模拟人血脑屏障的三重培养细胞系统

摘要

该协议描述了一种建立人血脑屏障（BBB）体 外 模型的方法。内皮细胞和周细胞接种在插入过滤器（血室）的每一侧，星形胶质细胞接种在底孔（脑隔室）中。所表征的模型用于纳米颗粒输运实验。

摘要

由于血脑屏障（BBB）的高度特异性和限制性特性，将药物输送到大脑仍然是一个挑战，它控制和限制进入脑实质。然而，随着纳米技术的发展，开发了大量新纳米材料来改善药物输送，这突出了对可靠的 体外 微系统的需求，以预测临床前测定框架中的大脑渗透。这是一种建立微生理系统以仅使用人类细胞模拟BBB的简单方法。在其配置中，该模型由三重培养物组成，包括脑样内皮细胞（BLECs），周细胞和星形胶质细胞，这是以更生理的方式诱导和调节BBB特性所必需的三个主要BBB细胞参与者，而无需紧缩化合物。该模型以 12 孔板形式开发，在三重培养 6 天后准备就绪，具有物理性质、基因和蛋白质表达特征，并用于聚合物纳米凝胶转运测量。该模型可用于健康和病理条件下的广泛实验，是分子和颗粒转运以及细胞间和细胞内运输临床前评估的宝贵工具。

引言

BBB位于脑毛细血管内皮细胞（ECs）水平，控制和调节脑实质的访问，这对于维持脑稳态和^{神经细胞的功能}至关重要1^，2。然而，在脑病理学的情况下，无法获得脑实质是制定治疗策略的真正障碍。

BBB EC具有一组复杂的特性，包括密封细胞间隙的紧密连接（TJ）蛋白，与控制跨细胞途径¹，²，³的外排泵^，特异性转运蛋白和受体系统相关。此外，由于与嵌入BBB EC基底膜中的周细胞和星形胶质细胞的通信，所有这些特性都被诱导和维持，星形胶质细胞的末端脚围绕脑毛细血管¹，^2，3。因此，考虑到其结构的复杂性以及构成神经血管单位（NVU^）的不同细胞类型之间的通讯，体外研究BBB是一项挑战2。此外，不同的细胞类型对于BBB特性的诱导和维持至关重要，因此会影响通过BBB的交叉预测。已经使用大量策略测试了将药物输送到大脑的不同策略，以绕过BBB限制属性⁴。最近，随着纳米技术的进步，正在开发用于药物载体^{的新材料5，6}。除了更高的负载、降低的毒性和提高药物的生物利用度外，这些新的纳米材料还可以用于特洛伊木马策略的功能化，以穿过BBB并特异性靶向实质^5，6中的细胞。在正在评估的不同类型的纳米材料中，纳米凝胶引起了相当大的关注，主要是由于其胶体性质和定制化学结构以引入刺激^{响应特性的能力}7，⁸，⁹，¹⁰，¹¹，^12，13，^14，15。

现在开发了体外模型，用于使用人类细胞预测药物大脑渗透的临床前研究¹⁶。这些模型的不同设置可用，从单层脑EC到多细胞系统¹⁶。考虑到NVU细胞在BBB诱导和维持中的重要性以及对病理环境的协调反应，BBB体外模型需要考虑所有这些主角，以提高预测的相关性2^，17。

目前的方法描述了建立人类BBB的三重培养体 外 模型，该模型与人类细胞完全开发以研究特定的细胞和人类分子机制。为了具有生理相关性，该模型由诱导和维持BBB特性所必需的BBB的主要三个细胞参与者（EC，周细胞和星形胶质细胞）组成，而无需使用紧固化合物并显示一组需要被视为 体外 BBB模型的特性^16，18。该模型以分隔血液和脑区室的配置建立，适用于药物和颗粒转运的临床前研究，以预测脑渗透。通过测量聚合物纳米凝胶的传输来说明该模型的有用性。

研究方案

该协议得到了法国高等教育和研究部（参考:CODECOH DC2011-1321）和当地研究审查委员会（法国Beuvry的Béthune妇产医院）的批准。为了获得内皮细胞（EC），根据法国立法，收集脐带血需要获得捐赠者父母的书面知情同意。周细胞由神田隆教授（日本宇部山口大学医学研究生院神经病学和临床神经科学系）提供，根据参考文献¹⁹进行分离。原代人脑皮层星形胶质细胞是从商业供应商处购买的（见 材料表）。

