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Neste Artigo

  • Resumo
  • Resumo
  • Introdução
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Este manuscrito descreve como avaliar a imunogenicidade in vivo de vesículas extracelulares derivadas de células tumorais (EVs) usando citometria de fluxo. Os EVs derivados de tumores submetidos à morte de células imunogênicas induzidas pelo tratamento parecem particularmente relevantes na imunossuperveiência tumoral. Este protocolo exemplifica a avaliação dos EVs de tumor imunoestimulatório induzidos por oxaliplatina, mas pode ser adaptado a várias configurações.

Resumo

A morte de células imunogênicas de tumores, causada por quimioterapia ou irradiação, pode desencadear respostas de células T específicas do tumor, liberando padrões moleculares associados ao perigo e induzindo a produção de interferon tipo I. As imunoterapias, incluindo a inibição do ponto de verificação, dependem principalmente de células T específicas do tumor pré-existentes para desdobrar um efeito terapêutico. Assim, abordagens terapêuticas sinérgicas que exploram a morte celular imunogênica como uma vacina anticânclica intrínseca podem melhorar sua capacidade de resposta. No entanto, o espectro de fatores imunogênicos liberados pelas células sob estresse induzido pela terapia permanece incompletamente caracterizado, especialmente no que se refere às vesículas extracelulares (EVs). EVs, partículas membranous nano-escala emitidas de praticamente todas as células, são consideradas para facilitar a comunicação intercelular e, no câncer, têm sido mostrados para mediar o cross-priming contra antígenos tumorais. Para avaliar o efeito imunogênico dos EVs derivados de tumores em várias condições, são procurados métodos adaptáveis, escaláveis e válidos. Portanto, aqui é apresentada uma abordagem relativamente fácil e robusta para avaliar a imunogenicidade in vivo dos EVs. O protocolo baseia-se na análise da citometria de fluxo de células T esplênicas após a imunização in vivo de camundongos com EVs, isolada por ensaios baseados em precipitação de culturas de células tumorais sob terapia ou condições de estado estável. Por exemplo, este trabalho mostra que a exposição à oxaliplatina de células de melanoma murina B16-OVA resultou na liberação de EVs imunogênicos que podem mediar a ativação de células T citotóxicas tumorais reativas. Assim, a triagem de EVs via imunização in vivo e citometria de fluxo identifica condições nas quais os EVs imunogênicos podem surgir. Identificar condições de liberação de EV imunogênico fornece um pré-requisito essencial para testar a eficácia terapêutica dos EVs contra o câncer e explorar os mecanismos moleculares subjacentes para, finalmente, revelar novas percepções sobre o papel dos EVs na imunologia do câncer.

Introdução

O sistema imunológico desempenha um papel fundamental na luta contra o câncer, tanto quando incitado pela inibição do ponto de verificação imunológica quanto pela eficácia das terapias convencionais contra o câncer. Células tumorais sucumbindo a terapias genoóxicas como os agentes quimioterápicos oxaliplatina e doxorubicina, ou tratamento de radiação ionizante podem liberar antígenos e padrões moleculares associados ao perigo (DAMPs) que potencialmente iniciam uma resposta imune anti-tumor adaptativa1. Os DAMPs mais proeminentes, no contexto da morte das células imunogênicas, incluem sinais de achado-me, como o ATP chemotactic, sinais eat-me, c....

Protocolo

No início dos experimentos, os camundongos tinham pelo menos 6 semanas de idade e eram mantidos em condições específicas sem patógenos. O presente protocolo está em conformidade com os padrões éticos institucionais e as regulamentações locais vigentes. Estudos em animais foram aprovados pela agência reguladora local (Regierung von Oberbayern, Munique, Alemanha). Possíveis vieses relacionados ao sexo não foram investigados nestes estudos.

