In vivo Detección de inmunogenicidad de vesículas extracelulares derivadas de tumores mediante citometría de flujo de células T esplénicas

Resumen

Este manuscrito describe cómo evaluar la inmunogenicidad in vivo de las vesículas extracelulares (EV) derivadas de células tumorales utilizando citometría de flujo. Los EV derivados de tumores sometidos a muerte celular inmunogénica inducida por el tratamiento parecen particularmente relevantes en la inmunovigilancia tumoral. Este protocolo ejemplifica la evaluación de los EV tumorales inmunoestimulantes inducidos por oxaliplatino, pero se puede adaptar a diversos entornos.

Resumen

La muerte celular inmunogénica de los tumores, causada por la quimioterapia o la irradiación, puede desencadenar respuestas de células T específicas del tumor al liberar patrones moleculares asociados al peligro e inducir la producción de interferón tipo I. Las inmunoterapias, incluida la inhibición del punto de control, se basan principalmente en células T preexistentes específicas del tumor para desplegar un efecto terapéutico. Por lo tanto, los enfoques terapéuticos sinérgicos que explotan la muerte celular inmunogénica como una vacuna intrínseca contra el cáncer pueden mejorar su capacidad de respuesta. Sin embargo, el espectro de factores inmunogénicos liberados por las células bajo estrés inducido por la terapia sigue estando incompletamente caracterizado, especialmente con respecto a las vesículas extracelulares (EV). Se considera que los EV, partículas membranosas a nanoescala emitidas por prácticamente todas las células, facilitan la comunicación intercelular y, en el cáncer, se ha demostrado que median el cebado cruzado contra los antígenos tumorales. Para evaluar el efecto inmunogénico de los EV derivados de tumores en diversas condiciones, se buscan métodos adaptables, escalables y válidos. Por lo tanto, aquí se presenta un enfoque relativamente fácil y robusto para evaluar la inmunogenicidad in vivo de los EV. El protocolo se basa en el análisis de citometría de flujo de células T esplénicas después de la inmunización in vivo de ratones con EV, aislados por ensayos basados en precipitaciones de cultivos de células tumorales en condiciones de terapia o estado estacionario. Por ejemplo, este trabajo muestra que la exposición al oxaliplatino de las células de melanoma murino B16-OVA resultó en la liberación de EV inmunogénicos que pueden mediar la activación de las células T citotóxicas reactivas al tumor. Por lo tanto, la detección de EV a través de la inmunización in vivo y la citometría de flujo identifica las condiciones bajo las cuales pueden surgir EV inmunogénicos. La identificación de las condiciones de liberación de EV inmunogénicos proporciona un requisito previo esencial para probar la eficacia terapéutica de los EV contra el cáncer y explorar los mecanismos moleculares subyacentes para finalmente revelar nuevos conocimientos sobre el papel de los EV en la inmunología del cáncer.

