In vivo Dépistage de l’immunogénicité des vésicules extracellulaires dérivées de tumeurs par cytométrie en flux de lymphocytes T spléniques

Résumé

Ce manuscrit décrit comment évaluer l’immunogénicité in vivo des vésicules extracellulaires dérivées de cellules tumorales (VE) à l’aide de la cytométrie en flux. Les VE dérivés de tumeurs subissant une mort cellulaire immunogène induite par le traitement semblent particulièrement pertinents dans l’immunosurveillance tumorale. Ce protocole illustre l’évaluation des VE des tumeurs immunostimulantes induites par l’oxaliplatine, mais peut être adapté à divers contextes.

Résumé

La mort cellulaire immunogène des tumeurs, causée par la chimiothérapie ou l’irradiation, peut déclencher des réponses des lymphocytes T spécifiques à la tumeur en libérant des modèles moléculaires associés au danger et en induisant la production d’interféron de type I. Les immunothérapies, y compris l’inhibition des points de contrôle, reposent principalement sur des cellules T préexistantes spécifiques à la tumeur pour déployer un effet thérapeutique. Ainsi, les approches thérapeutiques synergiques qui exploitent la mort cellulaire immunogène comme vaccin anticancéreux intrinsèque peuvent améliorer leur réactivité. Cependant, le spectre des facteurs immunogènes libérés par les cellules soumises à un stress induit par le traitement reste incomplètement caractérisé, en particulier en ce qui concerne les vésicules extracellulaires (VE). Les VE, des particules membraneuses à l’échelle nanométrique émises par pratiquement toutes les cellules, sont considérés comme facilitant la communication intercellulaire et, dans le cancer, il a été démontré qu’ils médient l’amorçage croisé contre les antigènes tumoraux. Pour évaluer l’effet immunogène des VE dérivés de tumeurs dans diverses conditions, des méthodes adaptables, évolutives et valides sont recherchées. Par conséquent, une approche relativement simple et robuste est présentée ici pour évaluer l’immunogénicité in vivo des VE. Le protocole est basé sur l’analyse par cytométrie en flux des lymphocytes T spléniques après l’immunisation in vivo de souris avec des VE, isolées par des tests basés sur les précipitations à partir de cultures de cellules tumorales sous thérapie ou dans des conditions d’état d’équilibre. Par exemple, ces travaux montrent que l’exposition à l’oxaliplatine des cellules de mélanome murin B16-OVA a entraîné la libération de VE immunogènes qui peuvent servir de médiateur dans l’activation des lymphocytes T cytotoxiques réactifs à la tumeur. Par conséquent, le dépistage des VE par immunisation in vivo et cytométrie en flux identifie les conditions dans lesquelles les VE immunogènes peuvent émerger. L’identification des conditions de libération immunogène des VE fournit une condition préalable essentielle pour tester l’efficacité thérapeutique des VE contre le cancer et explorer les mécanismes moléculaires sous-jacents afin de dévoiler de nouvelles perspectives sur le rôle des VE dans l’immunologie du cancer.

