In vivo Triagem de imunogenicidade de vesículas extracelulares derivadas do tumor por citometria de fluxo de células T esplênicas

Resumo

Este manuscrito descreve como avaliar a imunogenicidade in vivo de vesículas extracelulares derivadas de células tumorais (EVs) usando citometria de fluxo. Os EVs derivados de tumores submetidos à morte de células imunogênicas induzidas pelo tratamento parecem particularmente relevantes na imunossuperveiência tumoral. Este protocolo exemplifica a avaliação dos EVs de tumor imunoestimulatório induzidos por oxaliplatina, mas pode ser adaptado a várias configurações.

Resumo

A morte de células imunogênicas de tumores, causada por quimioterapia ou irradiação, pode desencadear respostas de células T específicas do tumor, liberando padrões moleculares associados ao perigo e induzindo a produção de interferon tipo I. As imunoterapias, incluindo a inibição do ponto de verificação, dependem principalmente de células T específicas do tumor pré-existentes para desdobrar um efeito terapêutico. Assim, abordagens terapêuticas sinérgicas que exploram a morte celular imunogênica como uma vacina anticânclica intrínseca podem melhorar sua capacidade de resposta. No entanto, o espectro de fatores imunogênicos liberados pelas células sob estresse induzido pela terapia permanece incompletamente caracterizado, especialmente no que se refere às vesículas extracelulares (EVs). EVs, partículas membranous nano-escala emitidas de praticamente todas as células, são consideradas para facilitar a comunicação intercelular e, no câncer, têm sido mostrados para mediar o cross-priming contra antígenos tumorais. Para avaliar o efeito imunogênico dos EVs derivados de tumores em várias condições, são procurados métodos adaptáveis, escaláveis e válidos. Portanto, aqui é apresentada uma abordagem relativamente fácil e robusta para avaliar a imunogenicidade in vivo dos EVs. O protocolo baseia-se na análise da citometria de fluxo de células T esplênicas após a imunização in vivo de camundongos com EVs, isolada por ensaios baseados em precipitação de culturas de células tumorais sob terapia ou condições de estado estável. Por exemplo, este trabalho mostra que a exposição à oxaliplatina de células de melanoma murina B16-OVA resultou na liberação de EVs imunogênicos que podem mediar a ativação de células T citotóxicas tumorais reativas. Assim, a triagem de EVs via imunização in vivo e citometria de fluxo identifica condições nas quais os EVs imunogênicos podem surgir. Identificar condições de liberação de EV imunogênico fornece um pré-requisito essencial para testar a eficácia terapêutica dos EVs contra o câncer e explorar os mecanismos moleculares subjacentes para, finalmente, revelar novas percepções sobre o papel dos EVs na imunologia do câncer.

Introdução

O sistema imunológico desempenha um papel fundamental na luta contra o câncer, tanto quando incitado pela inibição do ponto de verificação imunológica quanto pela eficácia das terapias convencionais contra o câncer. Células tumorais sucumbindo a terapias genoóxicas como os agentes quimioterápicos oxaliplatina e doxorubicina, ou tratamento de radiação ionizante podem liberar antígenos e padrões moleculares associados ao perigo (DAMPs) que potencialmente iniciam uma resposta imune anti-tumor ^adaptativa1. Os DAMPs mais proeminentes, no contexto da morte das células imunogênicas, incluem sinais de achado-me, como o ATP chemotactic, sinais eat-me, como a exposição da calreticulina, que promove a captação de células tumorais por células que apresentam antígenos, e a liberação de HMGB1, que ativa receptores de reconhecimento de padrões, aumentando assim a apresentação cruzada de antígenos ^tumorais2. Além disso, os interferons tipo I (IFN-I), induzidos através de ácidos nucleicos imunogênicos derivados do tumor ou outros estímulos, são sentidos por células dendríticas, permitindo-lhes efetivamente prime células T citotóxica específicas do ^tumor3,4. Clinicamente, as células T CD8⁺ ativadas e proliferadas infiltradas no tumor fornecem um fator prognóstico independente para a sobrevivência prolongada em muitos pacientes com câncer. Liberadas dessas células T ativadas, o IFN-γ media efeitos antiproliferativos diretos nas células cancerosas e impulsiona a polarização th1 e a diferenciação de células T citotóxica, contribuindo assim para uma imunossulusão eficaz contra o ^câncer5,6. Oxaliplatin é um indutor de morte de células imunogênicas de boa fé, mediando tal resposta imune adaptativa contra o ^câncer7. No entanto, a infinidade de sinais imunogênicos iniciais liberados pelas células tumorais sob estresse induzido pela terapia continua a ser totalmente revelada. Apesar dos avanços significativos na imunoterapia contra o câncer, expandir seus benefícios para uma parcela maior de pacientes continua sendo um desafio. Uma compreensão mais detalhada dos sinais imunogênicos que iniciam a ativação de células T pode guiar o desenvolvimento de novas terapias.

