Определение митохондриального дыхания и гликолиза в образцах ткани сетчатки ex vivo

Резюме

Здесь описан подробный протокол для проведения анализа митохондриального стресса и анализа скорости гликолитизма в образцах ткани сетчатки ex vivo с использованием коммерческого биоанализатора.

Аннотация

Митохондриальное дыхание является критическим энергетическим путем во всех клетках, особенно в фоторецепторах сетчатки, которые обладают высокоактивным метаболизмом. Кроме того, фоторецепторы также демонстрируют высокий аэробный гликолиз, как раковые клетки. Точные измерения этих метаболических активностей могут дать ценную информацию о клеточном гомеостазе в физиологических условиях и в болезненных состояниях. Высокопроизводительные микропластинчатые анализы были разработаны для измерения митохондриального дыхания и различных метаболических активностей в живых клетках. Тем не менее, подавляющее большинство из них разработаны для культивируемых клеток и не были оптимизированы для интактных образцов тканей и для применения ex vivo. Здесь описан подробный пошаговый протокол, использующий технологию флуоресценции на основе микропластин, для непосредственного измерения скорости потребления кислорода (OCR) в качестве индикатора митохондриального дыхания, а также скорости внеклеточного подкисления (ECAR) в качестве индикатора гликолиза в неповрежденной ex vivo ткани сетчатки. Этот метод был использован для успешной оценки метаболической активности в сетчатке взрослой мыши и демонстрации его применения в исследовании клеточных механизмов старения и заболеваний.

Введение

Митохондрии являются важными органеллами, которые регулируют клеточный метаболизм, передачу сигналов, гомеостаз и апоптоз, координируя несколько важных физиологических ^{процессов1}. Митохондрии служат электростанцией в клетке для генерации аденозинтрифосфата (АТФ) путем окислительного фосфорилирования (OXPHOS) и обеспечивают энергию, которая поддерживает почти все клеточные события. Большая часть клеточного кислорода метаболизируется в митохондриях, где он служит конечным акцептором электронов в цепи переноса электронов (ETC) во время аэробного дыхания. Низкие количества АТФ также могут быть получены в результате гликолиза в цитозоле, где глюкоза превращается в пируват, который может быть дополнительно преобразован в лактат или транспортироваться в митохондрии и окисляться до ацетил-КоА, субстрата в цикле трикарбоновой кислоты (цикл ТЦА).

Сетчатка является одной из наиболее метаболически активных тканей у ^{млекопитающих2}, демонстрируя высокий уровень митохондриального дыхания и чрезвычайно высокое потребление ^{кислорода3}. Палочковые и конусные фоторецепторы содержат высокую плотность митохондрий4, а OXPHOS генерирует большую часть АТФ в сетчатке5. Кроме того, сетчатка также в значительной степени зависит от аэробного гликолиза6,7 путем преобразования глюкозы в лактат5. Митохондриальные дефекты связаны с различными нейродегенеративными ^{заболеваниями8,9}; и с его уникальными высокими энергетическими потребностями, сетчатка особенно уязвима к метаболическим дефектам, в том числе тем, которые влияют на митохондриальный OXPHOS4 и гликолиз10. Митохондриальная дисфункция и дефекты гликолиза связаны с дегенеративными заболеваниями ^{сетчатки11,12} и макулярной13, возрастной макулярной дегенерацией10,14,15,16 и диабетической ретинопатией17,18. Поэтому точные измерения митохондриального дыхания и гликолиза могут обеспечить важные параметры для оценки целостности и здоровья сетчатки.