Introduction

Le système immunitaire joue un rôle central dans la lutte contre le cancer, à la fois lorsqu’il est incité par l’inhibition du point de contrôle immunitaire et pour l’efficacité des thérapies conventionnelles contre le cancer. Les cellules tumorales succombant à des thérapies génotoxiques telles que les agents chimiothérapeutiques oxaliplatine et doxorubicine, ou la radiothérapie ionisante peuvent libérer des antigènes et des modèles moléculaires associés au danger (DAMP) qui initient potentiellement une réponse immunitaire antitumorale ^adaptative1. Les DAMP les plus importants, dans le contexte de la mort cellulaire immunogène, comprennent les signaux find-me tels que l’ATP chimiotactique, les signaux eat-me tels que l’exposition à la calréticuline, qui favorise l’absorption des cellules tumorales par les cellules présentatrices d’antigènes, et la libération de HMGB1, qui active les récepteurs de reconnaissance de formes, améliorant ainsi la présentation croisée des antigènes ^tumoraux2. En outre, les interférons de type I (IFN-I), induits par des acides nucléiques immunogènes dérivés de tumeurs ou d’autres stimuli, sont détectés par les cellules dendritiques, ce qui leur permet d’amorcer efficacement les cellules T cytotoxiques spécifiques à la ^tumeur3,4. Cliniquement, les lymphocytes T CD8⁺ activés et proliférants infiltrant la tumeur fournissent un facteur pronostique indépendant pour une survie prolongée chez de nombreux patients atteints de cancer. Libéré par ces lymphocytes T activés, l’IFN-γ médie les effets antiprolifératifs directs sur les cellules cancéreuses et entraîne la polarisation Th1 et la différenciation des lymphocytes T cytotoxiques, contribuant ainsi à une immunosurveillance efficace contre le ^cancer5,6. L’oxaliplatine est un véritable inducteur immunogène de la mort cellulaire, médiant une telle réponse immunitaire adaptative contre le ^cancer7. Cependant, la pléthore de signaux immunogènes initiaux libérés par les cellules tumorales sous stress induit par le traitement reste à dévoiler pleinement. Malgré les progrès significatifs de l’immunothérapie du cancer, l’extension de ses avantages à une plus grande partie des patients reste un défi. Une compréhension plus détaillée des signaux immunogènes qui initient l’activation des lymphocytes T pourrait guider le développement de nouvelles thérapies.

Un groupe hétérogène de structures enfermées dans la membrane, connues sous le nom de vésicules extracellulaires (VE), semble servir de dispositifs de communication intercellulaire. Émis par pratiquement tous les types de cellules, les VE transportent des protéines fonctionnelles, de l’ARN, de l’ADN et d’autres molécules vers une cellule réceptrice ou peuvent modifier l’état fonctionnel d’une cellule simplement en se liant aux récepteurs à la surface de la cellule. Leur cargaison biologiquement active varie considérablement selon le type et l’état fonctionnel de la cellule ^{génératrice8}. En immunologie du cancer, les VE libérés par les cellules tumorales ont été principalement considérés comme antagonistes à l’immunothérapie parce qu’ils finissent par favoriser la croissance invasive, préformer des niches métastatiques9 et supprimer la réponse ^{immunitaire10}. En revanche, certaines études ont montré que les VE peuvent transférer des antigènes tumoraux aux cellules dendritiques pour une présentation croisée ^{efficace11,12}. Les VE peuvent fournir des acides nucléiques immunostimulants s’ils émergent sous un stress induit par le traitement, facilitant une réponse immunitaire ^{antitumorale13,14}. Il a récemment été démontré que la détection de tels ligands immunitaires innés à l’ARN et à l’ADN dans le microenvironnement tumoral module de manière significative la réactivité au blocage des points de contrôle15,16,17. Par conséquent, le rôle immunogène des VE libérés par les cellules tumorales sous différents stress induits par la thérapie doit être élucidé davantage. Étant donné que les véhicules électriques constituent un domaine de recherche jeune mais en pleine croissance, la normalisation des méthodes est toujours en cours. Par conséquent, le partage des connaissances est essentiel pour améliorer la reproductibilité de la recherche sur les interactions entre les VE et l’immunologie du cancer. Dans cet esprit, ce manuscrit décrit un protocole simple pour évaluer l’effet immunogène des VE dérivés de tumeurs in vivo.

Cette évaluation est réalisée en générant des VE dérivés de tumeurs, en immunisant les souris réceptrices avec ces VE et en analysant les lymphocytes T spléniques par cytométrie en flux. La génération de VE est idéalement réalisée en ensemençant des cellules tumorales murines dans un milieu de culture cellulaire sans EV pour un haut degré de pureté. Les cellules sont traitées avec un stimulus de stress cellulaire spécifique, tel que la chimiothérapie, pour comparer l’effet des VE induits par le traitement à l’immunogénicité de base des VE dérivés de tumeurs respectifs. L’isolement des véhicules électriques peut très bien être effectué par diverses techniques qui doivent être sélectionnées en fonction de l’applicabilité in vivo et de la disponibilité locale. Le protocole suivant décrit un test basé sur les précipitations avec un kit commercial pour la purification des véhicules électriques. Les souris sont immunisées deux fois avec ces VE. Quatorze jours après la première injection, les lymphocytes T sont extraits de la rate et analysés pour la production d’IFN-γ par cytométrie en flux afin d’évaluer une réponse immunitaire systémique. Avec cela, le potentiel des VE dérivés de tumeurs, émergeant sous différents schémas thérapeutiques, pour induire des réponses anti-cellules T tumorales est évalué relativement facilement, rapidement et avec une validité ^élevée13. Par conséquent, cette méthode convient à un dépistage immunologique des VE dérivés de cellules cancéreuses dans diverses conditions.

