离体视网膜组织样品中线粒体呼吸和糖酵解的测定

摘要

这里描述的是使用商用生物分析仪在 离体 视网膜组织样品中进行线粒体应激测定和糖酵解速率测定的详细方案。

摘要

线粒体呼吸是所有细胞中产生能量的关键途径，尤其是具有高度活跃代谢的视网膜光感受器。此外，光感受器还像癌细胞一样表现出高需氧糖酵解。这些代谢活动的精确测量可以为生理条件下和疾病状态下的细胞稳态提供有价值的见解。已经开发了基于微孔板的高通量测定法，用于测量活细胞中的线粒体呼吸和各种代谢活动。然而，其中绝大多数是为培养细胞开发的，尚未针对完整组织样品和 离体应用进行优化。这里描述的是详细的分步方案，使用基于微孔板的荧光技术，直接测量作为线粒体呼吸指标的耗氧率（OCR），以及细胞外酸化速率（ECAR）作为糖酵解的指标，在完整的 离体 视网膜组织中。该方法已被用于成功评估成年小鼠视网膜的代谢活动，并证明其在研究衰老和疾病的细胞机制中的应用。

引言

线粒体是必不可少的细胞器，通过协调多个关键的生理过程来调节细胞代谢、信号传导、稳态和细胞凋亡¹。线粒体是细胞中通过氧化磷酸化（OXPHOS）产生三磷酸腺苷（ATP）的动力源，并提供支持几乎所有细胞事件的能量。大多数细胞氧在线粒体中代谢，在有氧呼吸过程中，它作为电子传递链（ETC）中的最终电子受体。细胞质基质中的糖酵解也可以产生低量的ATP，其中葡萄糖转化为丙酮酸盐，丙酮酸盐可以进一步转化为乳酸盐或转运到线粒体中并氧化成乙酰辅酶A，乙酰辅酶A是三羧酸循环（TCA循环）中的底物。

视网膜是哺乳动物中代谢活性最高的组织之一²，具有高水平的线粒体呼吸和极高的耗氧量³。视杆细胞和视锥体光感受器含有高密度的线粒体⁴，OXPHOS在视网膜中产生大多数^ATP5。此外，视网膜还严重依赖需氧糖酵解^6，7，通过将葡萄糖转化为乳酸⁵。线粒体缺陷与各种神经退行性疾病有关^8，9;由于其独特的高能量需求，视网膜特别容易受到代谢缺陷的影响，包括影响线粒体OXPHOS4和糖酵解¹⁰的代谢缺陷。线粒体功能障碍和糖酵解缺陷与视网膜^11、12 和黄斑¹³ 退行性疾病、年龄相关性黄斑变性^{10、14、15、16} 和糖尿病视网膜病变^17、18 有关。因此，线粒体呼吸和糖酵解的准确测量可以为评估视网膜的完整性和健康状况提供重要参数。

线粒体呼吸可以通过测定耗氧率（OCR）来测量。鉴于葡萄糖转化为丙酮酸盐并随后转化为乳酸盐导致质子挤出到细胞外环境中并酸化，细胞外酸化速率（ECAR）的测量提供了糖酵解通量的指示。由于视网膜由具有亲密关系和积极协同作用的多种细胞类型组成，包括底物的交换⁶，因此必须在整个视网膜组织具有完整层压和电路的背景下分析线粒体功能和新陈代谢。在过去的几十年中，Clark型_O2 电极和其他氧微电极已被用于测量视网膜中的氧气消耗^19，20，21。这些氧电极在灵敏度、大样品体积要求以及需要连续搅拌悬浮样品方面具有重大局限性，这通常会导致细胞和组织环境的破坏。这里描述的方案是使用基于微孔板的荧光技术开发的，用于测量新鲜解剖 的离体 小鼠视网膜组织中的线粒体能量代谢。它允许使用 离体 视网膜组织的小样品（1 mm冲孔）同时对OCR和ECAR进行中等通量实时测量，同时避免悬浮和连续搅拌。

