用于研究喉移植的异位小鼠模型

摘要

本手稿的目的是描述在小鼠中进行异位喉移植所需的显微外科步骤。与其他喉移植动物模型相比，该小鼠模型的优势在于其成本效益以及免疫学测定和数据的可用性。

摘要

喉异位移植虽然在技术上具有挑战性，但与其他动物模型相比，它提供了更多的科学分析和成本效益。虽然Shipchandler等人在2009年首次描述了这项技术，但这种技术并未被广泛使用，可能是由于学习显微外科技术的困难和掌握它所需的时间。本文详细描述了手术步骤，以及需要避免的潜在陷阱，以鼓励有效使用该技术。

在该模型中，供体喉的双侧颈动脉与受体颈动脉和颈外静脉吻合，允许血液流经移植物。术中可通过观察移植物双侧颈动脉充血、移植物甲状腺变红以及移植物微血管出血来确认血流。成功的关键因素包括精细保存移植血管，进行正确大小的动脉切开术和静脉切开术，以及在动脉-动脉和动脉-静脉吻合上使用适当数量的缝合线，以固定血管而不会渗漏并防止闭塞。

任何人都可以通过足够的培训精通该模型，并在大约 3 小时内执行该过程。如果成功执行，该模型可以轻松且低成本地进行免疫学研究。

引言

对于患有无法修复的喉损伤或喉癌的患者，全喉切除术通常是唯一的选择¹.全喉切除术使患者除了经历社会和心理困扰外，还无法自行呼吸和说话².需要全喉切除术的喉癌患者是喉移植的绝佳潜在候选人。虽然已经在喉损伤无法弥补的情况下进行了人喉移植，但由于担心肿瘤复发、慢性排斥反应的可能性和供体来源的感染，目前这些患者避免进行喉部同种异体移植³。免疫抑制是这些问题的主要原因。常规免疫抑制治疗后，首例部分喉移植患者因肿瘤复发而急剧丢失，这证明在喉癌患者进一步尝试移植之前，应设计适当的免疫抑制方案^4，5。

为了更好地了解宿主对移植喉的免疫反应，Strome于1992年开发了第一个大鼠喉移植模型，并于2002年对手术技术进行了改进6^，7。尽管该模型对研究喉移植有效，但由于缺乏大鼠特异性免疫制剂以及与大鼠模型相关的较高成本，导致在2009年开发了用于研究喉移植的新小鼠模型^8。

所述技术的主要应用是研究喉移植中的不同免疫抑制药物方案。改善目前的免疫抑制疗法可能会扩大候选库，并导致癌症患者的安全移植。该小鼠模型的优点是其成本效益以及免疫学数据和试剂的广泛可用性。

研究喉移植免疫抑制治疗方案的团队可以使用这种方法收集大量的免疫学数据，并且可以快速测试和比较不同的药物方案。其他可以调节对移植免疫反应的潜在治疗方式，例如干细胞注射，也可以使用该模型进行测试。最后，可以通过延长随访期来观察喉移植的长期全身效应。

这里描述的技术使用端对侧吻合为异位喉移植物提供动脉和静脉血流。移植物是一种喉气管食管 （LTE） 复合体，包括供体的喉、甲状腺、甲状旁腺、气管和食道，双侧颈动脉和椎弓根完好无损。一条供体颈动脉吻合到受者颈动脉并提供动脉血流，而另一条供体颈动脉与受体颈外静脉吻合并提供静脉血流（图1）。

对大鼠模型的手术技术进行了一些修改，以确保小鼠模型的成功。例如，使用吸入麻醉剂代替注射剂，以增加对麻醉深度的控制并减少并发症。连续缝合用于大鼠的动脉 - 动脉吻合术;然而，由于小鼠血管的尺寸较小，这在技术上是困难的，并且可能导致血管管腔⁷变窄。因此，在小鼠模型中使用中断缝合线，并改善血管通畅性。此外，在大鼠模型中，甲状腺上动脉（STA）椎弓根被解剖并可视化。鉴于小鼠中STA的尺寸较小，这种解剖可能导致STA的损伤甚至横断。因此，它不会在鼠标模型中剖析。相反，附近的筋膜被保留以确保 STA 保持完整。

该技术的主要潜在缺陷包括损坏供体LTE复合椎弓根，进行尺寸不正确的动脉切开术或静脉切开术，吻合部位的血管闭塞或在吻合部位留下可能导致出血的间隙。为避免这些失误，在获取供体移植物时必须小心，在STA椎弓根周围留下一束组织。动脉切开术和静脉切开术应足够大以允许血液流动，但又应足够小以防止渗漏。吻合缝应使用适当数量的缝合线以缝合任何间隙，但不要太多以阻塞血管。