Um grupo heterogêneo de estruturas fechadas por membrana, conhecidos como vesículas extracelulares (EVs), parecem servir como dispositivos de comunicação intercelulares. Emitidos por praticamente todos os tipos de células, os EVs carregam proteínas funcionais, RNA, DNA e outras moléculas para uma célula receptora ou podem alterar o estado funcional de uma célula apenas por ligação aos receptores na superfície celular. Sua carga biologicamente ativa varia significativamente pelo tipo e estado funcional da célula ^geradora8. Na imunologia do câncer, os EVs liberados das células tumorais têm sido predominantemente considerados contraditórios à imunoterapia porque eventualmente promovem o crescimento invasivo, nichos metastáticos pré-formados9 e suprimem a resposta ^imune10. Em contraste, alguns estudos têm demonstrado que os EVs podem transferir antígenos tumorais para células dendríticas para uma efetiva apresentação ^cruzada11,12. Os EVs podem fornecer ácidos nucleicos imunostimulatórios se surgirem sob estresse induzido pela terapia, facilitando uma resposta imune ^{anti-tumor13,14}. A detecção de tais ligantes imunológicos inatos de RNA e DNA no microambiente tumoral tem sido recentemente demonstrada para modular a responsividade ao bloqueio de ponto de verificação significativamente15,16,17. Assim, o papel imunogênico dos EVs liberados pelas células tumorais sob diferentes estresse induzidos pela terapia precisa ser ainda mais elucidado. Uma vez que os EVs constituem um campo jovem, mas crescente de pesquisa, a padronização dos métodos ainda está em curso. Portanto, compartilhar conhecimento é essencial para melhorar a reprodutibilidade da pesquisa nas interações entre EVs e imunologia do câncer. Com isso em mente, este manuscrito descreve um protocolo simples para avaliar o efeito imunogênico dos EVs derivados do tumor in vivo.

Essa avaliação é realizada através da geração de EVs derivados do tumor, imunizando camundongos receptores com esses EVs e analisando células T esplênicas através da citometria de fluxo. A geração EV é idealmente realizada pela semeadura de células tumorais murinas em um meio de cultura celular livre de EV para um alto grau de pureza. As células são tratadas com um estímulo específico de estresse celular, como a quimioterapia, para comparar o efeito de EVs induzidos por terapia com a imunogenicidade da linha de base dos respectivos EVs derivados do tumor. O isolamento dos EVs pode muito bem ser realizado por diversas técnicas que devem ser selecionadas de acordo com a aplicabilidade in vivo e disponibilidade local. O protocolo a seguir descreve um ensaio baseado em precipitação com um kit comercial para purificação de EV. Os ratos são imunizados duas vezes com esses EVs. Quatorze dias após a primeira injeção, as células T são extraídas do baço e analisadas para produção de ifn-γ através de citometria de fluxo para avaliar uma resposta imune sistêmica. Com isso, o potencial de EVs derivados do tumor, emergindo sob diferentes regimes terapêuticos, para induzir respostas células T anti-tumor é avaliado relativamente facilmente, rapidamente e com alta ^validade13. Portanto, este método é adequado para um rastreamento imunológico de EVs derivados de células cancerosas em várias condições.

Protocolo

No início dos experimentos, os camundongos tinham pelo menos 6 semanas de idade e eram mantidos em condições específicas sem patógenos. O presente protocolo está em conformidade com os padrões éticos institucionais e as regulamentações locais vigentes. Estudos em animais foram aprovados pela agência reguladora local (Regierung von Oberbayern, Munique, Alemanha). Possíveis vieses relacionados ao sexo não foram investigados nestes estudos.