这里演示的是线粒体应激测定和糖酵解速率测定在新鲜解剖的视网膜打孔盘上的实验程序。该协议允许在 离体 组织环境中测量线粒体相关的代谢活动。与使用培养细胞进行的测定不同，此处获得的读数反映了组织水平上的组合能量代谢，并受到组织内不同细胞类型之间相互作用的影响。该协议从先前发布的版本^22，23 进行了修改，以适应新一代带有胰岛捕获板的安捷伦海马细胞外通量24孔（XFe24）分析仪。检测培养基、注射化合物浓度和检测周期的次数/持续时间也针对视网膜组织进行了优化。给出了制备视网膜打孔盘的详细分步方案。有关程序设置和数据分析的更多信息可以从制造商的用户指南^24，25，26获得。

研究方案

所有小鼠方案均由国家眼科研究所动物护理和使用委员会（NEI ASP# 650）批准。将小鼠饲养在12小时的明暗条件下，并按照《实验动物护理和使用指南》、实验动物资源研究所和《关于实验动物人道护理和使用的公共卫生服务政策》的建议进行护理。

1. 补水传感器墨盒及测定介质的制备

1. 在实验前一天，向实用板的每个孔中加入1mL校准培养基。将液压助推器盖放在顶部，然后通过盖板上的开口降低传感器盒。检查以确保传感器浸没在校准介质中。将传感器盒在37°C的无_CO2培养箱中孵育过夜以激活荧光团。
   注意:为防止蒸发，培养箱通过在里面放一盘水来加湿，并用透明的保鲜膜包裹传感器盒盒。
2. 通过将葡萄糖，丙酮酸盐和谷氨酰胺加入所需浓度的海马DMEM培养基来重建测定培养基。在本文中报道的测定中，测定介质中底物的最终浓度为:6mM葡萄糖，0.12mM丙酮酸盐和0.5mM谷氨酰胺。对于每个测定板，在实验当天新鲜制备40mL测定培养基。
3. 按照制造商的说明在分析仪中设置测定程序²⁶。在这里演示的测定中，协议设置如下:基线测量5个周期，然后注入端口A，然后是4个测量周期，然后注入端口B，然后是4个测量周期。每个周期由混合（3分钟），等待（2分钟）和测量（3分钟）组成。

2. 胰岛捕获微孔板的涂层网状插入物

1. 通过将20μL细胞附着培养基（例如Cell-Tak）与171μL0.1M碳酸氢钠和9μL1M NaOH混合来制备包衣混合物。
2. 打开包含网状嵌件的盒式磁带的盖子。将8μL包衣混合物移液到每个网格插入物中。使用移液器吸头轻轻涂抹/涂抹液滴，使涂层混合物均匀地分布在整个网状嵌件中。
3. 关闭盒，让网状嵌件在室温下孵育至少25分钟以进行吸附。
4. 通过将4mL测定介质直接移液到网状插入物上来洗涤网状插入物。轻轻摇动凝胶盒，确保所有网状插入物都用测定介质洗涤。
5. 将网状嵌件放在一边。它已准备就绪，可供使用。

3. 制备注射剂

1. 从-80°C冰箱中取出Bam15（10mM），鱼藤酮（10mM），抗霉素A（10mM）和2-DG（500mM）的库存等分试样，并在室温下解冻。
   注:2-DG 库存已准备就绪，可供使用。其他药物需要稀释到工作库存。
2. 在37°C水浴中加热10mL测定培养基。
3. 使用两步稀释程序将10mM Bam15储备液稀释至50μM工作储备:将20μL10mM储备液与20μLDMSO混合，得到5mM中间储备。然后将10μL上述5mM中间原液与990μL预热的测定培养基混合，以获得最终的50μM工作储备。
4. 通过两步稀释稀释将10mM鱼藤酮和10mM抗霉素A储备液稀释并混合至10μM鱼藤酮/抗霉素A（Rot / AA）工作储备:将10μL10mM鱼藤酮和10mM抗霉素A储备液与80μLDMSO混合，以获得1mM Rot / AA中间储备。然后将上述1mM中间培养基的10μL与990μL预热的测定培养基混合，以获得最终的10μM Rot / AA工作储备。
5. 在实验当天新鲜制备上述注射化合物的工作储备，并将其置于室温下，直到装入传感器盒的注射口。

