インビボ 脾臓T細胞のフローサイトメトリーによる腫瘍由来細胞外小胞の免疫原性スクリーニング

要約

この原稿では、フローサイトメトリーを用いて腫瘍細胞由来細胞外小胞(EV)の in vivo 免疫原性を評価する方法を説明しています。治療誘発免疫原性細胞死を受けている腫瘍に由来するEVは、腫瘍免疫サーベイランスにおいて特に関連しているようである。このプロトコールは、オキサリプラチン誘発免疫刺激性腫瘍EVの評価を例示するが、様々な設定に適合させることができる。

要約

化学療法または照射によって引き起こされる腫瘍の免疫原性細胞死は、危険に関連する分子パターンを放出し、I型インターフェロンの産生を誘導することによって、腫瘍特異的T細胞応答を誘発し得る。チェックポイント阻害を含む免疫療法は、治療効果を発現させるために、主に既存の腫瘍特異的T細胞に依存している。したがって、免疫原性細胞死を固有の抗癌ワクチンとして利用する相乗的な治療アプローチは、それらの応答性を改善し得る。しかし、治療誘発ストレス下で細胞によって放出される免疫原性因子のスペクトルは、特に細胞外小胞(EV)に関して、不完全な特徴のままである。EVは、事実上すべての細胞から放出されるナノスケールの膜状粒子であり、細胞間通信を促進すると考えられており、癌では腫瘍抗原に対するクロスプライミングを媒介することが示されている。様々な条件下で腫瘍に由来するEVの免疫原性効果を評価するために、適応性、拡張性、および有効な方法が求められている。したがって、本明細書では、EVsの インビボ 免疫原性を評価するための比較的容易で堅牢なアプローチが提示される。このプロトコールは、マウスをEVで in vivo 免疫した後の脾臓T細胞のフローサイトメトリー分析に基づいており、治療または定常状態条件下での腫瘍細胞培養物からの沈殿ベースのアッセイによって単離された。例えば、この研究は、B16-OVAマウスメラノーマ細胞のオキサリプラチン曝露が、腫瘍反応性細胞傷害性T細胞の活性化を媒介することができる免疫原性EVの放出をもたらしたことを示している。したがって、 in vivo 免疫およびフローサイトメトリーによるEVのスクリーニングは、免疫原性EVが出現し得る条件を特定する。免疫原性EV放出の条件を同定することは、がんに対するEVの治療効果を試験し、根底にある分子メカニズムを探求し、最終的にがん免疫学におけるEVの役割に関する新しい洞察を明らかにするための不可欠な前提条件を提供する。

概要

免疫系は、免疫チェックポイント阻害によって誘発された場合および従来の癌治療の有効性の両方において、癌との闘いにおいて極めて重要な役割を果たしている。化学療法剤オキサリプラチンやドキソルビシンなどの遺伝毒性療法、または電離放射線治療に屈した腫瘍細胞は、適応抗腫瘍免疫応答を開始する可能性のある抗原および危険関連分子パターン(DAMP)を放出する可能性があります¹。免疫原性細胞死の文脈で最も顕著なDAMPには、走化性ATPなどのfind-meシグナル、抗原提示細胞による腫瘍細胞の取り込みを促進するカレチクリンの曝露などのeat-meシグナル、およびパターン認識受容体を活性化し、それによって腫瘍抗原の交差提示を増強するHMGB1の放出が含まれる²。さらに、腫瘍由来の免疫原性核酸または他の刺激を介して誘導されるI型インターフェロン(IFN-I)は、樹状細胞によって感知され、腫瘍特異的細胞傷害性T細胞を効果的にプライミングすることを可能にする^3,4。臨床的には、腫瘍に浸潤する活性化および増殖するCD8⁺ T細胞は、多くの癌患者において生存期間を延長するための独立した予後因子を提供する。このような活性化T細胞から放出されるIFN-γは、がん細胞に対する直接的な抗増殖作用を媒介し、Th1分極および細胞傷害性T細胞分化を駆動し、それによってがんに対する効果的な免疫サーベイランスに寄与する^5,6。オキサリプラチンは、がんに対するこのような適応免疫応答を媒介する、正真正銘の免疫原性細胞死誘導物質です⁷。しかし、治療誘発ストレス下で腫瘍細胞によって放出される多数の初期免疫原性シグナルは、まだ完全に明らかにされていない。がん免疫療法の著しい進歩にもかかわらず、その利益をより大きな患者に拡大することは依然として課題である。T細胞活性化を開始する免疫原性シグナルのより詳細な理解は、新規治療法の開発を導く可能性がある。