Митохондриальное дыхание может быть измерено путем определения скорости потребления кислорода (OCR). Учитывая, что превращение глюкозы в пируват, а затем в лактат приводит к экструзии протонов и подкислению внеклеточной среды, измерения скорости внеклеточного подкисления (ECAR) дают представление о потоке гликолиза. Поскольку сетчатка состоит из нескольких типов клеток с близкими отношениями и активной синергией, включая обмен ^{субстратами6}, крайне важно проанализировать митохондриальную функцию и метаболизм в контексте всей ткани сетчатки с неповрежденным ламинированием и схемой. В течение последних нескольких десятилетий электроды Кларка типа _O2 и другие кислородные микроэлектроды использовались для измерения потребления кислорода в сетчатке19,20,21. Эти кислородные электроды имеют серьезные ограничения в чувствительности, требовании большого объема образца и необходимости непрерывного перемешивания суспендирующего образца, что обычно приводит к нарушению клеточного и тканевого контекста. Протокол, описанный здесь, был разработан с использованием флуоресцентного метода на основе микропластин для измерения митохондриального энергетического метаболизма в свежерассеченной ткани сетчатки мыши ex vivo. Он позволяет одновременно измерять OCR и ECAR со средней пропускной способностью в режиме реального времени с использованием небольшого образца (1 мм перфоратора) ткани сетчатки ex vivo, избегая при этом необходимости в суспензии и непрерывном перемешивании.

Здесь показана экспериментальная процедура анализа митохондриального стресса и анализа гликолитической скорости на свежерассеченных перфораторных дисках сетчатки. Этот протокол позволяет измерять метаболическую активность, связанную с митохондриями, в контексте ткани ex vivo. В отличие от анализов, выполняемых с использованием культивируемых клеток, показания, полученные здесь, отражают комбинированный энергетический метаболизм на тканевом уровне и зависят от взаимодействия между различными типами клеток в ткани. Протокол модифицирован по сравнению с ранее опубликованной версией ^22,23 для адаптации к новому поколению внеклеточного анализатора 24-луночного потока Agilent Seahorse (XFe24) с пластиной Islet Capture. Среда для анализа, концентрации инъекционных соединений и количество/продолжительность циклов анализа также были оптимизированы для ткани сетчатки. Приведен подробный пошаговый протокол приготовления перфораторных дисков сетчатки. Более подробную информацию о настройке программы и анализе данных можно получить из руководства пользователя производителя24,25,26.

протокол

Все мышиные протоколы были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Национального института глаз (NEI ASP# 650). Мыши содержались в 12-часовых светло-темных условиях и ухаживали за ними, следуя рекомендациям Руководства по уходу и использованию лабораторных животных, Института ресурсов лабораторных животных и Политики службы общественного здравоохранения по гуманному уходу и использованию лабораторных животных.

1. Картридж датчика гидратации и подготовка пробирной среды

1. За день до эксперимента добавьте 1 мл калибровочной среды в каждую лунку полезной пластины. Поместите крышку Hydro-Booster сверху и опустите картридж датчика через отверстие на крышке. Убедитесь, что датчик погружен в калибровочную среду. Инкубируйте картридж датчика в течение ночи в инкубаторе без _CO2 при 37 °C для активации флуорофоров.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения испарения инкубатор увлажняют, держа внутри лоток с водой, а кассету с картриджем датчика оборачивают прозрачной полиэтиленовой пленкой.
2. Подготовьте пробирную среду путем восстановления среды DMEM Seahorse с добавлением глюкозы, пирувата и глутамина до желаемых концентраций. В анализах, представленных в этой статье, конечная концентрация субстратов в пробирной среде составляет: 6 мМ глюкозы, 0,12 мМ пирувата и 0,5 мМ глутамина. Для каждой пробирной пластины в день эксперимента готовится 40 мл пробирной среды в свежем виде.
3. Настройте программу анализа в анализаторе в соответствии с инструкцией ^{производителя26}. В анализе, показанном здесь, протокол устанавливается следующим образом: 5 циклов измерений для исходного уровня, затем ввод порта A, затем 4 цикла измерений, затем ввод порта B и последующие 4 цикла измерений. Каждый цикл состоит из смеси (3 мин), ожидания (2 мин) и измерения (3 мин).

2. Покрытие сетчатых вставок микропластины островкового захвата

1. Приготовьте смесь покрытия, объединив 20 мкл клеточной присоединения среды (например, Cell-Tak) со 171 мкл бикарбоната натрия 0,1 М и 9 мкл 1 М NaOH.
2. Откройте крышку кассеты, содержащей сетчатые вставки. Пипетку 8 мкл покрытия смешивают с каждой сетчатой вставкой. Используйте наконечник пипетки, чтобы аккуратно намазать / распределить каплю вокруг, чтобы равномерно распределить смесь покрытия по всей сетчатой вставке.
3. Закройте кассету и дайте сетчатым вставкам инкубироваться при комнатной температуре в течение не менее 25 мин для адсорбции.
4. Промыть сетчатую вставку, пипеткой 4 мл пробирной среды непосредственно на сетчатые вставки. Аккуратно встряхните кассету, чтобы убедиться, что все сетчатые вставки промыты пробирной средой.
5. Держите сетчатую вставку в стороне. Он готов к использованию.