4. 视网膜解剖和视网膜穿孔准备

1. 按照AVMA安乐死指南_，通过CO2 窒息对小鼠实施安乐死²⁷。
   注意:不要将动物留在_CO2 室中的时间超过安乐死所需的时间。
2. 将眼睛去核并放入培养皿中的冰旧1x PBS缓冲液中，然后将其置于解剖显微镜下。
3. 通过用微剪刀切开，小心地去除附着在眼球外的额外直肌并切断视神经。
4. 使用30 G针头在角膜边缘（边缘）打孔;这用作微剪刀的插入部位。然后，使用精细解剖微剪刀沿着角膜边缘进行圆形切口，将其与后眼罩分开。
5. 使用锋利的解剖镊子将角膜、晶状体和玻璃体房从眼罩中取出。
6. 使用精细解剖微剪刀在眼罩边缘的巩膜层上做几个小切口。避免切割视网膜层。使用两个锋利的解剖钳抓住切口两侧的巩膜组织，并非常小心地拉动巩膜层以将其从神经视网膜中取出。在眼罩周围重复此操作，直到切除所有巩膜并得到完整的视网膜罩杯。
7. 使用解剖微剪刀，在视网膜杯上进行径向切口，使其变平并产生几个不同的部分。
   注意:根据患者的解剖技能和处理新鲜视网膜组织的经验，视网膜杯可以切割以产生3至5个不同的部分。
8. 使用直径为 1 mm 的活检打孔器从扁平视网膜杯的每个部分切除一个视网膜盘。
   注意:应注意使视网膜盘与视神经头保持相等的距离。
9. 使用镊子将预涂覆的网状嵌件转移到解剖培养皿中。借助两个超细睫毛刷，将视网膜打孔盘放在网眼插入物上。视网膜打孔盘放置在网状插入物的中心，神经节细胞层面朝下接触网状物和光感受器层朝上。
   注意:通常，一些RPE细胞仍然附着在光感受器上，这些细胞的色素沉着可以用作视网膜打孔盘方向的指标。

5. 加载传感器盒注入端口并进行校准

1. 将水合的传感器盒式板盒从37°C培养箱中取出。卸下液压增压盖，然后将传感器盒放回公用底板上。
2. 将所需体积的注射化合物工作库存溶液加载到适当的端口中。保持移液器吸头以45°角。将移液器吸头半插入注射口，吸头的斜面靠在注射口的另一壁上，然后将化合物轻轻地装入每个端口。避免引入气泡。
3. 有关特定测定的每个进样口中加载的化合物的体积，请参阅仪器用户指南。在本文中提出的实验中，将68μL50μM Bam15工作储备（用于线粒体应力测定）或68μL10μM Rot / AA工作储备（用于糖酵解速率测定）加载到端口A中;将75μL的10μM Rot / AA工作储备（用于线粒体应激测定）或75μL的500 mM 2-DG工作储备（用于糖酵解速率测定）加载到端口B中。
4. 加载板材所有孔的注入端口，包括背景校正孔和空白孔，以确保正确注入。将相应的复合溶液加载到背景校正孔的每个端口中。可以在库孔的每个端口中代替复合溶液代替测定培养基。
5. 将加载的传感器盒板（盖上盖子）放入分析仪中，在分析运行之前开始校准。校准结束后，程序将自动暂停，等待用含有视网膜打孔的胰岛捕获板替换实用程序板。

6. 加载胰岛捕获板并开始检测运行

1. 将607μL测定培养基加入胰岛捕获板的每个孔中
2. 使用镊子抓住顶部含有视网膜打孔盘的网状嵌件的边缘，并将其从培养皿中取出。在吸收性擦拭纸上轻轻敲击网状嵌件的底部，以除去多余的液体并将其放入胰岛捕获板的孔中。重复此步骤，直到所有带有视网膜冲头的网状嵌件都放入胰岛捕获板中。用空的网格插入物填充背景校正孔和空白孔。
3. 使用两个Graefe镊子小心轻轻地按压每个网状嵌件的边缘，并确保它们牢固地插入胰岛捕获板的底部。
4. 将加载的胰岛捕获板放入37°C培养箱中5分钟以预热。
5. 校准完成后弹出实用板，将其替换为，并将其替换为胰岛捕获板，盖子关闭，包含视网膜冲头。
6. 恢复检测运行。