1. 细胞培养

1. 内皮细胞培养
   注意:根据Pedroso等人描述的方法，内皮细胞（ECs）来源于从人脐带血中分离的CD34 ⁺造血干细胞²⁰。EC的内皮表型在Pedroso等人²⁰中描述。
   1. 使用补充有5%胎牛血清（FCS），0.5%庆大霉素和1%内皮细胞生长补充剂（ECM）的内皮细胞培养基培养人EC（见 材料表）。
   2. 对于传代培养EC，在模型设置前两天，在37°C下用10mL的2%明胶涂覆一个培养皿15分钟，然后用20mL温ECM替换。在预包被的细胞培养皿中解冻一瓶含有100万个细胞的ECs（细胞冷冻前如步骤2.3.3所述手动计数细胞）。
   3. 在37°C下3小时后，更新培养基并保持细胞，直到三培养物在37°C的培养箱内的潮湿气氛中在5%CO₂ 和21%O₂下设置。
2. 周细胞培养
   注意:周细胞根据Shimizu等人发表的协议从人脑中分离¹⁹，其分离程序遵循Kanda等人发表的方法²¹ 进行修改。
   1. 使用补充有4.5 g / L葡萄糖（DMEM HG），10%FCS，1%去青霉素/链霉素和1%L-谷氨酰胺的Dulbecco改良Eagle培养基培养周细胞（见 材料表）。
   2. 对于周细胞亚培养，在模型设置前五天，在室温（RT）下用8mL /培养皿的100μg/ mLI型胶原蛋白溶液在0.02N乙酸中涂覆两个培养皿1小时，然后用RT DMEM HG洗涤两次。在含有10mL温热培养基的锥形管中解冻一瓶含有100万个细胞的周细胞，并在20°C下以190× g 离心悬浮液5分钟。
   3. 将沉淀重悬于10 mL温培养基中，并种子预装有15 mL温培养基/培养皿的预包被细胞培养皿中。培养基在3天后更新，并将细胞维持至三培养物在37°C的加湿培养箱中在5%CO₂ 和21%O₂下设置。
3. 星形胶质细胞的培养
   1. 使用补充有20%FCS，1%星形胶质细胞生长补充剂和1%青霉素/链霉素溶液（AM）的星形胶质细胞培养物培养星形胶质细胞（见 材料表）。
   2. 为了传代培养星形胶质细胞，在模型设置前一周，用10mL的2μg/^{cm 2} 聚-L-赖氨酸（PLL）在37°C下涂覆一个T75细胞培养瓶1小时，并用RT无菌水洗涤两次。在预包被的T75细胞培养瓶中解冻一瓶含有100万个细胞的星形胶质细胞，放入20 mL温热培养基和种子中。
      注意:商业获得的细胞瓶确认存在~100万个细胞，因此此处未进行细胞计数。
   3. 将细胞保持在37°C的加湿培养箱中，在5%CO₂ 和21%O₂下。培养基在24小时后更新，然后每2天更新一次，直到三栽培的设置。

2. 三重培养模型设置

注意:三种电池类型的组装在同一天进行。在设置三培养的前一天，在恢复的插入过滤器上进行I型胶原蛋白包被（参见 材料表），并将星形胶质细胞接种在12孔板的PLL预包被孔中。