Protocole

Au début des expériences, les souris étaient âgées d’au moins 6 semaines et étaient maintenues dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes. Le présent protocole est conforme aux normes éthiques institutionnelles et aux réglementations locales en vigueur. Les études sur les animaux ont été approuvées par l’organisme de réglementation local (Regierung von Oberbayern, Munich, Allemagne). Les biais possibles liés au sexe n’ont pas été étudiés dans ces études.

1. Génération et isolement de VE dérivés de cellules tumorales après une exposition à la chimiothérapie

1. Cultiver des cellules de mélanome B16 murin exprimant l’ovalbumine (B16-OVA) dans le DMEM (contenant 4 mM de L-glutamine et 4,5 g/L de D-glucose) complétées par FCS (10 % v/v), pénicilline (100 unités/mL) et streptomycine (100 μg/mL) à 37 °C, jusqu’à ce que les cellules se développent régulièrement et soient confluentes à environ 90 %.
   REMARQUE: Effectuer cette section du protocole entièrement dans des conditions stériles à l’aide d’une cagoule de culture cellulaire. Pour l’analyse d’autres entités cancéreuses, les lignées cellulaires exprimant un antigène puissant sont préférables pour évaluer les réponses des lymphocytes T spécifiques à l’antigène, car elles permettent une restimulation ex vivo spécifique de l’antigène.
2. Pour préparer les milieux de culture cellulaire nécessaires à la génération de VE, épuiser les véhicules électriques bovins dans le FCS par ultracentrifugation à 100 000 x g pendant 24 h à 4 °C, puis jeter les granulés. Alternativement, choisissez une préparation commerciale faible en VE d’animaux au préalable.
3. Récoltez les cellules B16-OVA et lavez-les deux fois dans du PBS, puis ensemencez à une concentration de 400 000 cellules / mL dans des milieux appauvris en EV.
   REMARQUE: Adapter la concentration cellulaire à la dynamique de croissance de la lignée cellulaire étudiée afin que les cellules ne surcroissent pas.
4. Traiter les cellules B16-OVA en ajoutant 30 μg d’oxaliplatine par mL et incuber pendant 24 h à 37 °C. Laissez les conditions de contrôle non traitées. Lors de la première utilisation d’une substance génotoxique, titrer l’efficacité cytotoxique souhaitée à l’aide de tests de viabilité cellulaire tels que l’exclusion du bleu de ^trypan18.
   REMARQUE: Ce test peut également évaluer les VE générés dans des cultures cellulaires traitées avec d’autres substances immunomodulatrices ou une irradiation ionisante en plus des agents chimiothérapeutiques.
   ATTENTION: L’oxaliplatine provoque une irritation cutanée et oculaire grave et peut provoquer une réaction allergique cutanée et une irritation respiratoire. L’oxaliplatine est soupçonné de causer le cancer. Par mesure de précaution, utilisez un équipement de protection individuelle, y compris des gants, des lunettes, des masques et des vêtements adéquats, nettoyés avant d’être réutilisés. Évitez l’inhalation et lavez-vous soigneusement les mains après la manipulation. Évitez les rejets dans l’environnement et éliminez l’oxaliplatine conformément à la réglementation en vigueur. Obtenez des informations détaillées à partir de la fiche de données de sécurité.
5. Recueillir le surnageant de culture cellulaire. Centrifuger d’abord à 400 x g pendant 5 min à 4 °C, puis à 2 000 x g pendant 30 min à 4 °C, en jetant à chaque fois la pastille. Enfin, filtrez à travers une membrane PVDF de 220 nm. Utilisez un tube frais pour chaque étape afin d’éliminer les débris cellulaires.
   REMARQUE: À ce stade, le surnageant contenant du VE peut être stocké à 4 ° C pendant une journée avant de reprendre le protocole. Cependant, il est fortement recommandé de respecter le calendrier décrit avec une purification immédiate des ves.
6. Mélanger 1 mL de surnageant avec 0,5 mL d’un réactif d’isolement d’exosome spécifique disponible dans le commerce (voir tableau des matériaux) dans un tube de 1,5 mL en forme de V. Pipettez soigneusement de haut en bas ou vortexez pour créer une solution homogène. Incuber toute la nuit à 4 °C.
7. Centrifuger à 10 000 x g pendant 60 min à 4 °C. Jetez soigneusement le surnageant. Retirez les gouttes restantes en tapotant le tube de 1,5 mL à l’envers sur une serviette en papier et en aspirant à travers une pipette avec une pointe fine sans toucher la pastille EV au fond.
   1. Retirez soigneusement tous les fluides pour éviter une dilution incontrôlée de la pastille EV. En outre, exécutez ces tâches rapidement pour empêcher le granulé de se dessécher.
8. Remettez en suspension les véhicules électriques dans un PBS froid en pipetant de haut en bas sans rayer la pastille de la paroi du tube avec la pointe. Maintenant, transférez la suspension étape par étape du premier au dernier tube pour mettre en commun les véhicules électriques.
   REMARQUE: Utilisez un volume de PBS égal à 5 μL multiplié par le nombre de tubes. 5 μL de la suspension finale contient les VE isolés libérés par 400 000 cellules sous chimiothérapie ou à l’état d’équilibre.
9. De préférence, utilisez directement les véhicules électriques. Si cela n’est pas possible, conservez les suspensions de VE à -80 °C dans des récipients siliconés jusqu’à 28 jours jusqu’à l’application.
   REMARQUE: Les véhicules électriques décrits ici et dans plusieurs autres publications ne perdent pas leur fonction biologique respective lorsqu’ils sont entreposés à -80 °C pendant cette ^période19.
10. Quantifier et caractériser les isolats EV conformément aux directives MISEV201820.
    REMARQUE : Les méthodes possibles de quantification comprennent l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA)²¹ et la détection des protéines liées à la membrane ^d’EV22. Les approches possibles pour caractériser davantage les VE comprennent la microscopie ^{électronique23} et le transfert ^western20.

