흡수를 촉진하고, 패턴 인식 수용체를 활성화시켜 종양 항원의 교차 제시를 증진시키는 HMGB1의 방출을 포함한다2. 또한, 종양 유래 면역원성 핵산 또는 다른 자극을 통해 유도되는 I형 인터페론(IFN-I)은 수지상 세포에 의해 감지되어 종양 특이적 세포독성 T 세포를 효과적으로 프라이밍할 수 있게 한다3,4. 임상적으로, 활성화되고 증식하는 CD8+ T 세포는 종양에 침윤하여 많은 암 환자에서 장기간 생존을 위한 독립적인 예후 인자를 제공한다. 이러한 활성화된 T....

프로토콜

실험 개시시, 마우스는 적어도 6주령이었고, 특정 병원체가 없는 조건 하에서 유지되었다. 본 프로토콜은 제도적 윤리 기준과 통용되는 지역 규정을 준수합니다. 동물 연구는 현지 규제 기관 (Regierung von Oberbayern, 독일 뮌헨)의 승인을 받았습니다. 가능한 성 관련 편향은 이들 연구에서 조사되지 않았다.

1. 화학요법 노출 후 종양 세포로부터 유래된 EVs의 생성 및 분리

  1. 오브알부민(B16-OVA)을 발현하는 뮤린 B16 흑색종 세포를 FCS(10% v/v), 페니실린(100 Units/mL) 및 스트렙토마이신(100 μg/mL)이 보충된 DMEM(4 mM L-글루타민 및 4.5 g/L D-글루코스 함유)에서 37°C에서 배양하여, 세포가 꾸준히 성장하고 약 90% 컨플루언트될 때까지 배양한다.
    참고: 프로토콜의 이 섹션은 전적으로 세포 배양 후드를 사용하여 멸균 조건 하에서 수행하십시오. 다른 암 개체의 분석을 위해, 강력한 항원을 발현하는 세포주는 특정 생체외 항원 재자극을 허용하기 때문에 항원 특이적 T 세포 반응을 평가하는 것이 바람직하다.
  2. EV 생성에 필요한 세포 배양 배지를 제조하기 위해, 4°C에서 24시간 동안 100,000 x g 에서 ....

결과

이 프로토콜은 종양 유래 EVs의 면역원성의 간단하고 쉽게 재현가능한 평가를 용이하게 하기 위한 것이다. 이에 의해, 마우스는 모델 항원인 닭 난알부민(OVA)을 발현하는 종양 세포의 시험관내 배양물 로부터 유래된 EVs를 접종한다. 후속 면역 반응은 유세포 분석기를 통해 비장 T 세포에서 분석된다.

그림 1은 전체 프로토콜의 실제 단계에 대.......

토론

이 프로토콜은 다양한 치료 하에서 다양한 암으로부터 방출되는 EV에 적응하면서 화학요법-유도된 스트레스 하에서 흑색종 세포로부터 유래된 EVs의 면역학적 생체내 평가를 제공한다. 옥살리플라틴-처리된 B16-OVA 세포로부터 유래된 EVs로 마우스를 면역화시키는 것은, 예를 들어, 비장에서 IFN-γ-생산 CD8+ T 세포를 확장시키고, 이는 오브알부민을 사용한 생체외 인큐베이션에 ?.......

공개

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

감사의 말

이 연구는 Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) - Projektnummer 360372040 - SFB 1335 및 Projektnummer 395357507 - SFB 1371 (H.P.), DKMS Foundation for Giving Life (H.P.)의 Mechtild Harf Research Grant, Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (F.S.)의 장학금 인 Melanoma Research Alliance (S.H.)의 Young Investigator Award를 지원했습니다. 뮌헨 기술 대학 (S.H.)의 종자 기금과 빌헬름 샌더 재단 (2021.041.1, S.H.)의 연구 보조금. H. P.는 EMBO Young Investigator Program의 지원을 받습니다.

저자 기여 :

F.S., H.P., S.H.는 연구를 설계하고, 분석하고, 결과를 해석했습니다. F.S.와 S.H.는 원고를 썼다. H.P.와 S.H.가 연구를 이끌었다.

....

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-CD3 FITCBiolegend100204Clone 17A2
Anti-CD4 PacBlueBiolegend100428Clone GK1.5
Anti-CD8 APCBiolegend100712Clone 53-6.7
Anti-IFNγ PEeBioscienceRM90022Clone XMG1.2
Brefeldin ABiolegend420601Brefeldin A Solution (1,000x)
Cell Strainer, 100 µmGreiner542000EASYstrainer 100 µm
DMEMSigma-AldrichD6429Dulbecco's Modified Eagle's Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM)
FBS Good FortePAN BIOTECHP40-47500Fetal Calf Serum (FCS)
Fixable Viability Dye eFluor 506eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific65-0866-14
Fixation/Permeabilization ConcentrateeBioscience00-5123-43Fixation/Permeabilization Concentrate (10x)
Fixation/Permeabilization DiluenteBioscience00-5223-56
IonomycinSigma-Aldrich407952From Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1, ≥ 97% (HPLC)
L-GlutamineGibco25030-032L-Glutamine (200 mM)
OvalbuminInvivoGenvac-povaOvalbumine with < 1 EU/mg endotoxin - CAS 9006-59-1
OxaliplatinPharmacy of MRI hospital
PBSSigma-AldrichD8537Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride
Penicillin-StreptomycinGibco1514-122Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL)
PMASigma-AldrichP1585Phorbol 12-myristate 13-acetate, ≥ 99% (HPLC)
PVDF filter, 0,22 µm, for syringesMerck MilliporeSLGV033RSMillex-GV Filter Unit 0.22 µm Durapore PVDF Membrane
Red Blood Cell Lysis BufferInvitrogen00-4333-57
RPMI 1640Thermo Fischer Scientific11875Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES
Syringe, 26 GBD Biosciences3055011 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm)
Total Exosome Isolation ReagentInvitrogen4478359For isolation from cell culture media
β-MercaptoethanolThermo Fischer Scientific31350β-Mercaptoethanol (50 mM)

참고문헌

  1. Kroemer, G., Galluzzi, L., Kepp, O., Zitvogel, L. Immunogenic cell death in cancer therapy. Annual Review of Immunology. 31, 51-72 (2013).
  2. Kepp, O., et al. Consensus guidelines for the detection of immunogenic cell death.

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