1. Geração e isolamento de EVs derivados de células tumorais após exposição à quimioterapia

1. Cultura murine B16 células de melanoma expressando ovalbumina (B16-OVA) em DMEM (contendo 4 mM L-glutamina e 4,5 g/L D-glicose) suplementadas com FCS (10% v/v), penicilina (100 Unidades/mL) e estreptomicina (100 μg/mL) a 37 °C, até que as células cresçam constantemente e sejam aproximadamente 90% confluentes.
   NOTA: Realize esta seção do protocolo inteiramente em condições estéreis usando uma capa de cultura celular. Para análise de outras entidades cancerígenas, as linhas celulares que expressam um antígeno potente são preferíveis para avaliar respostas de células T específicas de antígeno, pois permitem a ressarcimento específico de antígeno ex vivo .
2. Para preparar a mídia de cultura celular necessária para a geração EV, esgotar os EVs bovinos dentro do FCS por ultracentrifugação a 100.000 x g por 24 h a 4 °C e, em seguida, descartar a pelota. Alternativamente, escolha uma preparação comercial baixa em EVs animais com antecedência.
3. Colher células B16-OVA e lavá-las duas vezes em PBS e, em seguida, sementes em uma concentração de 400.000 células/mL em mídia esgotada por EV.
   NOTA: Adapte a concentração celular à dinâmica de crescimento da linha celular sob investigação para que as células não cresçam demais.
4. Trate as células B16-OVA adicionando 30 μg de oxaliplatina por mL e incubar por 24 h a 37 °C. Deixe as condições de controle sem tratamento. No primeiro uso de uma substância genotoxica, titula a eficácia citotóxica desejada usando ensaios de viabilidade celular, como a exclusão azul ^trypan18.
   NOTA: Este ensaio também pode avaliar EVs gerados em culturas celulares tratadas com outras substâncias imunode moduladoras ou irradiação ionizante além da quimioterapia.
   ATENÇÃO: A oxaliplatina causa irritação cutânea e grave nos olhos e pode causar uma reação alérgica da pele e irritação respiratória. Oxaliplatin é suspeita de causar câncer. Como precaução, use equipamentos de proteção individual, incluindo luvas adequadas, óculos, máscaras e roupas, limpos antes de reutilizar. Evite a inalação e lave bem as mãos após o manuseio. Evite a liberação no ambiente e descarte a oxaliplatina de acordo com as normas vigentes. Obtenha informações detalhadas da ficha de dados de segurança.
5. Colecione a cultura celular supernascida. Centrifugar primeiro a 400 x g para 5 min a 4 °C, e depois a 2.000 x g por 30 min a 4 °C, cada vez descartando a pelota. Por fim, filtrar através de uma membrana PVDF de 220 nm. Use um tubo fresco para cada passo para remover qualquer detrito celular.
   NOTA: Nesta fase, o supernanato contendo EV pode ser armazenado a 4 °C por um dia antes de retomar o protocolo. No entanto, é fortemente recomendável aderir ao cronograma descrito com purificação imediata do EV.
6. Misture 1 mL de supernasal com 0,5 mL de um reagente de isolamento exosome disponível comercialmente específico (ver Tabela de Materiais) em um tubo em forma de V de 1,5 mL. Pipeta completamente para cima e para baixo ou vórtice para criar uma solução homogênea. Incubar durante a noite a 4 °C.
7. Centrifugar a 10.000 x g por 60 min a 4 °C. Descarte cuidadosamente o supernatante. Remova as gotas restantes tocando o tubo de 1,5 mL de cabeça para baixo em uma toalha de papel e por aspiração através de uma pipeta com uma ponta fina sem tocar na eV-pellet na parte inferior.
   1. Remova completamente todos os fluidos para evitar a diluição descontrolada da ev-pelota. Além disso, execute essas tarefas rapidamente para evitar que a pelota seque.
8. Resuspenque os EVs em PBS frios, escoando para cima e para baixo sem arranhar a pelota da parede do tubo com a ponta. Agora, transfira a suspensão passo a passo do primeiro para o último tubo para agrupar os EVs.
   NOTA: Use um volume de PBS que equivale a 5 μL multiplicado pelo número de tubos. 5 μL da suspensão final contém os EVs isolados liberados de 400.000 células sob quimioterapia ou em estado estável.
9. De preferência, use EVs diretamente. Se isso não for possível, armazene as suspensões de EV a -80 °C em vasos siliconizados por até 28 dias até a aplicação.
   NOTA: Os EVs descritos aqui e em várias outras publicações não perdem sua respectiva função biológica quando armazenados a -80 °C para esse ^período19.
10. Quantificar e caracterizar isolados de EV de acordo com as diretrizes do MISEV201820.
    NOTA: Os métodos possíveis de quantificação incluem a análise de rastreamento de nanopartículas (NTA)²¹ e a detecção de proteínas ligadas à membrana ^{do EV22}. As possíveis abordagens para caracterizar ainda mais os EVs incluem microscopia ^{eletrônica23} e mancha ^ocidental20.