Introducción

El sistema inmunitario desempeña un papel fundamental en la lucha contra el cáncer, tanto cuando es incitado por la inhibición del punto de control inmunitario como por la eficacia de las terapias convencionales contra el cáncer. Las células tumorales que sucumben a terapias genotóxicas como los agentes quimioterapéuticos oxaliplatino y doxorrubicina, o el tratamiento con radiación ionizante pueden liberar antígenos y patrones moleculares asociados al peligro (DAMP) que potencialmente inician una respuesta inmune antitumoral ^adaptativa1. Las DAMP más destacadas, en el contexto de la muerte celular inmunogénica, incluyen señales find-me como atp quimiotáctico, señales eat-me como la exposición a calreticulina, que promueve la absorción de células tumorales por las células presentadoras de antígenos, y la liberación de HMGB1, que activa los receptores de reconocimiento de patrones, mejorando así la presentación cruzada de antígenos ^tumorales2. Además, los interferones de tipo I (IFN-I), inducidos a través de ácidos nucleicos inmunogénicos derivados de tumores u otros estímulos, son detectados por las células dendríticas, lo que les permite cebar eficazmente las células T citotóxicas específicas del ^tumor3,4. Clínicamente, las células T CD8⁺ activadas y en proliferación que se infiltran en el tumor proporcionan un factor pronóstico independiente para la supervivencia prolongada en muchos pacientes con cáncer. Liberado de tales células T activadas, el IFN-γ media efectos antiproliferativos directos sobre las células cancerosas e impulsa la polarización Th1 y la diferenciación citotóxica de las células T, contribuyendo así a una inmunovigilancia efectiva contra el ^cáncer5,6. El oxaliplatino es un inductor de muerte celular inmunogénico de buena fe, que media dicha respuesta inmune adaptativa contra el ^cáncer7. Sin embargo, la plétora de señales inmunogénicas iniciales liberadas por las células tumorales bajo estrés inducido por la terapia aún no se ha revelado por completo. A pesar de los avances significativos en la inmunoterapia contra el cáncer, la expansión de sus beneficios a una mayor parte de los pacientes sigue siendo un desafío. Una comprensión más detallada de las señales inmunogénicas que inician la activación de las células T puede guiar el desarrollo de nuevas terapias.

Un grupo heterogéneo de estructuras cerradas por membrana, conocidas como vesículas extracelulares (EV), parecen servir como dispositivos de comunicación intercelular. Emitidos por prácticamente todos los tipos de células, los EV transportan proteínas funcionales, ARN, ADN y otras moléculas a una célula receptora o pueden alterar el estado funcional de una célula simplemente uniéndose a los receptores en la superficie celular. Su carga biológicamente activa varía significativamente según el tipo y el estado funcional de la célula ^generadora8. En inmunología del cáncer, los EV liberados de las células tumorales se han considerado predominantemente como adversarios de la inmunoterapia porque eventualmente promueven el crecimiento invasivo, preforman nichos metastásicos9 y suprimen la respuesta ^inmune10. Por el contrario, algunos estudios han demostrado que los EV pueden transferir antígenos tumorales a las células dendríticas para una presentación cruzada ^{efectiva11,12}. Los EV pueden proporcionar ácidos nucleicos inmunoestimulantes si emergen bajo estrés inducido por la terapia, lo que facilita una respuesta inmune ^{antitumoral13,14}. Recientemente se ha demostrado que la detección de dichos ligandos inmunes innatos de ARN y ADN en el microambiente tumoral modula significativamente la capacidad de respuesta al bloqueo del punto de control15,16,17. Por lo tanto, el papel inmunogénico de los EV liberados por las células tumorales bajo diferente estrés inducido por la terapia debe dilucidarse aún más. Dado que los vehículos eléctricos constituyen un campo de investigación joven pero en crecimiento, la estandarización de los métodos aún está en curso. Por lo tanto, compartir conocimientos es esencial para mejorar la reproducibilidad de la investigación sobre las interacciones entre los EV y la inmunología del cáncer. Con esto en mente, este manuscrito describe un protocolo simple para evaluar el efecto inmunogénico de los EV derivados de tumores in vivo.

Esta evaluación se realiza mediante la generación de EV derivados de tumores, inmunizando a los ratones receptores con esos EV y analizando las células T esplénicas a través de la citometría de flujo. La generación de EV se realiza idealmente mediante la siembra de células tumorales murinas en un medio de cultivo celular libre de EV para un alto grado de pureza. Las células se tratan con un estímulo de estrés celular específico, como la quimioterapia, para comparar el efecto de los EV inducidos por la terapia con la inmunogenicidad basal de los respectivos EV derivados del tumor. El aislamiento de los EV bien puede realizarse mediante diversas técnicas que deben seleccionarse de acuerdo con la aplicabilidad in vivo y la disponibilidad local. El siguiente protocolo describe un ensayo basado en la precipitación con un kit comercial para la purificación de ev. Los ratones son inmunizados dos veces con esos VEHÍCULOS ELÉCTRICOS. Catorce días después de la primera inyección, las células T se extraen del bazo y se analizan para la producción de IFN-γ a través de la citometría de flujo para evaluar una respuesta inmune sistémica. Con esto, el potencial de los EV derivados de tumores, surgidos bajo diferentes regímenes terapéuticos, para inducir respuestas antitumorales de células T se evalúa con relativa facilidad, rapidez y alta ^validez13. Por lo tanto, este método es adecuado para una detección inmunológica de EV derivados de células cancerosas en diversas condiciones.