1. 星形胶质细胞在孔中播种
   1. 如步骤 1.3.2 中所述，用 500 μL 2 μg/cm² PLL 溶液涂覆孔。
   2. 用10mL温热的磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞一次 - 无钙和无镁的1X（1X PBS-CMF）（表1），然后在37°C下用10mL温热的20%胰蛋白酶/ EDTA（T / E）溶液孵育3分钟，并将细胞从烧瓶中机械分离。将悬浮液转移到含有5mL温热的非稀释食品接触物质的锥形管中。
      注意:根据提供者的方案²²，可以通过将烧瓶放入培养箱中1分钟并敲击烧瓶以帮助完成分离来优化星形胶质细胞的收集。剩余的细胞应用5mL T / E中和溶液收集并置于含FCS的锥形管中。
   3. 将悬浮液在20°C以190× g离心5分钟。
   4. 将细胞沉淀重悬于5mL温热的AM中。通过在显微镜下使用手动计数室将 20 μL 细胞悬液稀释在 80 μL 1X PBS-CMF 中来计数细胞（参见 材料表）。在每个 PLL 预包被孔中将约 40，000 个细胞/cm² 接种在 1.5 mL 的温热 AM 中。
2. 在恢复的插入过滤器上接种周细胞
   1. 在恢复的插入过滤器上加入 250 μL I 型胶原蛋白溶液 （100 μg/mL），使用无菌镊子放置在有盖的 25 mm 高培养皿（参见 材料表）的外围。在无菌条件下将涂层在室温下放置1小时。
      注意:使用的培养皿需要足够高，以确保在引擎盖外保持无菌，并避免还原过滤器上的溶液与培养皿盖接触。
   2. 用连接到吸液系统的玻璃移液管小心地取出I型胶原蛋白溶液。用 250 μL RT DMEM HG 洗涤两次，然后小心地从插入式过滤器中取出所有溶液。将涂覆的插入式过滤器在无菌条件下置于室温下，直到细胞接种。
      注意:在涂层过程中，请注意不要触摸过滤器，以免损坏膜。一旦涂上I型胶原蛋白，插入过滤器可以在室温下储存过夜。
   3. 在三培养设置当天，用 10 mL 温热的 1X PBS-CMF 洗涤周细胞两次，并用 2 mL 温热胰蛋白酶孵育细胞。通过在显微镜下观察细胞来监测胰蛋白酶的作用。一旦细胞开始分离，去除胰蛋白酶并在机械解离前加入 5 mL 温热的 ECM。
   4. 通过在显微镜下使用手动计数室将 20 μL 细胞悬液稀释在 80 μL 1X PBS-CMF 中来计数细胞，并在预涂覆的恢复插入式过滤器上以 250 μL 的体积接种 44，500 个细胞/cm 2。 将插入过滤器保持在37°C的加湿培养箱中，在5%CO 2和21%O₂下3小时。
   5. 使用无菌镊子在含有 1.5 mL 温热 ECM/孔的 12 孔板中小心地恢复插入过滤器。插入式过滤器现在可以在另一侧涂覆了。
3. 在插入过滤器上接种内皮细胞
   1. 在插入过滤器的上侧涂上500μL基于细胞基质的水凝胶（1/48 v / v）（参见 材料表）。1小时后，在37°C的加湿培养箱中，在5%CO₂ 和21%O₂下，用500μLRT DMEM HG洗涤一次。
   2. 用 10 mL 温热的 1X PBS-CMF 洗涤一次，并用 2 mL 温热胰蛋白酶孵育细胞。一旦细胞开始分离，去除胰蛋白酶并在机械解离前加入 5 mL 温热的 ECM。
   3. 通过在显微镜下使用手动计数室将 20 μL 细胞悬液稀释在 80 μL 1X PBS-CMF 中来计数细胞，并在预包被的插入过滤器上以 71，500 个细胞/cm² 的密度接种 EC，体积为 500 μL 温 ECM。
   4. 用 1.5 mL 温热的 ECM/孔替换 AM，然后将接种的插入过滤器（EC + 周细胞）转移到含有星形胶质细胞的孔上。
   5. 将三培养细胞系统置于37°C的加湿培养箱中，在5%CO₂ 和21%O₂下。
4. 维护三细胞培养以诱导BBB特性
   注意:为了诱导EC中的BBB特性，需要6天的三重培养。
   1. 每隔一天更新培养基，直到第6天，使用与吸液系统连接的玻璃移液器小心地从上部和底部隔室中取出培养基。
   2. 在上部隔室中以500μL的体积和底部隔室中1.5 mL的体积快速用温热的ECM替换，并将细胞放回37°C的加湿培养箱中，在5%CO₂ 和21%O₂下。

3. BBB表型验证

注意:经过6天的三重培养，在EC中诱导BBB表型所需的时间，人类BBB模型已准备好进行实验。脑样内皮细胞 （BLEC） 的物理完整性通过对 TJ 蛋白的免疫荧光染色进行可视化，该蛋白使用通透性测定法评估为 BBB 完整性标志物。BBB表型验证还包括根据Deligne等人²³中描述的程序进行的基因/蛋白质表达分析和外排泵功能。周细胞和星形胶质细胞根据Deligne 等人描述的程序通过各自的染色标记物可视化。2020²³.