細胞外小胞(EV)として知られる膜密閉構造の不均一なグループは、細胞間通信デバイスとして機能するようである。事実上すべての細胞型から放出されるEVは、機能的なタンパク質、RNA、DNA、およびその他の分子をレシピエント細胞に運んだり、細胞表面の受容体に結合するだけで細胞の機能状態を変化させる可能性があります。それらの生物学的に活性な貨物は、生成セル⁸の種類および機能状態によって大きく変化する。がん免疫学では、腫瘍細胞から放出されるEVは、最終的に浸潤増殖を促進し、転移ニッチをプリフォーム^し9、免疫応答を抑制するため、免疫療法の敵対的とみなされてきました¹⁰。対照的に、いくつかの研究では、EVが腫瘍抗原を樹状細胞に転写して効果的なクロスプレゼンテーションを行うことができることが示されています^11,12。EVは、治療誘発ストレス下で出現すると免疫刺激核酸を提供し、抗腫瘍免疫応答を促進する可能性があります^13,14。腫瘍微小環境におけるこのようなRNAおよびDNA先天性免疫リガンドの感知は、チェックポイント遮断に対する応答性を有意に調節することが最近示されている¹⁵、^16、17。したがって、異なる治療誘発ストレス下で腫瘍細胞によって放出されるEVの免疫原性の役割は、さらに解明される必要がある。EVは、まだ成長途上の研究分野であるため、手法の標準化はまだ進んでいます。したがって、EVとがん免疫学の相互作用に関する研究再現性を向上させるためには、知識の共有が不可欠です。これを念頭に置いて、この原稿は、インビボでの腫瘍由来EVの免疫原性効果を評価するための簡単なプロトコルを記述している。

この評価は、腫瘍由来のEVを生成し、レシピエントマウスにそれらのEVを免疫し、フローサイトメトリー を介して 脾臓T細胞を分析することによって行われる。EV生成は、理想的には、マウス腫瘍細胞を高純度のEVフリー細胞培養培地に播種することによって行われる。細胞を化学療法などの特定の細胞ストレス刺激で処理し、それぞれの腫瘍由来EVのベースライン免疫原性に対する治療誘発EVの効果を比較する。EVの単離は、 インビボでの 適用性および局所的な利用可能性に応じて選択されるべきである様々な技術によって十分に実施され得る。以下のプロトコールは、EV精製のための市販キットを用いた沈殿ベースのアッセイを記載する。マウスは、これらのEVで2回免疫される。最初の注射から14日後、T細胞を脾臓から抽出し、フローサイトメトリー を介して IFN-γ産生について分析し、全身性免疫応答を評価した。これにより、異なる治療レジメンの下で出現する腫瘍由来EVが抗腫瘍T細胞応答を誘導する可能性が、比較的容易、迅速、かつ高い妥当性で評価される¹³。従って、本方法は、種々の条件下での癌細胞由来のEVの免疫学的スクリーニングに適している。

プロトコル

実験の開始時に、マウスは少なくとも6週齢であり、特定の病原体を含まない条件下で維持された。現在の議定書は、制度的倫理基準および一般的な地方規則に準拠しています。動物実験は、地元の規制当局(ドイツ、ミュンヘンのRegierung von Oberbayern)によって承認されました。これらの研究では、性に関連するバイアスの可能性は調査されなかった。