Protocolo

Al inicio de los experimentos, los ratones tenían al menos 6 semanas de edad y se mantuvieron en condiciones específicas libres de patógenos. El presente protocolo cumple con los estándares éticos institucionales y las regulaciones locales vigentes. Los estudios en animales fueron aprobados por la agencia reguladora local (Regierung von Oberbayern, Munich, Alemania). Los posibles sesgos relacionados con el sexo no se investigaron en estos estudios.

1. Generación y aislamiento de EV derivados de células tumorales después de la exposición a la quimioterapia

1. Cultivo de células de melanoma B16 murino que expresan ovoalbúmina (B16-OVA) en DMEM (que contiene 4 mM de L-glutamina y 4,5 g/L de D-glucosa) suplementadas con FCS (10% v/v), penicilina (100 Unidades/mL) y estreptomicina (100 μg/mL) a 37 °C, hasta que las células crezcan de manera constante y sean aproximadamente 90% confluentes.
   NOTA: Realice esta sección del protocolo completamente en condiciones estériles utilizando una campana de cultivo celular. Para el análisis de otras entidades cancerosas, las líneas celulares que expresan un antígeno potente son preferibles para evaluar las respuestas de las células T específicas del antígeno, ya que permiten la reestimulación específica de antígenos ex vivo .
2. Para preparar los medios de cultivo celular necesarios para la generación de EV, agote los EV bovinos dentro de FCS mediante ultracentrifugación a 100,000 x g durante 24 h a 4 ° C, y luego deseche el pellet. Alternativamente, elija una preparación comercial baja en EV de animales de antemano.
3. Cosechar células B16-OVA y lavarlas dos veces en PBS, y luego sembrar a una concentración de 400,000 células / ml en medios agotados de EV.
   NOTA: Adaptar la concentración celular a la dinámica de crecimiento de la línea celular bajo investigación para que las células no crezcan en exceso.
4. Tratar las células B16-OVA añadiendo 30 μg de oxaliplatino por ml e incubar durante 24 h a 37 °C. Deje las condiciones de control sin tratar. En el primer uso de una sustancia genotóxica, valorar la eficacia citotóxica deseada mediante ensayos de viabilidad celular como la exclusión del azul de ^tripano18.
   NOTA: Este ensayo también puede evaluar los EV generados en cultivos celulares tratados con otras sustancias inmunomoduladoras o irradiación ionizante además de la quimioterapéutica.
   PRECAUCIÓN: El oxaliplatino causa irritación cutánea y ocular severa y puede causar una reacción alérgica en la piel e irritación respiratoria. Se sospecha que el oxaliplatino causa cáncer. Como medida de precaución, use equipo de protección personal, incluidos guantes, gafas, máscaras y ropa adecuados, limpiados antes de reutilizarlos. Evite la inhalación y lávese bien las manos después de manipular. Evite la liberación en el medio ambiente y deseche el oxaliplatino de acuerdo con las regulaciones vigentes. Obtenga información detallada de la ficha de datos de seguridad.
5. Recolectar sobrenadante de cultivo celular. Centrifugar primero a 400 x g durante 5 min a 4 °C, y luego a 2.000 x g durante 30 min a 4 °C, cada vez desechando el pellet. Finalmente, filtre a través de una membrana de PVDF de 220 nm. Use un tubo nuevo para cada paso para eliminar cualquier residuo celular.
   NOTA: En esta etapa, el sobrenadante que contiene EV puede almacenarse a 4 °C durante un día antes de reanudar el protocolo. Sin embargo, se recomienda encarecidamente cumplir con el programa descrito con la purificación inmediata de EV.
6. Mezcle 1 ml de sobrenadante con 0,5 ml de un reactivo de aislamiento de exosomas específico disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales) en un tubo de 1,5 ml en forma de V. Pipetear bien hacia arriba y hacia abajo o vórtice para crear una solución homogénea. Incubar durante la noche a 4 °C.
7. Centrifugadora a 10.000 x g durante 60 min a 4 °C. Deseche cuidadosamente el sobrenadante. Retire las gotas restantes golpeando el tubo de 1,5 ml boca abajo en una toalla de papel y por aspiración a través de una pipeta con una punta fina sin tocar el EV-pellet en la parte inferior.
   1. Retire a fondo todos los líquidos para evitar la dilución incontrolada del EV-pellet. Además, ejecute estas tareas rápidamente para evitar que el pellet se seque.
8. Resuspenda los EV en PBS frío mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo sin rayar el pellet de la pared del tubo con la punta. Ahora, transfiera la suspensión paso a paso desde el primer hasta el último tubo para agrupar los vehículos eléctricos.
   NOTA: Utilice un volumen de PBS igual a 5 μL multiplicado por el número de tubos. 5 μL de la suspensión final contiene los EV aislados liberados de 400.000 células bajo quimioterapia o en estado estacionario.
9. Preferiblemente, use vehículos eléctricos directamente. Si esto no es posible, guarde las suspensiones EV a -80 °C en recipientes siliconados durante un máximo de 28 días hasta la aplicación.
   NOTA: Los vehículos eléctricos descritos aquí y en varias otras publicaciones no pierden su función biológica respectiva cuando se almacenan a -80 °C para ese período de ^tiempo19.
10. Cuantificar y caracterizar aislados de EV de acuerdo con las directrices MISEV201820.
    NOTA: Los posibles métodos de cuantificación incluyen el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA)²¹ y la detección de proteínas unidas a la membrana de ^EV22. Los posibles enfoques para caracterizar aún más los EV incluyen la microscopía ^{electrónica23} y western ^blot20.

