用于研究喉移植的异位小鼠模型

摘要

本手稿的目的是描述在小鼠中进行异位喉移植所需的显微外科步骤。与其他喉移植动物模型相比，该小鼠模型的优势在于其成本效益以及免疫学测定和数据的可用性。

摘要

喉异位移植虽然在技术上具有挑战性，但与其他动物模型相比，它提供了更多的科学分析和成本效益。虽然Shipchandler等人在2009年首次描述了这项技术，但这种技术并未被广泛使用，可能是由于学习显微外科技术的困难和掌握它所需的时间。本文详细描述了手术步骤，以及需要避免的潜在陷阱，以鼓励有效使用该技术。

在该模型中，供体喉的双侧颈动脉与受体颈动脉和颈外静脉吻合，允许血液流经移植物。术中可通过观察移植物双侧颈动脉充血、移植物甲状腺变红以及移植物微血管出血来确认血流。成功的关键因素包括精细保存移植血管，进行正确大小的动脉切开术和静脉切开术，以及在动脉-动脉和动脉-静脉吻合上使用适当数量的缝合线，以固定血管而不会渗漏并防止闭塞。

任何人都可以通过足够的培训精通该模型，并在大约 3 小时内执行该过程。如果成功执行，该模型可以轻松且低成本地进行免疫学研究。

引言

对于患有无法修复的喉损伤或喉癌的患者，全喉切除术通常是唯一的选择¹.全喉切除术使患者除了经历社会和心理困扰外，还无法自行呼吸和说话².需要全喉切除术的喉癌患者是喉移植的绝佳潜在候选人。虽然已经在喉损伤无法弥补的情况下进行了人喉移植，但由于担心肿瘤复发、慢性排斥反应的可能性和供体来源的感染，目前这些患者避免进行喉部同种异体移植³。免疫抑制是这些问题的主要原因。常规免疫抑制治疗后，首例部分喉移植患者因肿瘤复发而急剧丢失，这证明在喉癌患者进一步尝试移植之前，应设计适当的免疫抑制方案^4，5。

为了更好地了解宿主对移植喉的免疫反应，Strome于1992年开发了第一个大鼠喉移植模型，并于2002年对手术技术进行了改进6^，7。尽管该模型对研究喉移植有效，但由于缺乏大鼠特异性免疫制剂以及与大鼠模型相关的较高成本，导致在2009年开发了用于研究喉移植的新小鼠模型^8。

所述技术的主要应用是研究喉移植中的不同免疫抑制药物....

研究方案

这项研究是根据妙佑医疗国际机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 进行的。BalbC小鼠（10-12周龄）用作供体，C57 / BL6小鼠（10-12周龄）用作受体，因为它们的主要组织相容性复合体H-2Db和H-2Kb分别在免疫学上不相容，因此可以进一步研究对移植物的免疫反应。手术期间使用的所有器械都进行了灭菌（见补充图 S1 和 补充图S2），并且根据IACUC说明在整个方案中保持手术区域无菌。

1. 供体手术和移植物采购

1. 在开始手术前30分钟向供体注射缓释丁丙诺啡（皮下注射3.25mg / kg体重）。将小鼠置于啮齿动物麻醉盒中，以3%异氟醚以1L / min O₂ 流量输送麻醉诱导。动物完全麻醉后，将小鼠转移到剃须区域并施用1.5%异氟醚和1L / min_{O 2} 流量以维持麻醉。用脚趾捏确认麻醉深度。
2. 将鼠标的胸部和颈部剃到下颌线，并涂抹脱毛膏。30秒后，用水润湿的无菌纱布垫擦拭乳膏，并将小鼠转移到手术区域。
3. 在鼠标的眼睛上涂抹眼睛润滑剂。将鼠标放在悬垂的补充加热垫上，以确保适当的体温。
4. 固定小鼠，用聚维酮碘和酒精准备手术区域三次，然后将小鼠悬垂。
   注意：通过捏住脚趾检查麻醉深度，并在整个过程中通过面罩将麻醉保持在 1.5....

结果

确认移植成功
使用上述协议，可以通过观察取下血管夹后供体颈动脉的脉动来评估流向LTE复合体的血流量。脉动通常是可见的，供体动脉的立即红色确认活跃的血流（图4A）。如果吻合无效，动脉将不会有搏动，看起来部分塌陷，颜色苍白（图4B）。

确认动脉通畅的另一种技术是在移除夹子后寻找供体甲状腺的颜色?.......