2. Imunização de camundongos com EVs

1. Planeje o experimento in vivo com camundongos C57BL/6 (ou outros camundongos síngênicos correspondentes à linha celular tumoral), incluindo grupos de tratamento que recebem EVs derivados de células tratadas, células não tratadas e PBS (veículo), respectivamente.
   NOTA: De preferência, use camundongos com idades entre 6 e 8 semanas para evitar que a senescência fisiológica diminua a resposta ^imune24.
2. Misture 5 μL de suspensão EV com PBS frio de 55 μL para cada rato dentro do respectivo grupo de tratamento para imunizá-lo com EVs isolados de células 4.0 x ¹⁰⁵ B16-OVA.
   NOTA: Esta quantidade de EVs corresponde a aproximadamente 2 x ¹⁰⁹ partículas medidas pela análise de rastreamento de nanopartículas (dados não mostrados). A proteína OVA misturada com um adjuvante (por exemplo, LPS) pode ser aplicada como um potente controle positivo de vacina.
   1. Encha as seringas (tamanho da agulha 26-30 G) com 60 μL dos EVs diluídos ou PBS, respectivamente e colocados imediatamente no gelo.
      NOTA: No protocolo, a quantidade de EVs injetados é normalizada para o número de células tumorais que liberam EV para considerar experimentalmente efeitos qualitativos e quantitativos da oxaliplatina na biogênese do EV das células tumorais. Para alguns leitores, a normalização a uma concentração específica de EVs produzidos pode se encaixar melhor em sua configuração experimental, dependendo de sua questão científica.
3. Inocular EVs ou PBS subcutânea no aspecto medial da coxa do camundongo e repetir a imunização após 7 dias. Quatorze dias após o primeiro tratamento, sacrificam camundongos, por exemplo, por luxação cervical para analisar a resposta imune.
   NOTA: Podem ser utilizadas rotas alternativas de injeção subcutânea, de acordo com as normas locais.

3. Análise da citometria de fluxo de células T esplênicas

1. Preparar e refrescare rpmi completo (cRPMI), suplementando RPMI-1640 com FCS (10% v/v), penicilina (100 Unidades/mL), estreptomicina (100 μg/mL), L-glutamina (2 mM) e β-mercaptoethanol (50 μM).
2. Ressectar o baço da cavidade abdominal aberta. Amasse o baço com um coador celular umedecido de 100 μm e o êmbolo plástico de uma seringa e lave as células esplênicas em um tubo de 50 mL com 5-10 mL de cRPMI. Centrifugar a 400 x g por 5 min a 4 °C e descartar o supernatante.
   NOTA: Mantenha as células no gelo sempre que possível. Para analisar o local em vez da resposta imune esplênica, ressecência os linfonodos popliteal e inguinal drinais, seguindo o mesmo protocolo. Neste caso, pule o próximo passo para a lise dos eritrócitos.
3. Para remover os eritrócitos da suspensão celular, resuspense a pelota com 2 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (ver Tabela de Materiais) e incubar por 5 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, pare a reação adicionando cRPMI. Centrifugar a 400 x g por 5 min a 4 °C e descartar o supernatante.
4. Para semeadura, resuspenque a pelota celular em cRPMI e conte as células para colocar triplicados de 200.000 células com 200 μL cRPMI em cada poço, usando uma placa de 96 poços com um fundo em forma de U. Incubar por 48 h a 37 °C.
   NOTA: Para abordar a especificidade do antígeno das células T ativadas, adicione 1 μg/mL de ovalbumina solúvel (ou outro antígeno tumoral correspondente à linha celular sob investigação) ou deixe sem estímulo adicional, respectivamente. Adicionar o epítope de peptídeo imune-dominante SIINFEKL, em vez de ovalbumina de comprimento completo, permite um período de incubação mais curto. Além da citometria de fluxo, o soro dos camundongos e a cultura celular supernascida após 48 h de incubação podem ser analisados para várias citocinas.
5. Após 48 h, para melhorar a coloração intracelular ifn-γ por, entre outros, bloquear a secreção mediada por Golgi de proteínas, adicionar Brefeldin A (5 ng/mL), PMA (20 ng/mL) e Ionomicina (1 μg/mL) à cultura celular. Incubar por 4h a 37 °C.
6. Antes de coloriar biomarcadores de superfície, transfira esplenócitos para uma placa de 96 poços com um fundo em forma de V e lave duas vezes com PBS. Em seguida, adicione anticorpos fluorescentes, compatíveis com o címetro de fluxo disponível localmente, direcionado contra biomarcadores de superfície, CD3, CD8 e CD4 (ver Tabela de Materiais), diluídos 1:400, além de um corante de viabilidade fixável, diluído 1:1.000 em PBS. Esplenócitos de pelotização resuspend na solução de coloração e incubar por 30 min a 4 °C, protegidos da luz.
7. Para fixação e permeabilização de esplenócitos, lave duas vezes no tampão FACS (PBS mais 3% v/v FCS) e, em seguida, resuspend em 100 μL de buffer de fixação/permeabilização (ver Tabela de Materiais) por poço. Incubar por 30 min a 4 °C, protegido contra a luz.
8. Para coloração de IFN-γ intracelular, lave os esplenócitos no tampão de fixação/permeabilização e resuspend com anticorpos fluorescentes contra ifn-γ, diluído 1:200 no buffer. Incubar por pelo menos 1h (até máxima de 12h) a 4 °C, protegido contra a luz.
9. Antes de medir as amostras por citometria de fluxo, lave os esplenócitos duas vezes no buffer de fixação/permeabilização e resuspenco em FACS-buffer. Analise a ativação de células T citotóxica de acordo com a estratégia de gating exibida na Figura 2.
   1. Primeiro, para detectar células únicas, borrar FSC-H contra FSC-A. Em seguida, para detectar células linfoides, borre SSC contra FSC-A. Posteriormente, selecione células T vivas CD3⁺, ^CD4,CD8+ e determine seu subconjunto de produção de IFN γ para quantificar a ativação de células T citotóxica no baço.
      NOTA: Inclua uma mancha de Fluorescência-menos-um (FMO) com todos os fluorochromes, exceto o fluorocromo direcionado contra IFN-γ como controle técnico negativo.