1. 免疫荧光染色
   1. 将插入过滤器和星形胶质细胞固定在冰冷的甲醇/丙酮（50/50 v/v）中1分钟，并用RT 1X PBS-CMF洗涤两次。
   2. 使用手术刀切割膜，小心地将过滤器与插入物分开。根据Deligne等人对膜和底孔进行免疫细胞化学²³。
      注意:对于封闭步骤，在室温下使用 250 μL SEA BLOCK 封闭缓冲液（参见 材料表）30 分钟。
2. BBB 完整性测定
   1. 通过使用具有不同分子量的BBB完整性标记物（如荧光素钠（NaF）和20 kDa葡聚糖（FD20））的渗透性测定来评估BLEC的物理完整性（参见 材料表）。
      注意:实验可以根据Deligne等人²³中描述的程序进行。
3. 外排泵功能
   1. 通过测量罗丹明123（R123）的细胞内积累来评估P-糖蛋白（P-gp）和乳腺癌耐药蛋白（BCRP）的功能，有和没有Elacridar，一种P-gp和BCRP抑制剂（参见 材料表）。
      注意:实验可以根据Deligne等人²³中描述的程序进行。
4. 基因和蛋白质表达
   1. 用冷林格HEPES（RH）（表1）快速洗涤细胞后，在冰上进行基因和蛋白质样品收集。在收集EC样品之前，从倒置插入过滤器²⁰中刮掉周细胞。

4. 纳米凝胶转运

注意:为了估计聚合物纳米凝胶（NGs）从三培养BLEC模型的腔腔到光室的通过，在第6天在管腔隔室上加入0.1mg / mL的NG溶液24小时。研究的NG是荧光标记的N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）基水凝胶，平均尺寸为8-10nm（见 材料表）。

1. 称取纳米凝胶粉末并以1mg / mL的浓度溶解在ECM中。超声处理溶液10分钟，并使用0.2μmPTFE过滤器过滤。
   注意:在实验当天准备新鲜的NG溶液。
2. 更换管腔室中的培养基，并在上室中加入 50 μL NGs 溶液，最终浓度为 0.1 mg/mL。
   注意:从原始溶液中以1:10的比例稀释。
3. 孵育24小时后，从管腔（20μL）和铝腔（200μL）隔室中收集等分试样，并将它们置于黑色96孔板中。
4. 使用荧光多孔板读数仪（参见 材料表）和黑色96孔板定量荧光，使用477/540nm的激发/发射波长设置。计算在时间= 0小时（t0）^6，15时加入初始工作溶液的交叉百分比。
   注意:要准备用于荧光测量的 96 孔板，请从光室中加入 200 μL 溶液，从腔室中加入 20 μL 溶液，然后进行 t0 制备（加入 180 μL ECM 以达到 200 μL 的最终体积）。还包括校准曲线和读数板的空白。仪器参数:检测方法 - 荧光，光学位置 - 顶部，读取类型 - 终点，激发波长 - 477 nm，发射波长 - 540 nm，灵敏度 - 100，摇晃 - 双轨道 5 秒。

结果

人类三重培养BBB模型的设置
设置人类BBB体 外 模型所需的协议如图 1 所示，包括必须严格遵守其顺序的连续步骤。首先，将三种细胞类型分别培养在细胞培养皿中（图1A），然后组装在插入过滤系统中。三重培养设置首先将第一种细胞类型星形胶质细胞接种在预包被的底部孔中。第二天，将周细胞和EC分别接种在插入过滤器的预涂被的铝和腔表面上。然后将插入过滤器转移到星形胶质细胞上。该模型在培养物中保持6天，这是在EC中诱导BBB特性所需的时间，根据专利共培养模型²⁴，每隔一天更新一次培养基。然后将 EC 重命名为 BLEC（图 1B）。