如果熟悉显微外科技术，该过程可以在大约3小时内进行。这种喉移植模型可以在小鼠中可靠地进行，并用于研究血管化复合同种异体移植后的宿主免疫反应。

研究方案

这项研究是根据妙佑医疗国际机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 进行的。BalbC小鼠（10-12周龄）用作供体，C57 / BL6小鼠（10-12周龄）用作受体，因为它们的主要组织相容性复合体H-2Db和H-2Kb分别在免疫学上不相容，因此可以进一步研究对移植物的免疫反应。手术期间使用的所有器械都进行了灭菌（见补充图 S1 和 补充图S2），并且根据IACUC说明在整个方案中保持手术区域无菌。

1. 供体手术和移植物采购

1. 在开始手术前30分钟向供体注射缓释丁丙诺啡（皮下注射3.25mg / kg体重）。将小鼠置于啮齿动物麻醉盒中，以3%异氟醚以1L / min O₂ 流量输送麻醉诱导。动物完全麻醉后，将小鼠转移到剃须区域并施用1.5%异氟醚和1L / min_{O 2} 流量以维持麻醉。用脚趾捏确认麻醉深度。
2. 将鼠标的胸部和颈部剃到下颌线，并涂抹脱毛膏。30秒后，用水润湿的无菌纱布垫擦拭乳膏，并将小鼠转移到手术区域。
3. 在鼠标的眼睛上涂抹眼睛润滑剂。将鼠标放在悬垂的补充加热垫上，以确保适当的体温。
4. 固定小鼠，用聚维酮碘和酒精准备手术区域三次，然后将小鼠悬垂。
   注意:通过捏住脚趾检查麻醉深度，并在整个过程中通过面罩将麻醉保持在 1.5% 异氟醚和 1 L/min O₂ 流量。
5. 做一个小的水平切口，刚好优于胸骨上切口。使用细剪刀，通过该切口将皮肤双侧抬高至下颌骨。切除梯形皮肤节段，导致双侧唾液腺、胸腺瘤肌肉、二腹肌和胸骨上侧暴露（图 2A）。
6. 使用上部的烧灼术切除双侧唾液腺，其中可以看到穿过腺体的小静脉（图2A）。
   注意:如果在移除腺体之前不注意烧灼血管，则在此步骤中可能会遇到大量出血。
7. 轻轻地向侧面回缩淋巴和脂肪组织，露出胸骨瘤和绑带肌肉。从周围组织中解剖双侧胸骨瘤肌，并使用牵开器将其横向缩回。
   注意:此操作将完全暴露带有带状肌肉的LTE复合体，并为解剖颈动脉提供舒适的工作空间（图2B）。
8. 在带状肌肉之间做一个中线切口并双侧切除它们，注意不要损坏下面的甲状腺并将其留在 LTE 复合体上。
   注意:完成此步骤后，双侧颈动脉应该是可见的（图2C）。
9. 将颈总动脉圆周解剖至锁骨下部水平，上部至颈动脉分叉水平。从颈动脉解剖迷走神经和颈内静脉。不要将它们包含在采购的移植物中。
   注意:可以看到甲状腺上动脉刚好优于内侧行进的分叉。保持该血管周围的薄筋膜完整，不要试图圆周解剖它。该血管为LTE复合体提供血流，并将在移植后用作椎弓根。保护这艘船至关重要。
10. 解剖颈内动脉和颈外动脉，使其能够结扎和分裂。如果血管可视化有困难，请使用单独的牵开器横向缩回二腹肌。
    注意:避免将颈外动脉解剖到靠近分叉处的地方，以防止对甲状腺上动脉造成任何损害。在这一步中，可以遇到枕动脉，其从颈外动脉分支并平行于颈内动脉，不应与颈内动脉混淆，颈内动脉更大且发现更深（图2D）。
11. 使用 8-0尼龙缝合线，结扎颈内动脉，比颈动脉分叉高2至3毫米。结扎颈外动脉至少3毫米，高于甲状腺上动脉的分支点。
    注意:在这些结扎后，LTE复合体将通过甲状腺上动脉 到 双侧颈动脉进行椎弓根切除。
12. 在胸骨水平结扎颈总动脉，并双侧切断所有结扎血管。将血管蒂放在LTE复合体的顶部，以避免在进一步解剖过程中意外损坏。为防止任何气体泄漏或麻醉意外丢失，请确保动物在进行任何气道切割之前已过期。
13. 在舌骨水平处划分舌骨下肌。创建一个仅次于舌骨的前咽切开术。将切口向下带到椎前筋膜，以释放LTE复合体。
14. 将气管横断到第五气管环下方，并将切口穿过食道向下传递到椎前筋膜，以释放下部LTE复合体。将气管和食道从下到上方向从下到上方向从下椎前筋膜中释放出来。
    注意:将血管蒂放在LTE复合体的顶部，以避免在进一步解剖过程中意外损坏。
15. 创建一个仅次于舌骨的前咽切开术。将切口向下带到椎前筋膜，以释放LTE复合体。在LTE复合物和周围组织之间分割任何剩余的淋巴或结缔组织附着物。移除移植物。
    注意:移植物包含供体喉，气管，甲状腺，甲状旁腺，食道和喉部肌肉作为复合单元（图2E）。