2. Inmunización de ratones con EV

1. Planifique el experimento in vivo con ratones C57BL/6 (u otros ratones singénicos correspondientes a la línea celular tumoral), incluidos los grupos de tratamiento que reciben EV derivados de células tratadas, células no tratadas y PBS (vehículo), respectivamente.
   NOTA: Preferiblemente, utilizar ratones a la edad de 6-8 semanas para evitar que la senescencia fisiológica disminuya la respuesta ^inmune24.
2. Mezclar 5 μL de suspensión EV con PBS frío de 55 μL para cada ratón dentro del grupo de tratamiento respectivo para inmunizarlo con EV aislados de 4,0 x ¹⁰⁵ células B16-OVA.
   NOTA: Esta cantidad de EV corresponde a aproximadamente 2 x ¹⁰⁹ partículas medidas por análisis de seguimiento de nanopartículas (datos no mostrados). La proteína OVA mezclada con un adyuvante (por ejemplo, LPS) se puede aplicar como un potente control positivo de la vacuna.
   1. Llene las jeringas (tamaño de la aguja 26-30 G) con 60 μL de los EV diluidos o PBS, respectivamente y colóquelas inmediatamente en hielo.
      NOTA: En el protocolo, la cantidad de EV inyectados se normaliza al número de células tumorales liberadoras de EV para considerar experimentalmente los efectos cualitativos y cuantitativos del oxaliplatino en la biogénesis EV de células tumorales. Para algunos lectores, la normalización a una concentración específica de vehículos eléctricos producidos puede ajustarse mejor a su configuración experimental dependiendo de su pregunta científica.
3. Inocular EV o PBS por vía subcutánea en el aspecto medial del muslo de los ratones y repetir la inmunización después de 7 días. Catorce días después del primer tratamiento, sacrifique ratones, por ejemplo, por dislocación cervical para analizar la respuesta inmune.
   NOTA: Se pueden utilizar vías alternativas de inyección subcutánea, de acuerdo con los estándares locales.