3. Приготовление инъекционных соединений

1. Вынимайте запасные аликвоты Бам15 (10 мМ), Ротенона (10 мМ), Антимицина А (10 мМ) и 2-ДГ (500 мМ) из морозильной камеры -80 °С и оттаивайте при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Запас 2-DG готов к использованию. Остальные препараты нужно разбавить до рабочего запаса.
2. Разогрейте 10 мл пробирной среды на водяной бане с температурой 37 °C.
3. Разбавьте 10 мМ Bam15 до 50 мкМ рабочего материала с использованием двухэтапной процедуры разбавления: смешайте 20 мкл запаса 10 мМ с 20 мкл ДМСО для получения промежуточного запаса 5 мМ. Затем смешайте 10 мкл промежуточного материала выше 5 мМ с 990 мкл предварительно нагретой пробирной среды, чтобы получить конечный рабочий материал 50 мкМ.
4. Разбавьте и смешайте 10 мМ ротенона и 10 мМ запаса антимицина А до 10 мкМ рабочего материала ротенона/антимицина А (Rot/AA) двумя этапами разведения: смешайте по 10 мкл из 10 мМ ротенона и 10 мМ запаса антимицина А с 80 мкл ДМСО для получения промежуточного запаса 1 мМ Рот/АА. Затем смешайте 10 мкл вышеуказанного промежуточного материала 1 мМ с 990 мкл предварительно нагретой пробирной среды, чтобы получить конечный рабочий материал Rot/AA 10 мкМ.
5. Только что подготовьте вышеупомянутые рабочие запасы инъекционных соединений в день эксперимента и отложите их при комнатной температуре до загрузки в инжекционные отверстия картриджа датчика.

4. Рассечение сетчатки и подготовка перфоратора сетчатки

1. Усыпление мыши путем удушья _CO2 в соответствии с Руководящими принципами AVMA по эвтаназии27.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте животное в камере _CO2 дольше, чем время, необходимое для эвтаназии.
2. Энуклеат глаз и поместите в ледяной старый 1x PBS буфер в чашке Петри, а затем поместите его под рассеченный микроскоп.
3. Аккуратно удалите, разрезав микросубчиками, лишние прямые мышцы, прикрепленные снаружи глазного яблока, и отрежьте зрительный нерв.
4. Используйте иглу весом 30 г, чтобы пробить отверстие на краю роговицы (лимбус); он служит местом вставки для микросублиц. Затем используйте тонкие рассечение микросубчиками, чтобы сделать круговой разрез по краю роговицы, отделив ее от задней глазной чашки.
5. Используйте острые рассеченные щипцы, чтобы удалить роговицу, хрусталик и стекловидное тело подальше от глазной чашки.
6. Используйте тонкие рассеченные микросубчики, чтобы сделать несколько небольших разрезов на склеральном слое на краю глазной чашки. Избегайте разрезания слоя сетчатки. Используйте два острых рассеченных щипца, чтобы удержать склеральную ткань с каждой стороны разреза и очень осторожно потяните за склеральный слой, чтобы удалить его из нервной сетчатки. Повторяйте это вокруг глазной чашки до тех пор, пока не будут удалены все склеры и не будет получена неповрежденная чашка сетчатки.
7. Используйте рассечение микросублицоров и сделайте радиальные надрезы на чашке сетчатки, чтобы сплющить ее и создать несколько отдельных секций.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от навыков рассечения и опыта человека в обращении со свежей тканью сетчатки, чашка сетчатки может быть разрезана для создания от 3 до 5 отдельных секций.
8. Используйте перфоратор для биопсии диаметром 1 мм, чтобы вырезать один диск сетчатки из каждого участка уплощенной чашки сетчатки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следует позаботиться о том, чтобы диски сетчатки были пробиты на равном расстоянии от головки зрительного нерва.
9. Используйте щипцы для переноса предварительно покрытых сетчатых вкладышей в рассекающую чашку Петри. С помощью двух сверхтонких ресниц поместите перфоратор сетчатки на сетчатую вставку. Перфорационный диск сетчатки помещается в центре сетчатой вставки с ганглиозным клеточным слоем стороной вниз, касаясь сетки и слоя фоторецептора лицом вверх.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Часто некоторые клетки RPE остаются прикрепленными к фоторецепторам, и пигментация этих клеток может быть использована в качестве индикатора ориентации диска перфоратора сетчатки.