人类BBB模型的特征
三细胞培养模型已被表征为存在一组BBB特异性特性。首先，免疫细胞化学数据证实了常规标志物的表达，例如血小板衍生的生长因子受体β（PDGFR-β）^25，26和周细胞的desmin和星形胶质细胞的胶质纤维酸性蛋白（GFAP）²⁶（图2A）。因此，在用周细胞和星形胶质细胞培养6天后，用VE-钙粘蛋白的贴壁连接染色可视化的BLECS单层在细胞边界显示TJ蛋白Claudin-5和ZO-1的连续定位（图2A）。TJ的建立与使用低分子量BBB完整性标记物（即NaF（376 Da）^16，27和高分子量（即FD20 （20 kDa）²⁷）测量的低细胞旁通透系数相关，如图^2B所示。测量值与使用^{ECs 23，24，28}的确切来源的经过验证的BBB体外模型相当。总之，这些结果突出了三重培养物BLEC单层的低细胞旁通透性，这是体内BBB的特征。此外，与不存在的对照条件相比，BLEC 中的 R123 细胞内积累在外排泵抑制剂 Elacridar^23，24 的存在中表现出显着增加（图 2C）。这表明在BLEC中存在主动外排泵分子，即P-gp和BCRP。

为了进一步表征BLECs，研究了关键BBB特征的基因表达和蛋白质水平（图3）。将使用三重培养模型获得的数据与由EC和周细胞²⁴ 组成的经过验证和专利的共培养模型进行比较，该模型用作对照模型。星形胶质细胞代表三重培养模型中初始共培养模型中添加的第三种细胞类型。因此，与共培养 BLE 相比，三重培养 BLE 的基因表达分析（图 3A）显示，TJ 蛋白（claudin-5 和闭塞带-1）和外排泵（P-gp 和 BCRP）等关键 BBB 特征的表达维持，以及大多数研究的 BBB 转运蛋白（葡萄糖转运蛋白 1）和受体（转铁蛋白受体）的上调。发现蛋白质定量数据（图3B）与转录结果一致。总体而言，这些数据支持三重培养BLEC层中BBB特性的正诱导，类似于经过验证的共培养模型。总之，三重培养模型显示了 体外 微生理系统模拟BBB所需的物理和代谢特性。

药物递送策略的适用性 - 纳米凝胶转运的测量
为了评估使用三重培养模型研究新的大脑递送策略的可能性^，评估了荧光标记的基于NIPAM的中性NG的转运6^，15。在时间0，NGs以0.1mg / mL的浓度放置在腔内室中（图4A）。孵育24小时后，在光室中发现了5.82%的NG（图4B），证明了它们穿过BLEC的能力。

结果表明，该模型适用于测量小型和大型化合物的渗透性（如完整性标记所述），并评估聚合物NGs等纳米材料的传输。

图 1:设置人 BBB 三重培养体 外 模型的关键步骤的表示。 （A） BBB 模型的三个细胞成分的相差图像:内皮细胞 （EC）、周细胞 （PC） 和星形胶质细胞 （AC）。比例尺 = 250 μm。 （B）三重培养人BBB体 外 模型设置的示意图和说明性时间表。突出显示的框表示倒置插入过滤器的涂层过程。 请点击此处查看此图的大图。

图2:三重培养BBB模型的特性评估 。 （A）BLEC（Claudin-5:CLD5，Zona Occludens-1:ZO1和VE-Cadherin:Ve-Cadh），周细胞（血小板衍生生长因子受体-β:PDGFR-β和desmin）和星形胶质细胞（神经胶质纤维酸性蛋白:GFAP）独特标志物的代表性免疫染色图像。比例尺 = 10 μm。 （B） BLEC 对荧光 BBB 完整性标志物荧光素钠（NaF， 376 Da， Pe: 0.61 ± 0.062）和 FITC-葡聚糖（FD20， 20 kDa， Pe: 0.04 ± 0.005）的细胞旁通透性。N = 3;n = 9。（C）通过定量细胞内R123（124.2%±3.39%）和不含（100%±8.79%）Elacridar来评估ECs中P-gp和BCRP功能。±N = 4;n = 12。使用非配对 t 检验的平均 ± SEM. p = 0.017。 请点击此处查看此图的大图。