3. Análisis de citometría de flujo de células T esplénicas

1. Preparar y enfriar RPMI completo (cRPMI), suplementando RPMI-1640 con FCS (10% v/v), penicilina (100 Unidades/mL), estreptomicina (100 μg/mL), L-glutamina (2 mM) y β-mercaptoetanol (50 μM).
2. Reseque el bazo de la cavidad abdominal abierta. Triture el bazo con un colador de células de 100 μm humedecido y el émbolo de plástico de una jeringa y enjuague las células esplénicas en un tubo de 50 ml con 5-10 ml de cRPMI. Centrifugar a 400 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
   NOTA: Mantenga las celdas en hielo siempre que sea posible. Para analizar la respuesta inmune local en lugar de la esplénica, reseque los ganglios linfáticos poplíteos e inguinales drenantes, siguiendo el mismo protocolo. En este caso, omita el siguiente paso para la lisis de los eritrocitos.
3. Para eliminar los eritrocitos de la suspensión celular, vuelva a suspender el gránulo con 2 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos (consulte la Tabla de materiales) e incube durante 5 minutos a temperatura ambiente. Luego, detenga la reacción agregando cRPMI. Centrifugar a 400 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
4. Para la siembra, resuspender el pellet celular en cRPMI y contar las células para colocar triplicados de 200,000 células con 200 μL cRPMI en cada pozo, utilizando una placa de 96 pocillos con un fondo en forma de U. Incubar durante 48 h a 37 °C.
   NOTA: Para abordar la especificidad del antígeno de las células T activadas, agregue 1 μg / ml de ovoalbúmina soluble (u otro antígeno tumoral correspondiente a la línea celular bajo investigación) o déjelo sin estímulo adicional, respectivamente. La adición del epítopo peptídico inmunodominante SIINFEKL, en lugar de la ovoalbúmina de longitud completa, permite un período de incubación más corto. Además de la citometría de flujo, el suero de los ratones y el sobrenadante de cultivo celular después de 48 h de incubación se pueden analizar en busca de varias citoquinas.
5. Después de 48 h, para mejorar la tinción intracelular de IFN-γ mediante, entre otras cosas, el bloqueo de la secreción de proteínas mediada por Golgi, agregue Brefeldin A (5 ng / mL), PMA (20 ng / mL) e Ionomicina (1 μg / mL) al cultivo celular. Incubar durante 4 h a 37 °C.
6. Antes de teñir los biomarcadores de la superficie, transfiera los esplenocitos a una placa de 96 pocillos con un fondo en forma de V y lávese dos veces con PBS. Luego, agregue anticuerpos fluorescentes, compatibles con el citómetro de flujo disponible localmente, dirigidos contra biomarcadores de superficie, CD3, CD8 y CD4 (ver Tabla de Materiales), diluidos 1:400, más un colorante de viabilidad fijable, diluido 1:1,000 en PBS. Resuspend los esplenocitos granulados en la solución de tinción e incubar durante 30 min a 4 °C, protegidos de la luz.
7. Para la fijación y permeabilización de los esplenocitos, lavar dos veces en tampón FACS (PBS más 3% v/v FCS), y luego resuspend en 100 μL de tampón de fijación/permeabilización (ver Tabla de Materiales) por pozo. Incubar durante 30 min a 4 °C, protegido de la luz.
8. Para la tinción de IFN-γ intracelular, lave los esplenocitos en el tampón de fijación/permeabilización y resuspenda con anticuerpos fluorescentes contra ifN-γ, diluidos 1:200 en el tampón. Incubar durante al menos 1 h (hasta un máximo de 12 h) a 4 °C, protegido de la luz.
9. Antes de medir las muestras por citometría de flujo, lave los esplenocitos dos veces en el tampón de fijación/permeabilización y resuspenda en el tampón FACS. Analizar la activación de las células T citotóxicas de acuerdo con la estrategia de cierre mostrada en la Figura 2.
   1. Primero, para detectar células individuales, seque FSC-H contra FSC-A. Luego, para detectar células linfoides, seque SSC contra FSC-A. Posteriormente, seleccione células CD3⁺, CD4^-, CD8⁺ vivas y determine su subconjunto productor de IFN-γ para cuantificar la activación de células T citotóxicas en el bazo.
      NOTA: Incluya una tinción de fluorescencia menos uno (FMO) con todos los fluorocromos excepto el fluorocromo dirigido contra IFN-γ como control técnico negativo.

