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En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este manuscrito describe cómo evaluar la inmunogenicidad in vivo de las vesículas extracelulares (EV) derivadas de células tumorales utilizando citometría de flujo. Los EV derivados de tumores sometidos a muerte celular inmunogénica inducida por el tratamiento parecen particularmente relevantes en la inmunovigilancia tumoral. Este protocolo ejemplifica la evaluación de los EV tumorales inmunoestimulantes inducidos por oxaliplatino, pero se puede adaptar a diversos entornos.

Resumen

La muerte celular inmunogénica de los tumores, causada por la quimioterapia o la irradiación, puede desencadenar respuestas de células T específicas del tumor al liberar patrones moleculares asociados al peligro e inducir la producción de interferón tipo I. Las inmunoterapias, incluida la inhibición del punto de control, se basan principalmente en células T preexistentes específicas del tumor para desplegar un efecto terapéutico. Por lo tanto, los enfoques terapéuticos sinérgicos que explotan la muerte celular inmunogénica como una vacuna intrínseca contra el cáncer pueden mejorar su capacidad de respuesta. Sin embargo, el espectro de factores inmunogénicos liberados por las células bajo estrés inducido por la terapia sigue estando incompletamente caracterizado, especialmente con respecto a las vesículas extracelulares (EV). Se considera que los EV, partículas membranosas a nanoescala emitidas por prácticamente todas las células, facilitan la comunicación intercelular y, en el cáncer, se ha demostrado que median el cebado cruzado contra los antígenos tumorales. Para evaluar el efecto inmunogénico de los EV derivados de tumores en diversas condiciones, se buscan métodos adaptables, escalables y válidos. Por lo tanto, aquí se presenta un enfoque relativamente fácil y robusto para evaluar la inmunogenicidad in vivo de los EV. El protocolo se basa en el análisis de citometría de flujo de células T esplénicas después de la inmunización in vivo de ratones con EV, aislados por ensayos basados en precipitaciones de cultivos de células tumorales en condiciones de terapia o estado estacionario. Por ejemplo, este trabajo muestra que la exposición al oxaliplatino de las células de melanoma murino B16-OVA resultó en la liberación de EV inmunogénicos que pueden mediar la activación de las células T citotóxicas reactivas al tumor. Por lo tanto, la detección de EV a través de la inmunización in vivo y la citometría de flujo identifica las condiciones bajo las cuales pueden surgir EV inmunogénicos. La identificación de las condiciones de liberación de EV inmunogénicos proporciona un requisito previo esencial para probar la eficacia terapéutica de los EV contra el cáncer y explorar los mecanismos moleculares subyacentes para finalmente revelar nuevos conocimientos sobre el papel de los EV en la inmunología del cáncer.

Introducción

El sistema inmunitario desempeña un papel fundamental en la lucha contra el cáncer, tanto cuando es incitado por la inhibición del punto de control inmunitario como por la eficacia de las terapias convencionales contra el cáncer. Las células tumorales que sucumben a terapias genotóxicas como los agentes quimioterapéuticos oxaliplatino y doxorrubicina, o el tratamiento con radiación ionizante pueden liberar antígenos y patrones moleculares asociados al peligro (DAMP) que potencialmente inician una respuesta inmune antitumoral adaptativa1. Las DAMP más destacadas, en el contexto de la muerte celular inmunogénica, incluyen señales find-me como atp....

Protocolo

Al inicio de los experimentos, los ratones tenían al menos 6 semanas de edad y se mantuvieron en condiciones específicas libres de patógenos. El presente protocolo cumple con los estándares éticos institucionales y las regulaciones locales vigentes. Los estudios en animales fueron aprobados por la agencia reguladora local (Regierung von Oberbayern, Munich, Alemania). Los posibles sesgos relacionados con el sexo no se investigaron en estos estudios.