7. 运行终止和数据存储

1. 运行完成后，弹出传感器盒和含有视网膜冲头的胰岛捕获板。数据将自动另存为 .asyr 文件。
2. 使用相关的数据分析软件按照制造商的用户指南²⁶查看和分析数据。
3. 使用 导出 功能导出数据的 .xslx 文件，可以使用电子表格软件查看和分析这些文件。

8. 保存视网膜冲床样本

1. 测定后，从机器中取出板，取出传感器墨盒，然后使用移液器轻轻地从每个孔中取出测定介质。
2. 将盖子重新贴上并用parafilm条密封板的侧面。
3. 储存在-80°C。
4. 对于归一化，量化每个孔中冲头的总DNA或蛋白质含量。

9. 数据分析

1. 线粒体应激测定
   注意:测量的OCR值（总OCR）表示组织的总耗氧量。在Bam15（开耦剂）注射后，OCR从基础水平（总细胞基_底）增加到最高水平（总_OCRmax），并在Rot / AA注射后下降。Rot/AA 注射后的残余 OCR 值（总 _OCRRot/AA）表示非线粒体耗氧量。
   1. 计算线粒体相关的耗氧量为:
      （等式 1）²⁷
   2. 计算线粒体储备容量（MRC）为:
      （等式 2）²⁸
      注意:Bam15注射前5次测量中的最后读数被视为"基础"值（对于总球_基底和线粒细胞基_底）。Bam15 进样后 4 次测量值中的最高读数用作"最大"值（对于 totalOCRmax 和 mitoOCRmax）。Rot/AA 注入后 4 个测量值中的最低读数用作总 _OCRRot/AA。
2. 糖酵解速率测定
   注意:测量的ECAR值（totalECAR）表示组织代谢活性对培养基的总酸化。一般来说，细胞外微环境的酸化主要通过挤出糖酵解产物乳酸来引起。线粒体TCA循环中底物的分解代谢导致CO2的产生，_CO2也通过水合作用碳酸氢盐使细胞外培养基酸化。
   1. 亚曲线粒体从总ECAR中贡献了介质酸化（mitoECAR）以获得糖ECAR。
      （等式 3）²⁷
      注意:线粒体呼吸和TCA循环是强耦合过程。线粒体产生的_CO2 是OXPHOS速率的函数，OXPHOS可以通过mitoOCR测量。
   2. 将 mitoECAR 计算为:
      （等式 4）²⁷
      其中，CCF（_CO2 贡献因子）是经验计算的比率值，表示 _CO2 介导的酸化产生的 H⁺ 贡献量与 OXPHOS 的每次 _O2 消耗量之比。该系统的CCF预先确定为^0.6028。介质酸化的准确测量由介质的缓冲容量、仪器pH传感器的灵敏度和有效测量室容量决定。这里，BF（缓冲因子）是原位实验缓冲液容量的参数，表示添加到有效测量室中以将pH水平改变1个单位的H ⁺或OH^-的量。当使用定制的测定介质时，可以通过按照缓冲因子方案将已知量的酸滴定到测定介质中来确定^BF30。该协议中使用的海马DMEM培养基pH 7.4具有2.60 mmol H ^{+ /} L / pH的预定高程。该方案中使用的胰岛捕获板具有_{Volmicrochamber} = 16.6μL31。体积比例因子 Kvol 是一个经验确定的常数。Kvol值不适用于胰岛捕获板，但可以从微孔板的值²⁸计算出来，占其微室的体积差，为0.41。
      注意:注射腐烂/ AA会关闭线粒体呼吸并迫使组织切换到糖酵解以产生ATP，从而导致更高的乳酸挤出和ECAR测量的增加。2-DG注射液停止糖酵解，残留的ECAR测量显示培养基的非糖酵解和非线粒体酸化。
   3. 糖酵解储备容量（GRC）计算如下:
      （等式 5）³¹
      其中，Rot / AA注射前5次测量中的最后读数被视为"基础"值（糖_ECARbasal）。Rot/ AA注射后4次测量中的最高读数用作"最大"值（糖_ECARmax）。2-DG注射后4次测量中的最低读数用作_{glycoECAR2-DG}。
3. 正常化
   注意:在比较不同年龄组的视网膜组织的读数或野生型和病理/退行性样品之间的读数时，归一化至关重要，这些样本的细胞数量可能不同。
   1. 使用商业上可用的试剂盒来评估每个视网膜打孔盘中的DNA含量^33，34。
   2. 或者，使用放射免疫沉淀测定缓冲液（RIPA缓冲液）从视网膜冲孔中提取总蛋白，并使用蛋白质含量进行归一化。
      注意:成年小鼠视网膜的表面积先前已被确定为约20 ^mm2，每个视网膜包含约650万个细胞³⁵。因此，每个直径为1毫米的视网膜冲孔是单个视网膜的约1/25，并且包含〜260K细胞。在将视网膜打孔的数据与其他组织样本或培养细胞的数据进行比较时，可以参考这些数字，