5. Загрузка портов впрыска картриджа датчика и калибровка

1. Достаньте гидратированную кассету с картриджной пластиной датчика из инкубатора с температурой 37 °C. Снимите крышку Hydro-Booster и поместите картридж датчика обратно на пластину утилиты.
2. Загрузите желаемый объем растворов рабочего сырья инжекционных составов в соответствующие порты. Держите наконечник пипетки под углом 45°. Вставьте наконечник пипетки наполовину в инжекционный порт со скосом наконечника у противоположной стенки инжекционного отверстия и осторожно загрузите соединение в каждый порт. Избегайте введения пузырьков воздуха.
3. Обратитесь к руководству пользователя прибора для получения объема соединения, загруженного в каждый инжекционный порт для конкретного анализа. В экспериментах, представленных в данной работе, 68 мкл рабочего материала Bam15 50 мкМ (для анализа митохондриального стресса) или 68 мкл рабочего материала Rot/AA 10 мкМ (для анализа скорости гликолита) загружается в порт А; 75 мкл рабочего материала Rot/AA 10 мкМ (для анализа митохондриального стресса) или 75 мкл рабочего материала 500 мМ 2-DG (для анализа скорости гликолитизма) загружается в порт B.
4. Нагрузите нагнетательные отверстия всех скважин плиты, включая фоновые коррекционные скважины и заготовки скважин для обеспечения правильной закачки. Загрузите соответствующий составной раствор в каждый порт для фоновых коррекционных скважин. Пробирная среда может быть замещена, вместо сложного раствора, в каждом из портов береговых скважин.
5. Поместите нагруженную пластину картриджа датчика со снятой крышкой в анализаторную машину, чтобы начать калибровку перед запуском анализа. После завершения калибровки программа автоматически приостановит работу, ожидая замены полезной пластины на пластину захвата островка, содержащую перфораторы сетчатки.

6. Загрузка пластины захвата островка и запуск прогона

1. Добавьте 607 мкл пробирной среды в каждую лунку островковой улавливающей пластины
2. Используйте щипцы, чтобы захватить ободок сетчатой вставки, содержащей перфораторные диски сетчатки сверху, и вынуть его из чашки Петри. Слегка постучите по нижней части сетчатой вставки по впитывающей салфетке, чтобы удалить лишнюю жидкость, и поместите ее в колодец пластины захвата островка. Повторяйте этот шаг до тех пор, пока все сетчатые вставки с перфораторами сетчатки не будут помещены в пластину захвата островка. Заполняйте фоновые корректирующие колодцы и пустые колодцы пустыми сетчатыми вставками.
3. Используйте два щипца Graefe, чтобы осторожно и осторожно прижать обод каждой сетчатой вставки и убедиться, что они надежно вставлены в нижнюю часть пластины захвата островка.
4. Поместите загруженную пластину захвата островка в инкубатор с температурой 37 °C на 5 минут для прогрева.
5. Извлеките полезную пластину после завершения калибровки и замените ее пластиной захвата островка с отслойкой, содержащей перфораторы сетчатки.
6. Возобновите прогон анализа.

7. Запуск терминации и хранения данных

1. После завершения запуска извлеките картридж датчика и пластину захвата островка, содержащую перфораторы сетчатки. Данные автоматически сохраняются в виде файла .asyr.
2. Используйте соответствующее программное обеспечение для анализа данных для просмотра и анализа данных в соответствии с руководством пользователя ^{производителя26}.
3. Используйте функцию Export для экспорта .xslx файла данных, который можно просматривать и анализировать с помощью программного обеспечения для работы с электронными таблицами.