2. 移植物制备

1. 将获得的移植物放入无菌培养皿中，并用生理盐水清洗以去除任何血栓。使用微型镊子，轻轻地挤出双侧颈动脉中的血液和凝块。使用1mm微扩张器扩张双侧颈动脉。
2. 使用 30 G 钝尖针头，在每个颈动脉中注射约 2 mL 肝素化盐水以冲洗移植物。
   注意:可以看到血液和盐水从对侧颈动脉和小游离血管末端冲洗出来，这证实了甲状腺上动脉的完整。
3. 将外膜从动脉末端切除，使其边缘干净，以便吻合。
   注意:移植物可以留在肝素化盐水中，并且可以短暂休息长达3小时，然后再将其移植到受体⁹中。

3.受者手术和血管吻合术

1. 在麻醉诱导，剃须和手术准备步骤之后，以与供体描述的相同方式准备受体小鼠。在手术开始前30分钟皮下注射受体小鼠缓释镇痛药。
2. 使用手术刀，做一个中线颈部切口，从下颌线向上延伸到胸骨下部。抬高左侧的皮肤并横向缩回。
3. 如前所述切除左唾液腺，烧灼上血管。通过用低温烧灼分开任何可见的血管来切除脂肪和淋巴组织，注意不要损坏下面的颈外静脉（图3A）。
4. 沿颈外静脉圆周解剖。使用至少 5 mm 的血管净长进行吻合。使用低温烧灼或结扎术，并将任何从颈静脉分支的相对较大的静脉分开。
5. 解剖胸骨瘤肌并将其横向缩回。将解剖的静脉保护在肌肉后面，以避免与牵开器直接接触。
6. 切除左带肌以进入受者颈动脉。从锁骨下到颈动脉上部颈动脉分叉的环形解剖（图3B）。
7. 将背景材料传递到颈外静脉下，并应用双近似 V3 血管夹。
8. 将 10-0 尼龙缝合线穿过颈外静脉前壁的所需静脉切开术的位置，并使用该缝合线向前拉动血管并搭起帐篷。
9. 用显微剪刀切到缝合线，刚好足够深，以创建适当大小的单缝静脉切开术，并确保切口完全穿过静脉壁。
10. 使用30 G钝尖针，用肝素化盐水冲洗静脉内部。
11. 将供体LTE复合物放置在受者左颈动脉和左颈外静脉之间。将供体左颈动脉的自由端对准受体左颈外静脉，并用锋利的剪刀斜切血管末端。
12. 使用四条10-0尼龙中断缝合线，以端到端的方式吻合供体左颈动脉和受体左颈外静脉。
13. 将背景材料滑动到受体颈总动脉下方，并将双近似 A3 血管夹放在受体颈总动脉上。以与静脉切开术相同的方式创建动脉切开术。
    注意:确保动脉切开术与供体颈动脉管腔的大小相同。如果太大，取下夹子后会发生大量出血。如果太小，流向移植物的血液会受阻。
14. 使用六条10-0尼龙中断缝合线，将供体右颈动脉以端到端的方式吻合到受体左颈动脉。
    注意:在整个血管吻合术中应尊重正确的微血管技术。通过后壁会导致血流严重收缩，危及移植物的存活。由于血管尺寸小，尝试重新缝合非常困难。
15. 取下静脉侧的夹子。如果遇到出血，请用棉签轻轻按压。
16. 取下动脉上的夹子，立即用棉尖轻轻按压。
    注意:此步骤预计会有一些出血，通常在 1 分钟后以温和的压力停止。
17. 检查动脉和静脉中血流的完整性。
    注意:在动脉血流完整的情况下，通常可以看到供体颈动脉的搏动，供体甲状腺从其冲洗的透明颜色变回其原始的红色。还可以观察到LTE复合体上小型船只的红色。
18. 用肝素化盐水冲洗手术区域，并以运行方式用5-0单丝缝合线关闭皮肤切口。在切口上涂抹抗生素软膏或皮肤粘合剂。
19. 皮下注射 1 mL 温盐水，以解决手术期间的液体流失。
20. 停止麻醉并将鼠标转移到恢复笼中。在加热垫上观察鼠标，直到它完全清醒以避免体温过低。

结果

确认移植成功
使用上述协议，可以通过观察取下血管夹后供体颈动脉的脉动来评估流向LTE复合体的血流量。脉动通常是可见的，供体动脉的立即红色确认活跃的血流（图4A）。如果吻合无效，动脉将不会有搏动，看起来部分塌陷，颜色苍白（图4B）。

确认动脉通畅的另一种技术是在移除夹子后寻找供体甲状腺的颜色?...