1. 化学療法暴露後の腫瘍細胞由来のEVの生成と単離

1. オボアルブミン(B16-OVA)を発現するマウスB16メラノーマ細胞を、FCS(10% v/v)、ペニシリン(100 Units/mL)、ストレプトマイシン(100 μg/mL)を添加したDMEM(4 mM L-グルタミンおよび4.5 g/L D-グルコースを含む)中で、37°Cで培養し、細胞が安定して約90%コンフルエンになるまで培養した。
   メモ: プロトコルのこのセクションは、細胞培養フードを使用して完全に滅菌条件下で実行してください。他のがん実体の分析のために、強力な抗原を発現する細胞株は、特異的 なエクスビボ 抗原再刺激を可能にするため、抗原特異的T細胞応答を評価するのに好ましい。
2. EV生成に必要な細胞培養培地を調製するには、FCS内のウシEVを100,000 x g で4°Cで24時間超遠心分離して枯渇させ、ペレットを廃棄する。あるいは、動物のEVが少ない市販の製剤を事前に選択してください。
3. B16-OVA細胞を回収し、PBSで2回洗浄した後、EV枯渇培地に400,000細胞/mLの濃度で播種する。
   注: 細胞が過剰増殖しないように、調査中の細胞株の増殖動態に細胞濃度を適合させます。
4. B16-OVA細胞を1mLあたり30μgのオキサリプラチンを加えて処理し、37°Cで24時間インキュベートする。 制御条件は未処理のままにします。遺伝毒性物質の最初の使用時に、トリパンブルー排除などの細胞生存率アッセイを使用して所望の細胞傷害性有効性を滴定する¹⁸。
   注:このアッセイは、化学療法剤以外の他の免疫調節物質または電離放射線で処理された細胞培養物で生成されたEVを評価することもできる。
   警告:オキサリプラチンは、皮膚および重度の眼の刺激を引き起こし、アレルギー性皮膚反応および呼吸刺激を引き起こす可能性がある。オキサリプラチンは癌を引き起こす疑いがある。予防措置として、適切な手袋、ゴーグル、マスク、衣類などの個人用保護具を清潔にしてから再利用してください。吸入を避け、取り扱い後はよく手を洗ってください。環境への放出を避け、一般的な規制に従ってオキサリプラチンを処分してください。安全データシートから詳細情報を入手してください。
5. 細胞培養上清を回収する。まず400 x gで4°Cで5分間遠心分離し、次に2,000 x gで4°Cで30分間遠心分離し、毎回ペレットを廃棄する。最後に、220nmのPVDF膜を通して濾過する。各ステップに新しいチューブを使用して、細胞破片を除去します。
   注:この段階では、EV含有上清は、プロトコルを再開する前に4°Cで1日保存することができます。ただし、記載されたスケジュールに従って直ちにEV精製を行うことを強くお勧めします。
6. 1 mLの上清と0.5 mLの特定の市販のエキソソーム単離試薬( 材料表を参照)をV字型の1.5 mLチューブで混合する。徹底的にピペットを上下または渦巻きにして、均一な溶液を作成します。4°Cで一晩インキュベートする。
7. 10,000 x g で4°Cで60分間遠心分離する。 上清を慎重に捨てる。ペーパータオルの上で1.5 mLチューブを逆さまに叩き、底部のEVペレットに触れることなく、細かい先端を持つピペットを通して吸引することによって、残りの滴を取り除きます。
   1. EVペレットの制御不能な希釈を防ぐために、すべての液体を完全に除去します。また、ペレットが乾燥するのを防ぐために、これらのタスクをすばやく実行してください。
8. チューブの壁から先端でペレットを傷つけることなく上下にピペッティングして、EVを冷たいPBSに再懸濁します。次に、サスペンションを最初のチューブから最後のチューブに段階的に移してEVをプールします。
   注: 5 μL にチューブ数を掛けた容量の PBS を使用してください。最終懸濁液の5 μLは、化学療法下または定常状態で400,000細胞から放出された単離されたEVを含む。
9. 好ましくは、EVを直接使用する。これが不可能な場合は、EV懸濁液を-80°Cでシリコン処理容器に塗布するまで最大28日間保管してください。
   注:ここおよびいくつかの他の出版物に記載されているEVは、その期間に-80°Cで保存してもそれぞれの生物学的機能を失うことはありません¹⁹。
10. MISEV2018ガイドラインに従ってEV分離株を定量化し、特性評価^する20。
    注:定量化の可能な方法には、ナノ粒子追跡分析(NTA)²¹ およびEVの膜結合タンパク質^の検出22が含まれる。EVをさらに特徴付けるための可能なアプローチには、電子顕微鏡²³ およびウェスタンブロット²⁰が含まれる。