2. Immunisation des souris avec des VE

1. Planifiez l’expérience in vivo avec des souris C57BL/6 (ou d’autres souris syngéniques correspondant à la lignée cellulaire tumorale), y compris des groupes de traitement recevant des VE dérivés de cellules traitées, de cellules non traitées et de PBS (véhicule), respectivement.
   REMARQUE: De préférence, utilisez des souris à l’âge de 6 à 8 semaines pour empêcher la sénescence physiologique de diminuer la réponse ^{immunitaire24}.
2. Mélanger 5 μL de suspension EV avec 55 μL de PBS froid pour chaque souris du groupe de traitement respectif afin de l’immuniser avec des VE isolés à partir de cellules B16-OVA de 4,0 x ¹⁰⁵ .
   REMARQUE: Cette quantité de VE correspond à environ 2 x ¹⁰⁹ particules mesurées par analyse de suivi des nanoparticules (données non présentées). La protéine OVA mélangée à un adjuvant (p. ex., LPS) peut être appliquée comme témoin positif puissant du vaccin.
   1. Remplissez les seringues (taille de l’aiguille 26-30 G) avec 60 μL des VE dilués ou PBS, respectivement, et mettez immédiatement sur la glace.
      REMARQUE: Dans le protocole, la quantité de VE injectés est normalisée au nombre de cellules tumorales libérant des VE pour prendre en compte expérimentalement les effets qualitatifs et quantitatifs de l’oxaliplatine sur la biogenèse des cellules tumorales EV. Pour certains lecteurs, la normalisation à une concentration spécifique de véhicules électriques produits peut mieux correspondre à leur configuration expérimentale en fonction de leur question scientifique.
3. Inoculez les VE ou le PBS par voie sous-cutanée dans l’aspect médian de la cuisse de la souris et répétez l’immunisation après 7 jours. Quatorze jours après le premier traitement, sacrifier des souris, par exemple par luxation cervicale pour analyser la réponse immunitaire.
   REMARQUE: D’autres voies d’injection sous-cutanée peuvent être utilisées, conformément aux normes locales.