8. Сохранение образца перфоратора сетчатки

1. После анализа выньте пластину из машины, извлеките картридж датчика и аккуратно извлеките пробирную среду из каждой лунки с помощью пипетки.
2. Нанесите крышку обратно и запечатайте боковые стороны пластины полоской парапленки.
3. Хранить при температуре -80 °C.
4. Для нормализации количественно оцените общее содержание ДНК или белка в пунше в каждой лунке.

9. Анализ данных

1. Анализ митохондриального стресса
   ПРИМЕЧАНИЕ: Измеренное значение OCR (totalOCR) представляет общее потребление кислорода тканью. После инъекции Bam15 (разъединителя) OCR увеличивается с базального уровня (_{totalOCRbasal}) до максимального уровня (totalOCRmax) и снижается после инъекции Rot/AA. Остаточное значение OCR после инъекции Rot/AA (_{totalOCRRot/AA}) представляет собой немитохондриальное потребление кислорода.
   1. Рассчитайте потребление кислорода, связанное с митохондриями, следующим образом:
      (Экв. 1) ^{28 См.}
   2. Рассчитайте емкость митохондриального резерва (MRC) следующим образом:
      (Экв. 2) ^{29 См.}
      ПРИМЕЧАНИЕ: Последнее чтение среди 5 измерений перед инъекцией Bam15 принимается за «базальное» значение (для _{totalOCRbasal} и mitoOCRbasal). Самое высокое значение среди 4 измерений после инъекции Bam15 используется в качестве «максимального» значения (для _totalOCRmax и mitoOCRmax). Самое низкое значение среди 4 измерений после инъекции Rot/AA используется как _{totalOCRRot/AA}.
2. Анализ гликолитической скорости
   ПРИМЕЧАНИЕ: Измеренное значение ECAR (totalECAR) представляет собой полное подкисление среды метаболической активностью ткани. В целом, подкисление внеклеточной микросреды происходит в основном путем экструзии гликолитического продукта, лактата. Катаболизм субстратов в митохондриальном цикле ТЦА приводит к образованию _CO2, который также подкисляет внеклеточную среду путем гидратации до бикарбоната.
   1. Субстрактные митохондриальные вещества способствовали подкислению среды (mitoECAR) из totalECAR для получения гликоЭКАР.
      (Экв. 3) ^{28 См.}
      ПРИМЕЧАНИЕ: Митохондриальное дыхание и цикл ТЦА являются сильно связанными процессами. Производство _CO2 из митохондрий является функцией скорости OXPHOS, которая измеряется с помощью mitoOCR.
   2. Рассчитайте mitoECAR как:
      (Экв. 4) ^{28 См.}
      где CCF (коэффициент вклада _CO2 ) представляет собой эмпирически рассчитанное значение соотношения, представляющее величину вклада H⁺ от ПОДКИСЛЕНИЯ, опосредованного _CO2, по отношению к каждому потреблению _O2 от OXPHOS. CCF для этой системы предварительно определен как ^0,6028. Точное измерение подкисления среды определяется буферной емкостью среды, чувствительностью приборного датчика рН и эффективной емкостью измерительной камеры. Здесь BF (Buffer Factor) является параметром экспериментальной буферной емкости in situ , представляющим количество H⁺ или OH^- , добавленное в эффективную измерительную камеру для изменения уровня pH на 1 единицу. Когда используется индивидуальная среда для анализа, BF может быть определен путем титрования известных количеств кислоты в пробирную среду в соответствии с протоколом Buffer ^Factor30. Средняя рН Seahorse DMEM 7,4, используемая в этом протоколе, имеет заранее определенный BF 2,60 ммоль H ⁺ / L / pH. Пластина захвата островков, используемая в этом протоколе, имеет _{Volmicrochamber} = 16,6 ^μL31. Коэффициент масштабирования объема, Kvol, является эмпирически определенной константой. Значение Kvol недоступно для пластины захвата островков, но может быть рассчитано из значения ^{микропластины28}, учитывающего разницу объема в их микрошаблонах, равным 0,41.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекция Rot/AA отключает митохондриальное дыхание и заставляет ткань переключаться на гликолиз для производства АТФ, что приводит к более высокой экструзии лактата и увеличению измерения ECAR. Гликолиз прекращается при инъекции 2-DG, а остаточное измерение ECAR выявляет негликолитическое и немитохондриальное подкисление среды.
   3. Рассчитайте емкость запаса гликолитиков (GRC) следующим образом:
      (Экв. 5) ^{32 См.}
      где последнее показание среди 5 измерений перед инъекцией Rot/AA принимается за «базальное» значение (_{glycoECARbasal}). Самое высокое значение среди 4 измерений после инъекции Rot/AA используется в качестве «максимального» значения (_glycoECARmax). Самое низкое показание среди 4 измерений после инъекции 2-DG используется в качестве _{glycoECAR2-DG}.
3. Нормализация
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нормализация необходима при сравнении показаний тканей сетчатки разных возрастных групп или между образцами дикого типа и патологическими/дегенеративными образцами, которые могут отличаться по количеству клеток.
   1. Используйте коммерчески доступные наборы для оценки содержания ДНК в каждом перфораторном диске сетчатки33,34.
   2. Альтернативно, используйте буфер радиоиммунопреципитации (буфер RIPA) для извлечения общего белка из пунша сетчатки и используйте содержание белка для нормализации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ранее было определено, что площадь поверхности сетчатки взрослой мыши составляет около 20 ^мм2, и каждая сетчатка содержит ~ 6,5 миллиона ^{клеток35}. Следовательно, каждый перфоратор сетчатки диаметром 1 мм составляет ~ 1/25 одной сетчатки и содержит ~ 260K клеток. На эти цифры можно ссылаться при сравнении данных от пунша сетчатки с данными из других образцов тканей или культивируемых клеток;