图3:与共培养BBB模型相比，评估三重培养模型中BLEC基因表达和独特标记物的蛋白质水平 。 （A）紧密连接蛋白（Claudin-5:CLD5和Zona Occludens-1:ZO1），转运蛋白（葡萄糖转运蛋白-1:GLUT1，P-糖蛋白:PGP和乳腺癌抗性蛋白:BCRP）和大分子受体（转铁蛋白受体:TRFR）的基因表达，通过RPLP0的表达标准化。N = 3;n = 9。（B）紧密连接蛋白（CLD5和ZO1），转运蛋白（GLUT1，PGP和BCRP）和大分子受体（TRFR）的蛋白质水平，通过β-肌动蛋白的表达标准化。N = 3;n = 9。平均± SEM。对于（A）和（B），值>1对应于三重培养模型中较高的基因表达或蛋白质水平。红线对应于值 1，其中两个模型的表达水平（基因或蛋白质）相等。 请点击此处查看此图的大图。

图 4:测量三重培养模型中的纳米凝胶转运。 （A）纳米凝胶转运测定的示意图。（B）在三重培养模型中孵育24小时后纳米凝胶转运的百分比（5.82%±0.09%）。N = 2;n = 6。平均± SEM。 请点击此处查看此图的大图。

缓冲区的名称		组成			注意
				分子量
磷酸盐缓冲盐水，不含钙镁	PBS-CMF	氯化钠	8 克/升	58.4	将所有化合物加入无菌水中，等待完全溶解。所获得溶液的pH值必须在7.3-7.4的范围内。使用0.22μm膜过滤溶液并将无菌溶液储存在4°C。
		氯化钾	0.2 克/升	74.55
		KH2PO4	0.2 克/升	136.09
		钠高温氧4-12 小时2O	2.87 克/升	358.14
		水
林格赫佩斯	相对湿度	氯化钠	8.8 克/升	58.4	将所有化合物加入无菌水中，等待完全溶解。将pH值调节至7.4（起始溶液pH值约为6.8）。使用0.22μm膜过滤溶液并将无菌溶液储存在4°C。
		氯化钾	0.387 克/升	74.55
		氯化钙2	0.244 克/升	110.99
		氯化镁 2 6H2 O	0.0406 克/升	203.3
		氢氧化钠3	0.504 克/升	84.1
		赫佩斯	1.19 克/升	238.3
		葡萄糖	0.504 克/升	180.16
		水

表 1:协议中使用的不同缓冲区的组成。

讨论

考虑到药物难以越过BBB以达到脑实质中的细胞和分子靶标，脑部疾病的治疗仍然是一个挑战。

脑部疾病的药物开发目前表现出较低的成功率，因为在临床前模型中显示出有希望的结果的大多数药物在临床上使用时都没有显示出任何益处。遵循旨在减少用于实验的动物数量的"3R规则"，开发了BBB的 体外 模型来研究大脑病理并预测药物的大脑渗透²⁹。BBB的 体外 模型主要使用动物细胞开发，并且变得更加复杂以提高所获得结果的相关性¹⁶。使用人类细胞的重大进步之一，在细胞和分子水平上为研究人类疾病机制带来了不可否认的新见解和更高的特异性¹⁶。然而，相关模型的开发需要考虑BBB 体外 模型设置的改进以及动物模型产生的知识。因此，需要考虑BBB结构的复杂性以及细胞-细胞通讯在生理和病理条件下研究BBB的重要性³⁰。

这里介绍的协议描述了一种建立完整的人BBB 体外 模型的方法，该模型包括BBB的三种主要细胞类型，而不受访问脑组织的限制。作为一种多细胞系统，BBB特性的诱导和维持，无需人工使用紧固化合物，而是通过细胞间通讯诱导，在生理上更具有相关性，并且符合 体内 诱导BBB特性³¹。因此，尊重协议的时间顺序对于协议的成功至关重要。此外，三重培养设置期间和组装三种细胞类型后的孵育时间代表了方案的主要关键步骤。

EC中的BBB特性是由与周细胞共培养诱导的，如共培养模型²⁴所述。因此，插入过滤器背面的周细胞培养是最关键的点，需要严格遵守协议，冒着没有足够的周细胞来诱导BBB特性的风险。首先，在包衣过程和细胞接种过程中，必须注意不要让培养皿的覆盖物与包衣和培养基接触，一旦细胞接种，以确保过滤器的良好涂层并且不会丢失细胞（步骤2.2.1和2.2.4）。此外，一旦周细胞接种，必须等待周细胞附着的指定时间（步骤2.2.4），然后再恢复插入过滤器以在另一侧包被和接种ECs（步骤2.2.5和2.3）。接种后，需要六天通过细胞间通讯诱导BBB特性（步骤2.4）。