3. Analyse par cytométrie en flux des lymphocytes T spléniques

1. Préparer et refroidir le RPMI complet (cRPMI), en complétant le RPMI-1640 avec du FCS (10 % v/v), de la pénicilline (100 unités/mL), de la streptomycine (100 μg/mL), de la L-glutamine (2 mM) et du β-mercaptoéthanol (50 μM).
2. Réséquez la rate de la cavité abdominale ouverte. Écraser la rate avec une passoire cellulaire humidifiée de 100 μm et le piston en plastique d’une seringue et rincer les cellules spléniques dans un tube de 50 mL avec 5-10 mL de cRPMI. Centrifuger à 400 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
   REMARQUE: Gardez les cellules sur la glace autant que possible. Pour analyser la réponse immunitaire locale plutôt que splénique, réséquez les ganglions lymphatiques poplités et inguinaux drainants, en suivant le même protocole. Dans ce cas, sautez l’étape suivante pour la lyse des érythrocytes.
3. Pour retirer les érythrocytes de la suspension cellulaire, remettez en suspension la pastille avec 2 mL de tampon de lyse des globules rouges (voir tableau des matériaux) et incubez pendant 5 minutes à température ambiante. Ensuite, arrêtez la réaction en ajoutant cRPMI. Centrifuger à 400 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
4. Pour l’ensemencement, remettez en suspension la pastille cellulaire dans cRPMI et comptez les cellules pour placer des triples de 200 000 cellules avec 200 μL cRPMI dans chaque puits, à l’aide d’une plaque de 96 puits avec un fond en forme de U. Incuber pendant 48 h à 37 °C.
   REMARQUE: Pour traiter la spécificité de l’antigène des lymphocytes T activés, ajouter 1 μg / mL d’ovalbumine soluble (ou un autre antigène tumoral correspondant à la lignée cellulaire étudiée) ou laisser sans stimulus supplémentaire, respectivement. L’ajout de l’épitope peptidique à dominance immunitaire SIINFEKL, au lieu de l’ovalbumine pleine longueur, permet une période d’incubation plus courte. Outre la cytométrie en flux, le sérum des souris et le surnageant de culture cellulaire après 48 h d’incubation peuvent être analysés pour diverses cytokines.
5. Après 48 h, pour améliorer la coloration intracellulaire de l’IFN-γ, notamment en bloquant la sécrétion de protéines médiée par Golgi, ajouter la brefeldine A (5 ng/mL), la PMA (20 ng/mL) et l’ionomycine (1 μg/mL) à la culture cellulaire. Incuber pendant 4 h à 37 °C.
6. Avant de colorer les biomarqueurs de surface, transférez les splenocytes sur une plaque de 96 puits avec un fond en forme de V et lavez-les deux fois avec du PBS. Ensuite, ajoutez des anticorps fluorescents, compatibles avec le cytomètre en flux disponible localement, dirigés contre les biomarqueurs de surface, CD3, CD8 et CD4 (voir tableau des matériaux), dilués à 1:400, plus un colorant de viabilité réparable, dilué 1:1 000 dans du PBS. Remettre en suspension les splenocytes granulés dans la solution de coloration et incuber pendant 30 min à 4 °C, à l’abri de la lumière.
7. Pour la fixation et la perméabilisation des splenocytes, laver deux fois dans un tampon FACS (PBS plus 3 % v/v FCS), puis remettre en suspension dans 100 μL de tampon de fixation/perméabilisation (voir tableau des matériaux) par puits. Incuber pendant 30 min à 4 °C, à l’abri de la lumière.
8. Pour la coloration des γ intracellulaires de l’IFN, laver les splenocytes dans un tampon de fixation/perméabilisation et les remettre en suspension avec des anticorps fluorescents contre l’IFN-γ, dilués à 1:200 dans le tampon. Incuber pendant au moins 1 h (jusqu’à un maximum de 12 h) à 4 °C, à l’abri de la lumière.
9. Avant de mesurer les échantillons par cytométrie en flux, laver les splenocytes deux fois dans un tampon de fixation/perméabilisation et les remettre en suspension dans un tampon FACS. Analyser l’activation des lymphocytes T cytotoxiques selon la stratégie de contrôle illustrée à la figure 2.
   1. Tout d’abord, pour détecter des cellules individuelles, épongez FSC-H contre FSC-A. Ensuite, pour détecter les cellules lymphoïdes, épongez SSC contre FSC-A. Par la suite, sélectionnez les cellules CD3⁺, CD4^-, CD8⁺ vivantes et déterminez leur sous-ensemble producteur d’IFN-γ pour quantifier l’activation des lymphocytes T cytotoxiques dans la rate.
      REMARQUE: Inclure une coloration fluorescence moins un (FMO) avec tous les fluorochromes à l’exception du fluorochrome ciblé contre l’IFN-γ comme contrôle technique négatif.