讨论

在过去的三十年中，喉癌的发病率和患病率分别增加了12%和24%，其中许多患者接受了喉切除术进行治疗¹⁰。这种手术会显着恶化一个人的生活质量，因此需要替代治疗。喉部血管化复合同种异体移植可以改善患者的呼吸和说话能力;然而，在该技术可用于临床上该患者群体之前，仍需要进行研究。本文提供了一种具有成本效益的喉移植小鼠模型，可以研究各种免疫抑制方案。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1 Paperclips	Staples	OP-7404	Clips are shaped manually to be used as retractors
1 cc Insulin Syringes	BD	329412	27 G 5/8
10-0 Ethilon Nylon Suture	Ethicon	2870G
25 G Precision Glide Needle	BD	305125	1 in
3 mL Luer-Lok Tip Syringe	BD	309657
30 G Sterile Standard Blunt Needles	Cellink	NZ5300505001
5-0 Monocryl Suture	Ethicon	Y822G
8-0 Ethilon Nylon Suture	Ethicon	2815G
Adson Forceps	Fine Science Tools	11027-12	Straight, 1 x 2 teeth
Adventitia scissors	S&T	SAS-10	19 mm, 10 cm, straight
Angled Forceps	Fine Science Tools	00109-11	45/11 cm
Artifical Tears Lubricant Opthalmic Ointment	Akorn Animal Health	59399-162-35
Bandaid Fabric Fingertip	Cardinal Healthcare	299399
Betadine Solution Swabsticks	Purdue Products	67618-153-01
Buprenex Injection	CIII	12495-0757-1	0.3 mg/mL
Clamp applying forceps without lock	Accurate Surgical & Scientific Instruments	ASSI.CAF5	14 cm
Cotton Swabs	Puritan	10806-001-PK
DeBakey forceps
Dermabond Mini	Cardinal Healthcare	315999
Dissecting Boards	Mopec	22-444-314
Falcon Sterile Disposable Petri Dish	Corning	25373-041	35 mm
Fine Scisssors	Fine Science Tools	14029-10	Curved Sharp-Blunt 10 cm
Golden A5 2-Speed Blade Clipper	Oster	008OST-78005-140	#10
Hair Remover Sensitive Formula	Nair	2260000033
Heparin	Meitheal Pharmaceuticals	71288-4O2-10	10,000 USP units per 10 mL
Isoflurane	Piramal Healthcare	66794-013-25
Low-Temp Micro Fine Tip Cautery	Bovie Medical	AA90
Mercian Visibility Background Material	Synovis Micro Companies	VB3	Green
Microvascular Approximator Clamp without Frame	Accurate Surgical & Scientific Instruments	ASSI.ABB11V	0.4-1 mm Vessel Diameter
Mouse face mask kit	Xenotec	XRK-S	Small
Needle holder	S&T	C-14 W	5.5", 8 mm, 0.4 mm
Press n' Seal	Glad	70441
Scalpel	Braun	BA210	10 blade
Single Mini Vessel Clamp	Accurate Surgical & Scientific Instruments	ASSI.ABB11M	.31 (8 mm), 3 x 1 mm Rnd. Bl., Black Pair
Stereomicroscope	Olympus	SZ61
Sterile Alcohol Prep Pads	Fisherbrand	06-669-62
Sterile Disposable Drape Sheets	Dynarex	DYN4410-CASE
Sterile Gauze Pads	Dukal	1212
Sterile Saline	Hospira	236173	NaCl 0.9%
Sterile Surgical Gloves	Gammex	851_A
Straight Forceps	Fine Science Tools	00108-11	11 cm
Tissue forceps	Accurate Surgical & Scientific Instruments	ASSI.JFLP3	13.5 cm, 8 mm, 0.3 mm
Vannas Pattern Scissors	Accurate Surgical & Scientific Instruments	ASSI.SDC15RV	15 cm, 8 mm, curved 7mm blade
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-10	3 mm cutting edge, curved
Vessel Dilator Tip	Fine Science Tools	00126-11	Diameter 0.1 mm/Angled 10/11 cm
Vessel Dilator, Classic line	S&T	D-5a.3 W	9 mm, 0.3 mm, angled 10