结果

这里报告的数据是具有代表性的线粒体应激测定，显示OCR痕量（图1）和糖酵解速率测定显示OCR痕量和ECAR痕量（图2），这是使用来自4个月大转基因 Nrl-L-EGFP 小鼠³⁶ （C57B / L6背景）的新鲜解剖的1mm视网膜打孔盘进行的。这些小鼠在视杆光感受器中特异性表达GFP，而不改变正常的视网膜发育，组织学和生理学，并已被广泛用作视网...

讨论

此处提供了使用离体，新鲜解剖的视网膜打孔盘进行基于微孔板的线粒体呼吸和糖酵解活性测定的详细说明。该方案已优化为:1）确保对离体视网膜组织使用合适的测定介质;2）采用适当尺寸的视网膜打孔盘，以获得落在机器最佳检测范围内的OCR和ECAR读数;3）涂层网嵌件，增强视网膜冲头的粘合性，在测量周期内读数稳定;4）使用最佳浓度的每种注射药物化合物;5）确保改变的周期长?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1X PBS	Thermo Fisher	14190-144
2-Deoxy glucose (2-DG), 500 mM stock solution	Sigma	D6134	Dissolve in Seahorse XF DMEM medium, prepare ahead of time
30-gauge needle	BD Precision Glide	305106
Antimycin A, 10 mM stock solution	Sigma	A8674	Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Bam15, 10 mM stock solution	TimTec	ST056388	Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Biopsy puncher, 1 mm	Integra Miltex	33-31AA
Cell-Tak	Corning Life Sciences	CB40240
CO2 asphyxiation chamber
Dissection forceps-Dumont #5	Fine Science Tools	11251-10	Stright tip
Dissection forceps-Dumont #7	Fine Science Tools	11274-20	Curved tip
Dissection microscope
DMSO	Sigma	D2438
Graefe forceps	Fine Science Tools	11051-10	Curved, Serrated tip
Microscissors	Fine Science Tools	15004-08	Curved tip
NaOH solution, 1 M	Sigma-Aldrich	S8263	Aqueous solution, prepare ahead of time
Rotenone, 10 mM stock solution	Sigma	R8875	Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Seahorse calibration medium	Agilent	100840-000
Seahorse XF 1.0 M glucose	Agilent	103577-100
Seahorse XF 100 mM pyruvate	Agilent	103578-100
Seahorse XF 200 mM glutamine	Agilent	103579-100
Seahorse XF DMEM medium	Agilent	103575-100	pH 7.4, with 5 mM HEPES
Seahorse XFe24 Islet Capture FluxPak	Agilent	103518-100	Containing Sensor Cartridge and Islet Capture microplate
Seahorse XFe24, Extra Cellular Flux Analyzer	Agilent
Sodium bicarbonate solution, 0.1 M	Sigma-Aldrich	S5761	Aqueous solution, prepare ahead of time
Superfine eyelash brush	Ted Pella	113