Résultats

Ce protocole vise à faciliter l’évaluation simple et facilement reproductible de l’immunogénicité des VE dérivés de tumeurs. Ainsi, les souris sont inoculées avec des VE dérivées de cultures in vitro de cellules tumorales exprimant l’antigène modèle de l’ovalbumine de poulet (OVA). La réponse immunitaire subséquente est analysée dans les lymphocytes T spléniques par cytométrie en flux.

La figure 1 donne un aperçu des éta...

Discussion

Ce protocole fournit une évaluation immunologique in vivo des VE dérivés de cellules de mélanome sous stress induit par la chimiothérapie tout en s’adaptant aux VE émis par divers cancers sous divers traitements. L’immunisation des souris avec des VE dérivés de cellules B16-OVA traitées à l’oxaliplatine, par exemple, élargit les lymphocytes T CD8⁺ producteurs d’IFN-γ dans la rate, qui sont ensuite stimulés par incubation ex vivo avec de l’ovalbumine, indiquant une répo...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-CD3 FITC	Biolegend	100204	Clone 17A2
Anti-CD4 PacBlue	Biolegend	100428	Clone GK1.5
Anti-CD8 APC	Biolegend	100712	Clone 53-6.7
Anti-IFNγ PE	eBioscience	RM90022	Clone XMG1.2
Brefeldin A	Biolegend	420601	Brefeldin A Solution (1,000x)
Cell Strainer, 100 µm	Greiner	542000	EASYstrainer 100 µm
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429	Dulbecco's Modified Eagle's Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM)
FBS Good Forte	PAN BIOTECH	P40-47500	Fetal Calf Serum (FCS)
Fixable Viability Dye eFluor 506	eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific	65-0866-14
Fixation/Permeabilization Concentrate	eBioscience	00-5123-43	Fixation/Permeabilization Concentrate (10x)
Fixation/Permeabilization Diluent	eBioscience	00-5223-56
Ionomycin	Sigma-Aldrich	407952	From Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1, ≥ 97% (HPLC)
L-Glutamine	Gibco	25030-032	L-Glutamine (200 mM)
Ovalbumin	InvivoGen	vac-pova	Ovalbumine with < 1 EU/mg endotoxin - CAS 9006-59-1
Oxaliplatin	Pharmacy of MRI hospital
PBS	Sigma-Aldrich	D8537	Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride
Penicillin-Streptomycin	Gibco	1514-122	Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL)
PMA	Sigma-Aldrich	P1585	Phorbol 12-myristate 13-acetate, ≥ 99% (HPLC)
PVDF filter, 0,22 µm, for syringes	Merck Millipore	SLGV033RS	Millex-GV Filter Unit 0.22 µm Durapore PVDF Membrane
Red Blood Cell Lysis Buffer	Invitrogen	00-4333-57
RPMI 1640	Thermo Fischer Scientific	11875	Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES
Syringe, 26 G	BD Biosciences	305501	1 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm)
Total Exosome Isolation Reagent	Invitrogen	4478359	For isolation from cell culture media
β-Mercaptoethanol	Thermo Fischer Scientific	31350	β-Mercaptoethanol (50 mM)