1. Geração e isolamento de EVs derivados de células tumorais após exposição à quimioterapia

  1. Cultura murine B16 células de melanoma expressando ovalbumina (B16-OVA) em DMEM (contendo 4 mM L-glutami....

Resultados

Este protocolo visa facilitar a avaliação simples e facilmente reprodutível da imunogenicidade dos EVs derivados do tumor. Por meio deste, os camundongos são inoculados com EVs derivados de culturas in vitro de células tumorais expressando o modelo de frango de antígeno ovalbumina (OVA). A resposta imune subsequente é analisada em células T esplênicas através da citometria de fluxo.

A Figura 1 dá uma visão geral das etapas práticas d.......

Discussão

Este protocolo fornece uma avaliação imunológica in vivo de EVs derivados de células de melanoma sob estresse induzido pela quimioterapia, adaptando-se aos EVs emitidos de vários cânceres sob vários tratamentos. Imunizar camundongos com EVs derivados de células B16-OVA tratadas com oxaliplatina, por exemplo, expande as células CD8+ T produtoras de IFN γ no baço, que são ainda mais estimuladas pela incubação ex vivo com abumina oval, indicando uma resposta imune específica para .......

Divulgações

Os autores declaram que não há conflito de interesses.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundação alemã de pesquisa) - Projektnummer 360372040 - SFB 1335 e Projektnummer 395357507 - SFB 1371 (para H.P.), uma Bolsa de Pesquisa Mechtild Harf do DKMS Foundation for Giving Life (to H.P.) a Young Investigator Award pela Melanoma Research Alliance (to S.H.), uma bolsa de estudos do Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (para F.S.), um Fundo semente pela Universidade Técnica de Munique (para S.H.) e uma bolsa de pesquisa da Fundação Wilhelm Sander (2021.041.1, para S.H.). O H. P. é apoiado pelo Programa de Jovens Investigadores da EMBO.

CONTRIBUIÇÕES AUTORAIS:

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-CD3 FITCBiolegend100204Clone 17A2
Anti-CD4 PacBlueBiolegend100428Clone GK1.5
Anti-CD8 APCBiolegend100712Clone 53-6.7
Anti-IFNγ PEeBioscienceRM90022Clone XMG1.2
Brefeldin ABiolegend420601Brefeldin A Solution (1,000x)
Cell Strainer, 100 µmGreiner542000EASYstrainer 100 µm
DMEMSigma-AldrichD6429Dulbecco's Modified Eagle's Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM)
FBS Good FortePAN BIOTECHP40-47500Fetal Calf Serum (FCS)
Fixable Viability Dye eFluor 506eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific65-0866-14
Fixation/Permeabilization ConcentrateeBioscience00-5123-43Fixation/Permeabilization Concentrate (10x)
Fixation/Permeabilization DiluenteBioscience00-5223-56
IonomycinSigma-Aldrich407952From Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1, ≥ 97% (HPLC)
L-GlutamineGibco25030-032L-Glutamine (200 mM)
OvalbuminInvivoGenvac-povaOvalbumine with < 1 EU/mg endotoxin - CAS 9006-59-1
OxaliplatinPharmacy of MRI hospital
PBSSigma-AldrichD8537Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride
Penicillin-StreptomycinGibco1514-122Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL)
PMASigma-AldrichP1585Phorbol 12-myristate 13-acetate, ≥ 99% (HPLC)
PVDF filter, 0,22 µm, for syringesMerck MilliporeSLGV033RSMillex-GV Filter Unit 0.22 µm Durapore PVDF Membrane
Red Blood Cell Lysis BufferInvitrogen00-4333-57
RPMI 1640Thermo Fischer Scientific11875Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES
Syringe, 26 GBD Biosciences3055011 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm)
Total Exosome Isolation ReagentInvitrogen4478359For isolation from cell culture media
β-MercaptoethanolThermo Fischer Scientific31350β-Mercaptoethanol (50 mM)

Referências

  1. Kroemer, G., Galluzzi, L., Kepp, O., Zitvogel, L. Immunogenic cell death in cancer therapy. Annual Review of Immunology. 31, 51-72 (2013).
  2. Kepp, O., et al. Consensus guidelines for the detection of immunogenic cell death.

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