1. Generación y aislamiento de EV derivados de células tumorales después de la exposición a la quimioterapia

  1. Cultivo de células de melanoma B16 murino que expresan ovoalbúmina (B16-OVA)....

Resultados

Este protocolo está destinado a facilitar la evaluación directa y fácilmente reproducible de la inmunogenicidad de los EV derivados de tumores. De este modo, los ratones son inoculados con EV derivados de cultivos in vitro de células tumorales que expresan el antígeno modelo de ovoalbúmina de pollo (OVA). La respuesta inmune posterior se analiza en células T esplénicas a través de citometría de flujo.

La Figura 1 ofrece una visión gene.......

Discusión

Este protocolo proporciona una evaluación inmunológica in vivo de los EV derivados de células de melanoma bajo estrés inducido por la quimioterapia mientras se adapta a los EV emitidos por varios cánceres bajo diversos tratamientos. La inmunización de ratones con EV derivados de células B16-OVA tratadas con oxaliplatino, por ejemplo, expande las células T CD8 + productoras de IFN-γ en el bazo, que se estimulan aún más mediante la incubación ex vivo con ovoalbúmina, lo que indica .......

Divulgaciones

Los autores declaran que no hay conflicto de intereses.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) - Projektnummer 360372040 - SFB 1335 y Projektnummer 395357507 - SFB 1371 (a H.P.), una beca de investigación Mechtild Harf de la Fundación DKMS para Dar Vida (a H.P.) un Premio al Joven Investigador por la Alianza de Investigación del Melanoma (a S.H.), una beca de la Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (a F.S.), un Fondo Semilla de la Universidad Técnica de Munich (a S.H.) y una beca de investigación de la Fundación Wilhelm Sander (2021.041.1, a S.H.). H. P. cuenta con el apoyo del Programa de Jóvenes Investigadores de EMBO.

CONTR....

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-CD3 FITCBiolegend100204Clone 17A2
Anti-CD4 PacBlueBiolegend100428Clone GK1.5
Anti-CD8 APCBiolegend100712Clone 53-6.7
Anti-IFNγ PEeBioscienceRM90022Clone XMG1.2
Brefeldin ABiolegend420601Brefeldin A Solution (1,000x)
Cell Strainer, 100 µmGreiner542000EASYstrainer 100 µm
DMEMSigma-AldrichD6429Dulbecco's Modified Eagle's Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM)
FBS Good FortePAN BIOTECHP40-47500Fetal Calf Serum (FCS)
Fixable Viability Dye eFluor 506eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific65-0866-14
Fixation/Permeabilization ConcentrateeBioscience00-5123-43Fixation/Permeabilization Concentrate (10x)
Fixation/Permeabilization DiluenteBioscience00-5223-56
IonomycinSigma-Aldrich407952From Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1, ≥ 97% (HPLC)
L-GlutamineGibco25030-032L-Glutamine (200 mM)
OvalbuminInvivoGenvac-povaOvalbumine with < 1 EU/mg endotoxin - CAS 9006-59-1
OxaliplatinPharmacy of MRI hospital
PBSSigma-AldrichD8537Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride
Penicillin-StreptomycinGibco1514-122Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL)
PMASigma-AldrichP1585Phorbol 12-myristate 13-acetate, ≥ 99% (HPLC)
PVDF filter, 0,22 µm, for syringesMerck MilliporeSLGV033RSMillex-GV Filter Unit 0.22 µm Durapore PVDF Membrane
Red Blood Cell Lysis BufferInvitrogen00-4333-57
RPMI 1640Thermo Fischer Scientific11875Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES
Syringe, 26 GBD Biosciences3055011 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm)
Total Exosome Isolation ReagentInvitrogen4478359For isolation from cell culture media
β-MercaptoethanolThermo Fischer Scientific31350β-Mercaptoethanol (50 mM)

Referencias

  1. Kroemer, G., Galluzzi, L., Kepp, O., Zitvogel, L. Immunogenic cell death in cancer therapy. Annual Review of Immunology. 31, 51-72 (2013).
  2. Kepp, O., et al. Consensus guidelines for the detection of immunogenic cell death.

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