Resultados

Este protocolo está destinado a facilitar la evaluación directa y fácilmente reproducible de la inmunogenicidad de los EV derivados de tumores. De este modo, los ratones son inoculados con EV derivados de cultivos in vitro de células tumorales que expresan el antígeno modelo de ovoalbúmina de pollo (OVA). La respuesta inmune posterior se analiza en células T esplénicas a través de citometría de flujo.

La Figura 1 ofrece una visión gene...

Discusión

Este protocolo proporciona una evaluación inmunológica in vivo de los EV derivados de células de melanoma bajo estrés inducido por la quimioterapia mientras se adapta a los EV emitidos por varios cánceres bajo diversos tratamientos. La inmunización de ratones con EV derivados de células B16-OVA tratadas con oxaliplatino, por ejemplo, expande las células T CD8 ⁺ productoras de IFN-γ en el bazo, que se estimulan aún más mediante la incubación ex vivo con ovoalbúmina, lo que indica ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-CD3 FITC	Biolegend	100204	Clone 17A2
Anti-CD4 PacBlue	Biolegend	100428	Clone GK1.5
Anti-CD8 APC	Biolegend	100712	Clone 53-6.7
Anti-IFNγ PE	eBioscience	RM90022	Clone XMG1.2
Brefeldin A	Biolegend	420601	Brefeldin A Solution (1,000x)
Cell Strainer, 100 µm	Greiner	542000	EASYstrainer 100 µm
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429	Dulbecco's Modified Eagle's Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM)
FBS Good Forte	PAN BIOTECH	P40-47500	Fetal Calf Serum (FCS)
Fixable Viability Dye eFluor 506	eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific	65-0866-14
Fixation/Permeabilization Concentrate	eBioscience	00-5123-43	Fixation/Permeabilization Concentrate (10x)
Fixation/Permeabilization Diluent	eBioscience	00-5223-56
Ionomycin	Sigma-Aldrich	407952	From Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1, ≥ 97% (HPLC)
L-Glutamine	Gibco	25030-032	L-Glutamine (200 mM)
Ovalbumin	InvivoGen	vac-pova	Ovalbumine with < 1 EU/mg endotoxin - CAS 9006-59-1
Oxaliplatin	Pharmacy of MRI hospital
PBS	Sigma-Aldrich	D8537	Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride
Penicillin-Streptomycin	Gibco	1514-122	Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL)
PMA	Sigma-Aldrich	P1585	Phorbol 12-myristate 13-acetate, ≥ 99% (HPLC)
PVDF filter, 0,22 µm, for syringes	Merck Millipore	SLGV033RS	Millex-GV Filter Unit 0.22 µm Durapore PVDF Membrane
Red Blood Cell Lysis Buffer	Invitrogen	00-4333-57
RPMI 1640	Thermo Fischer Scientific	11875	Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES
Syringe, 26 G	BD Biosciences	305501	1 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm)
Total Exosome Isolation Reagent	Invitrogen	4478359	For isolation from cell culture media
β-Mercaptoethanol	Thermo Fischer Scientific	31350	β-Mercaptoethanol (50 mM)