Resultados

Este protocolo visa facilitar a avaliação simples e facilmente reprodutível da imunogenicidade dos EVs derivados do tumor. Por meio deste, os camundongos são inoculados com EVs derivados de culturas in vitro de células tumorais expressando o modelo de frango de antígeno ovalbumina (OVA). A resposta imune subsequente é analisada em células T esplênicas através da citometria de fluxo.

A Figura 1 dá uma visão geral das etapas práticas d...

Discussão

Este protocolo fornece uma avaliação imunológica in vivo de EVs derivados de células de melanoma sob estresse induzido pela quimioterapia, adaptando-se aos EVs emitidos de vários cânceres sob vários tratamentos. Imunizar camundongos com EVs derivados de células B16-OVA tratadas com oxaliplatina, por exemplo, expande as células CD8⁺ T produtoras de IFN γ no baço, que são ainda mais estimuladas pela incubação ex vivo com abumina oval, indicando uma resposta imune específica para ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-CD3 FITC	Biolegend	100204	Clone 17A2
Anti-CD4 PacBlue	Biolegend	100428	Clone GK1.5
Anti-CD8 APC	Biolegend	100712	Clone 53-6.7
Anti-IFNγ PE	eBioscience	RM90022	Clone XMG1.2
Brefeldin A	Biolegend	420601	Brefeldin A Solution (1,000x)
Cell Strainer, 100 µm	Greiner	542000	EASYstrainer 100 µm
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429	Dulbecco's Modified Eagle's Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM)
FBS Good Forte	PAN BIOTECH	P40-47500	Fetal Calf Serum (FCS)
Fixable Viability Dye eFluor 506	eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific	65-0866-14
Fixation/Permeabilization Concentrate	eBioscience	00-5123-43	Fixation/Permeabilization Concentrate (10x)
Fixation/Permeabilization Diluent	eBioscience	00-5223-56
Ionomycin	Sigma-Aldrich	407952	From Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1, ≥ 97% (HPLC)
L-Glutamine	Gibco	25030-032	L-Glutamine (200 mM)
Ovalbumin	InvivoGen	vac-pova	Ovalbumine with < 1 EU/mg endotoxin - CAS 9006-59-1
Oxaliplatin	Pharmacy of MRI hospital
PBS	Sigma-Aldrich	D8537	Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride
Penicillin-Streptomycin	Gibco	1514-122	Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL)
PMA	Sigma-Aldrich	P1585	Phorbol 12-myristate 13-acetate, ≥ 99% (HPLC)
PVDF filter, 0,22 µm, for syringes	Merck Millipore	SLGV033RS	Millex-GV Filter Unit 0.22 µm Durapore PVDF Membrane
Red Blood Cell Lysis Buffer	Invitrogen	00-4333-57
RPMI 1640	Thermo Fischer Scientific	11875	Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES
Syringe, 26 G	BD Biosciences	305501	1 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm)
Total Exosome Isolation Reagent	Invitrogen	4478359	For isolation from cell culture media
β-Mercaptoethanol	Thermo Fischer Scientific	31350	β-Mercaptoethanol (50 mM)