2. EVによるマウスの免疫

1. 処理細胞、未処理細胞、およびPBS(ビヒクル)に由来するEVをそれぞれ投与された治療群を含むC57BL/6マウス(または腫瘍細胞株に対応する他の同系マウス)による in vivo 実験を計画する。
   注:生理学的老化が免疫応答を減少させるのを防ぐために、好ましくは6〜8週齢のマウスを使用してください²⁴。
2. 5 μLのEV懸濁液と、それぞれの治療群内の各マウスの55 μLの冷PBSを混合し、4.0 x ¹⁰⁵ B16-OVA細胞から単離したEVで免疫する。
   注:この量のEVは、ナノ粒子追跡分析によって測定された約2 x ¹⁰⁹ 個の粒子に相当する(データは示されていない)。アジュバントと混合されたOVAタンパク質(例えば、LPS)は、強力なワクチン陽性対照として適用することができる。
   1. シリンジ(針サイズ26〜30G)にそれぞれ60μLの希釈EVまたはPBSを充填し、直ちに氷上に置く。
      注:プロトコルでは、注入されたEVの量は、腫瘍細胞のEV生合成に対するオキサリプラチンの定性的および定量的効果の両方を実験的に考慮するために、EV放出腫瘍細胞の数に正規化される。一部の読者にとって、生産されたEVの特定の濃度への正規化は、科学的質問に応じて実験設定により適している可能性があります。
3. EVまたはPBSをマウスの大腿部の内側側面に皮下に接種し、7日後に免疫を繰り返す。最初の処置の14日後、マウスを屠殺し、例えば、子宮頸部脱臼によって、免疫応答を分析する。
   注:代替皮下注射経路は、地元の基準に従って使用することができる。

3. 脾臓T細胞のフローサイトメトリー解析

1. RPMI-1640にFCS(10% v/v)、ペニシリン(100 Units/mL)、ストレプトマイシン(100 μg/mL)、L-グルタミン(2 mM)、およびβ-メルカプトエタノール(50 μM)を補充し、完全なRPMI(cRPMI)を準備して冷却する。
2. 開いた腹腔から脾臓を切除する。湿らせた100μmの細胞ストレーナーとシリンジのプラスチックプランジャーで脾臓をマッシュアップし、脾臓細胞を5〜10mLのcRPMIで50mLチューブに流します。400 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てる。
   注: 可能な限り、細胞を氷の上に置きます。脾臓免疫応答ではなく局所的な免疫応答を分析するために、同じプロトコルに従って、排液性膝窩および鼠径リンパ節を切除する。この場合、赤血球の溶解のための次のステップをスキップする。
3. 細胞懸濁液から赤血球を除去するために、ペレットを2mLの赤血球溶解緩衝液( 材料表を参照)で再懸濁し、室温で5分間インキュベートする。その後、cRPMIを加えて反応を停止させた。400 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てる。
4. 播種のために、細胞ペレットをcRPMIに再懸濁し、U字型の底部を有する96ウェルプレートを使用して、200,000細胞の3連を200μLのcRPMIと共に各ウェルに配置するように細胞をカウントする。37°Cで48時間インキュベートする。
   注:活性化T細胞の抗原特異性に対処するには、それぞれ1μg/mLの可溶性オボアルブミン(または調査中の細胞株に対応する別の腫瘍抗原)を添加するか、追加の刺激を受けずに放置してください。完全長オボアルブミンの代わりに免疫優性ペプチドエピトープSIINFEKLを添加すると、より短い潜伏期間が可能になる。フローサイトメトリー以外にも、48時間のインキュベーション後のマウスの血清および細胞培養上清を、種々のサイトカインについて分析することができる。
5. 48時間後、とりわけゴルジ体媒介性タンパク質分泌を遮断することにより細胞内IFN-γ染色を増強するために、ブレフェルジンA(5ng/mL)、PMA(20ng/mL)、およびイオノマイシン(1μg/mL)を細胞培養物に加える。37°Cで4時間インキュベートする。
6. 表面バイオマーカーを染色する前に、脾細胞をV字型底部を有する96ウェルプレートに移し、PBSで2回洗浄する。次いで、局所的に入手可能なフローサイトメーターと適合性の蛍光抗体を、表面バイオマーカー、CD3、CD8、およびCD4( 材料表を参照)に対して向け、1:400に希釈し、固定可能な生存率色素を加え、PBSで1:1,000に希釈した。ペレット状の脾細胞を染色液に再懸濁し、4°Cで30分間インキュベートし、光から保護した。
7. 脾細胞の固定および透過処理のために、FACS緩衝液(PBSプラス3% v/v FCS)で2回洗浄し、次いで1ウェルあたり100μLの固定/透過流化緩衝液( 材料表を参照)に再懸濁する。4°Cで30分間インキュベートし、光から保護した。
8. 細胞内IFN-γの染色のために、脾細胞を固定/透過処理バッファーで洗浄し、IFN-γに対する蛍光抗体で再懸濁し、バッファーで1:200に希釈する。光から保護し、4°Cで少なくとも1時間(最大12時間まで)インキュベートする。
9. フローサイトメトリーでサンプルを測定する前に、脾細胞を固定/透過処理バッファーで2回洗浄し、FACSバッファーに再懸濁してください。 図2に示したゲーティング戦略に従って細胞傷害性T細胞の活性化を分析する。
   1. まず、単一細胞を検出するために、FSC-HをFSC-Aに対してブロットする。次いで、リンパ球系細胞を検出するために、FSC-Aに対してSSCをブロットする。続いて、生きたCD3+、CD4-、CD8⁺細胞を選択し、それらの^IFN-γ産生サブセットを決定して、脾臓における細胞傷害性T細胞の活性化を定量化する。
      注: IFN-γ に対して標的とする蛍光色素を除くすべての蛍光色素を含む蛍光マイナス 1 (FMO) 染色をネガティブ テクニカル コントロールとして含めます。