该模型在受限渗透率（与紧密连接设置相关）方面进行了验证，因为三重培养模型的EC显示BBB完整性标记的渗透率值类似于验证的共培养模型，并且在经过验证的动物或人类模型中也进行了测量¹⁶，^27，32。此外，体外BBB模型的验证除了限制通透性外，还需要对NVU的其他细胞类型的响应性以及功能受体和转运蛋白的表达¹⁶。此外，该模型具有可重复性，可生成多个插入过滤器和孔，以分别对每种细胞类型进行大量分析（基因和蛋白质表达、荧光染色、毒性测试），而无需细胞分选方法。

该模型是使用0.4μm孔径过滤器开发的，在插入过滤器的每一侧都有一个细胞类型。插入过滤系统允许通过在含有良好物质的星形胶质细胞上转移来研究生理条件下的细胞 - 细胞通讯。与初始体外共培养模型²⁴相比，系统中星形胶质细胞的存在代表了一个加值。事实上，考虑到星形胶质细胞在BBB生理学中的重要性，这第三种细胞类型允许进一步了解BBB内的细胞 - 细胞通讯。此外，三细胞培养系统也可以在中风等病理条件下进行研究，其中星形胶质细胞在其中起着至关重要的作用³³，^34，35。此外，插入过滤器两侧的BLEC/周细胞的设计可以很容易地放置在其他细胞类型上，以模拟病理状况，例如脑癌²³。

插入过滤器的孔径可能会给某些实验带来限制，例如跨BBB的细胞迁移。然而，具有较大孔径的模型的开发需要调整协议以确保形成生理单层EC而不是多层，这与模仿BBB³⁶在生理上无关。

该模型的适用性已通过NGs转运实验得到证明，展示了使用多细胞系统进行转运实验的可能性。然而，人们应该意识到在运输实验中使用对照化合物或分子的困难，与NG具有可比的性质，因为每个纳米结构都表现出一组独特的性质（分子量，电荷，形状，物理性质，蛋白质电晕形成）。

该模型的一个局限性是没有剪切应力，这已被证明会影响EC的分化和TJ蛋白的表达³⁷。然而，考虑到在多细胞系统中添加需要特定设备的流体部分的复杂性，开发模拟脑毛细血管的流体系统具有挑战性。此外，特定装置通常不是市售的，并且不允许多次复制，从而使流体系统不太适合高通量使用。