讨论

在过去的三十年中，喉癌的发病率和患病率分别增加了12%和24%，其中许多患者接受了喉切除术进行治疗¹⁰。这种手术会显着恶化一个人的生活质量，因此需要替代治疗。喉部血管化复合同种异体移植可以改善患者的呼吸和说话能力;然而，在该技术可用于临床上该患者群体之前，仍需要进行研究。本文提供了一种具有成本效益的喉移植小鼠模型，可以研究各种免疫抑制方案。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1 Paperclips	Staples	OP-7404	Clips are shaped manually to be used as retractors
1 cc Insulin Syringes	BD	329412	27 G 5/8
10-0 Ethilon Nylon Suture	Ethicon	2870G
25 G Precision Glide Needle	BD	305125	1 in
3 mL Luer-Lok Tip Syringe	BD	309657
30 G Sterile Standard Blunt Needles	Cellink	NZ5300505001
5-0 Monocryl Suture	Ethicon	Y822G
8-0 Ethilon Nylon Suture	Ethicon	2815G
Adson Forceps	Fine Science Tools	11027-12	Straight, 1 x 2 teeth
Adventitia scissors	S&T	SAS-10	19 mm, 10 cm, straight
Angled Forceps	Fine Science Tools	00109-11	45/11 cm
Artifical Tears Lubricant Opthalmic Ointment	Akorn Animal Health	59399-162-35
Bandaid Fabric Fingertip	Cardinal Healthcare	299399
Betadine Solution Swabsticks	Purdue Products	67618-153-01
Buprenex Injection	CIII	12495-0757-1	0.3 mg/mL
Clamp applying forceps without lock	Accurate Surgical & Scientific Instruments	ASSI.CAF5	14 cm
Cotton Swabs	Puritan	10806-001-PK
DeBakey forceps
Dermabond Mini	Cardinal Healthcare	315999
Dissecting Boards	Mopec	22-444-314
Falcon Sterile Disposable Petri Dish	Corning	25373-041	35 mm
Fine Scisssors	Fine Science Tools	14029-10	Curved Sharp-Blunt 10 cm
Golden A5 2-Speed Blade Clipper	Oster	008OST-78005-140	#10
Hair Remover Sensitive Formula	Nair	2260000033
Heparin	Meitheal Pharmaceuticals	71288-4O2-10	10,000 USP units per 10 mL
Isoflurane	Piramal Healthcare	66794-013-25
Low-Temp Micro Fine Tip Cautery	Bovie Medical	AA90
Mercian Visibility Background Material	Synovis Micro Companies	VB3	Green
Microvascular Approximator Clamp without Frame	Accurate Surgical & Scientific Instruments	ASSI.ABB11V	0.4-1 mm Vessel Diameter
Mouse face mask kit	Xenotec	XRK-S	Small
Needle holder	S&T	C-14 W	5.5", 8 mm, 0.4 mm
Press n' Seal	Glad	70441
Scalpel	Braun	BA210	10 blade
Single Mini Vessel Clamp	Accurate Surgical & Scientific Instruments	ASSI.ABB11M	.31 (8 mm), 3 x 1 mm Rnd. Bl., Black Pair
Stereomicroscope	Olympus	SZ61
Sterile Alcohol Prep Pads	Fisherbrand	06-669-62
Sterile Disposable Drape Sheets	Dynarex	DYN4410-CASE
Sterile Gauze Pads	Dukal	1212
Sterile Saline	Hospira	236173	NaCl 0.9%
Sterile Surgical Gloves	Gammex	851_A
Straight Forceps	Fine Science Tools	00108-11	11 cm
Tissue forceps	Accurate Surgical & Scientific Instruments	ASSI.JFLP3	13.5 cm, 8 mm, 0.3 mm
Vannas Pattern Scissors	Accurate Surgical & Scientific Instruments	ASSI.SDC15RV	15 cm, 8 mm, curved 7mm blade
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-10	3 mm cutting edge, curved
Vessel Dilator Tip	Fine Science Tools	00126-11	Diameter 0.1 mm/Angled 10/11 cm
Vessel Dilator, Classic line	S&T	D-5a.3 W	9 mm, 0.3 mm, angled 10