Результаты

Данные, представленные здесь, представляют собой репрезентативный анализ митохондриального стресса, показывающий след OCR (рисунок 1), и анализ гликолитической скорости, показывающий след OCR и след ECAR (рисунок 2), которые были выполнены с использованием не?...

Обсуждение

Здесь приведены подробные инструкции по проведению микропластинчатых анализов активности митохондриального дыхания и гликолиза с использованием ex vivo, свежерассеченных перфораторных дисков сетчатки. Протокол был оптимизирован для: 1) обеспечения использования подходящей среды ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1X PBS	Thermo Fisher	14190-144
2-Deoxy glucose (2-DG), 500 mM stock solution	Sigma	D6134	Dissolve in Seahorse XF DMEM medium, prepare ahead of time
30-gauge needle	BD Precision Glide	305106
Antimycin A, 10 mM stock solution	Sigma	A8674	Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Bam15, 10 mM stock solution	TimTec	ST056388	Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Biopsy puncher, 1 mm	Integra Miltex	33-31AA
Cell-Tak	Corning Life Sciences	CB40240
CO2 asphyxiation chamber
Dissection forceps-Dumont #5	Fine Science Tools	11251-10	Stright tip
Dissection forceps-Dumont #7	Fine Science Tools	11274-20	Curved tip
Dissection microscope
DMSO	Sigma	D2438
Graefe forceps	Fine Science Tools	11051-10	Curved, Serrated tip
Microscissors	Fine Science Tools	15004-08	Curved tip
NaOH solution, 1 M	Sigma-Aldrich	S8263	Aqueous solution, prepare ahead of time
Rotenone, 10 mM stock solution	Sigma	R8875	Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Seahorse calibration medium	Agilent	100840-000
Seahorse XF 1.0 M glucose	Agilent	103577-100
Seahorse XF 100 mM pyruvate	Agilent	103578-100
Seahorse XF 200 mM glutamine	Agilent	103579-100
Seahorse XF DMEM medium	Agilent	103575-100	pH 7.4, with 5 mM HEPES
Seahorse XFe24 Islet Capture FluxPak	Agilent	103518-100	Containing Sensor Cartridge and Islet Capture microplate
Seahorse XFe24, Extra Cellular Flux Analyzer	Agilent
Sodium bicarbonate solution, 0.1 M	Sigma-Aldrich	S5761	Aqueous solution, prepare ahead of time
Superfine eyelash brush	Ted Pella	113