总之，这种由人类细胞组成的三重培养系统在 体外 复制了BBB的结构。它允许生成许多插入片段，可用于化合物的广泛筛选。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture
Astocyte Medium (AM)	ScienCell	1801
Astrocyte Growth Supplement	ScienCell	1852	Astrocyte Growth Supplement is provided in the AM set.
Cell culture dish 100 mm	Corning	430293	100 mm x 20 mm; dish used for the thawing of ECs and PCs before the triculture setting
Cell culture dish 150 mm	Corning	430599	The height of these dishes (25 mm) allows the seeding of PCs in the reverted insert for the setting of the triculture model.
Collagen I	Corning	354236	Rat tail
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	31600-083	Powder
Endothelial Cell Growth Supplement	ScienCell	1051	Endothelial Cell Growth Supplement is provided in the ECM set.
Endothelial Cell Medium (ECM)	ScienCell	1001
Fetal Calf Serum	Sigma	F7524
Gelatin	Sigma	G2500	2% gelatin from porcine skin in PBS-CMF
Gentamicin	BiochromA6	A-2712
Glucose	Sigma	G6152	Powder
Glutamine	Merck	1002891000
Human Brain Cortex Astrocytes	ScienCell	1800-SC
Malassez cell counting chamber	vWR	HECH40453702	The count was performed manually.
Matrigel	Corning	354230	Extracellular matrix-based hydrogel
Penicillin/Streptomycin	ScienCell	0503	Penicillin/Streptomycin solution is provided in the ECM and AM sets.
Poly-L-lysine	ScienCell	0413
Steritop	Millipore System	SCGPT0SRE	0.22 µm pore size
Transwell insert	Corning	3401	0.4 µm pore polycarbonate filter
Trypsin/EDTA neutralization solution	ScienCell	0113
Trypsin/EDTA solution	ScienCell	0103
Immunocytochemistry
SEA BLOCK blocking buffer	ThermoScientific	37527
Alexa Fluor 568 anti-Mouse secondary antibody	Thermofisher	A11031	Dilution 1:500
Alexa Fluor 568 anti-Rabbit secondary antibody	Thermofisher	A11036	Dilution 1:500
Anti-Claudin-5 primary antibody	InVitrogen	34-1600	Dilution 1:100
Anti-Desmin primary antibody	Abcam	ab6322	Dilution 1:200
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein primary antibody	Dako	Z0334	Dilution 1:500
Anti-Platelet-Derived Growth Factor-β primary antibody	Abcam	ab51090	Dilution 1:200
Anti-VE-cadherin primary antibody	Abcam	ab207732	Dilution 1:200
Anti-Zona Occludens-1 primary antibody	InVitrogen	61-7300	Dilution 1:200
Normal Goat Serum	Sigma	G6767
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI	Invitrogen	P36962
Gene expression
NucleoSpin Rna/Protein Macherey Nagel Kit	Macherey-Nagel	740,933,250
96 multiplate well	Biorad	HSP9601
iSCRIPT	Biorad	1708841
Sealer sheet	Biorad	MSB1001
SsoFast EvaGreen Supermix	Biorad	172-5201
Protein expression
2x Laemli Sample Buffer	Biorad	161-0737	Add 50 µL of bMercaptoetanol to 950 µL of Laemmli Buffer and store at -20°C. Dilute 1:1 with the protein sample for the assay.
Anti-Breast Cancer Resistance Protein primary antibody	Abcam	ab207732	Pre-treatment 15 minutes at RT under agitation; dilution 1:1000, O.N. at 4°C
Anti-Claudin-5 primary antibody	Abcam	ab15106	Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C
Anti-Glucose Transporter 1 primary antibody	Millipore	07-1401	Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C
Anti-Mouse secondary antibody	Dako	P0447	Dilution 1:5000 in TBS-Tween
Anti-P-glycoprotein primary antibody	Genetex	GTX23364	Pre-treatment 15 minutes at RT under agitation; dilution 1:400, 3 hours at RT
Anti-Rabbit secondary antibody	Dako	P0448	Dilution 1:8000 in TBS-Tween
Anti-Transferrin Receptor primary antibody	Abcam	ab84036	Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C
Anti-Zona occludens-1 primary antibody	Abcam	ab216880	Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C
Criterion TGX Gel	Biorad	5678083
ECL Prime Solution	Amersham	RPN2236	Revelation solution to keep in the dark
Phospatase inhibitor cocktail 2	Sigma	P5726
Phospatase inhibitor cocktail 3	Sigma	P0044
Protease Inhibitor	Sigma	P8340
Protein Standards	Biorad	161-0373	Molecular weight markers
RIPA 10x	Millipore	20-188
TBS 10x	Biorad	1706435
TRIS-Glycine	Biorad	1610771
Tween	Biorad	1706531
BBB integrity assay
Sodium Fluorescein	Ampresco	0681	λex= 490 nm; λem= 525 nm
Elacridar	Sigma	SML0486	GF120918
FITC-Dextran 20 kDa	Sigma	FD-20S	λex= 490 nm; λem=  525 nm
Rhodamine 123	Sigma	R8004	λex= 501 nm; λem= 538 nm
SynergyTM H1	BioTek Instruments		Fluorescent multiplate reader
Nanogel Transport
Syringe	Terumo	SS+01T1	1 mL syringe
Filter	FisherScientific	15161499	0.2 µm PTFE membrane filter, 15 mm diameter
N-Isopropylacrylamide (NIPAM)-based hydrogels			The nanogels (NGs) used in the study are provided by our collaborator in Queen Mary University London, Department of Chemistry. The NGs are covalently tagged with a fluorescent molecule (λex= 477 nm; λem= 540 nm). NGs are freeze dried and shipped as powder, in this state they are stable at room temperature for long period of time.