結果

このプロトコルは、腫瘍由来EVの免疫原性の簡単で再現性の高い評価を容易にすることを意図している。これにより、マウスは、モデル抗原であるニワトリオボアルブミン(OVA)を発現する腫瘍細胞の in vitro 培養に由来するEVsを接種する。その後の免疫応答は、フローサイトメトリー を介して 脾臓T細胞において分析される。

図 1 に、プ...

ディスカッション

このプロトコルは、化学療法誘発ストレス下での黒色腫細胞に由来するEVの免疫学的 in vivo 評価を提供し、様々な治療下で様々な癌から放出されるEVに適応する。例えば、オキサリプラチン処理したB16-OVA細胞に由来するEVでマウスを免疫すると、脾臓内のIFN-γ産生CD8⁺ T細胞が拡張され、オボアルブミンとの エクスビボ インキュベーションによってさらに刺激され、腫瘍?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-CD3 FITC	Biolegend	100204	Clone 17A2
Anti-CD4 PacBlue	Biolegend	100428	Clone GK1.5
Anti-CD8 APC	Biolegend	100712	Clone 53-6.7
Anti-IFNγ PE	eBioscience	RM90022	Clone XMG1.2
Brefeldin A	Biolegend	420601	Brefeldin A Solution (1,000x)
Cell Strainer, 100 µm	Greiner	542000	EASYstrainer 100 µm
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429	Dulbecco's Modified Eagle's Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM)
FBS Good Forte	PAN BIOTECH	P40-47500	Fetal Calf Serum (FCS)
Fixable Viability Dye eFluor 506	eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific	65-0866-14
Fixation/Permeabilization Concentrate	eBioscience	00-5123-43	Fixation/Permeabilization Concentrate (10x)
Fixation/Permeabilization Diluent	eBioscience	00-5223-56
Ionomycin	Sigma-Aldrich	407952	From Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1, ≥ 97% (HPLC)
L-Glutamine	Gibco	25030-032	L-Glutamine (200 mM)
Ovalbumin	InvivoGen	vac-pova	Ovalbumine with < 1 EU/mg endotoxin - CAS 9006-59-1
Oxaliplatin	Pharmacy of MRI hospital
PBS	Sigma-Aldrich	D8537	Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride
Penicillin-Streptomycin	Gibco	1514-122	Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL)
PMA	Sigma-Aldrich	P1585	Phorbol 12-myristate 13-acetate, ≥ 99% (HPLC)
PVDF filter, 0,22 µm, for syringes	Merck Millipore	SLGV033RS	Millex-GV Filter Unit 0.22 µm Durapore PVDF Membrane
Red Blood Cell Lysis Buffer	Invitrogen	00-4333-57
RPMI 1640	Thermo Fischer Scientific	11875	Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES
Syringe, 26 G	BD Biosciences	305501	1 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm)
Total Exosome Isolation Reagent	Invitrogen	4478359	For isolation from cell culture media
β-Mercaptoethanol	Thermo Fischer Scientific	31350	β-Mercaptoethanol (50 mM)