Un modello murino eterotopico per lo studio del trapianto laringeo

Riepilogo

Lo scopo di questo manoscritto è quello di descrivere le fasi microchirurgiche necessarie per eseguire un trapianto laringeo eterotopico nei topi. I vantaggi di questo modello murino rispetto ad altri modelli animali di trapianto laringeo sono il suo rapporto costo-efficacia e la disponibilità di saggi e dati immunologici.

Abstract

Il trapianto eterotopico laringeo, sebbene sia una procedura tecnicamente impegnativa, offre maggiori analisi scientifiche e benefici in termini di costi rispetto ad altri modelli animali. Sebbene descritta per la prima volta da Shipchandler et al. nel 2009, questa tecnica non è ampiamente utilizzata, probabilmente a causa delle difficoltà nell'apprendimento della tecnica microchirurgica e del tempo necessario per padroneggiarla. Questo documento descrive in dettaglio i passaggi chirurgici, nonché le potenziali insidie da evitare, al fine di incoraggiare un uso efficace di questa tecnica.

In questo modello, le arterie carotidi bilaterali della laringe donatrice sono anastomizzate, all'arteria carotide ricevente e alla vena giugulare esterna, consentendo il flusso sanguigno attraverso l'innesto. Il flusso sanguigno può essere confermato intraoperatoriamente dalla visualizzazione del riempimento del sangue nelle arterie carotidi bilaterali dell'innesto, dall'arrossamento delle ghiandole tiroidee dell'innesto e dal sanguinamento dai micro vasi nell'innesto. Gli elementi cruciali per il successo includono la delicata conservazione dei vasi dell'innesto, l'arteriotomia e la venotomia delle dimensioni corrette e l'utilizzo del numero appropriato di punti di sutura sulle anastomosi arterioso-arteriose e arterioso-venose per fissare i vasi senza perdite e prevenire l'occlusione.

Chiunque può diventare esperto in questo modello con una formazione sufficiente ed eseguire la procedura in circa 3 ore. Se eseguito con successo, questo modello consente di eseguire studi immunologici con facilità e a basso costo.

Introduzione

Per i pazienti affetti da danni irreparabili alla laringe o cancro della laringe, una laringectomia totale è spesso l'unica opzione¹. La laringectomia totale lascia i pazienti senza la capacità di respirare e parlare da soli, oltre a sperimentare disagio sociale e psicologico². I pazienti con cancro della laringe che necessitano di una laringectomia totale sono eccellenti potenziali candidati per il trapianto laringeo. Mentre è stato eseguito il trapianto laringeo umano nel contesto di danni laringei irreparabili, l'allotrapianto della laringe è attualmente evitato in questi pazienti a causa del timore di recidiva del tumore, della possibilità di rigetto cronico e delle infezioni derivate dal donatore³. L'immunosoppressione è la causa principale di queste preoccupazioni. La drammatica perdita del primo paziente con trapianto parziale di laringe a causa della recidiva del tumore dopo trattamento immunosoppressivo convenzionale è la prova che un regime immunosoppressivo appropriato dovrebbe essere messo a punto prima di ulteriori tentativi di trapianto nei pazienti con cancro della laringe ^4,5.

Per comprendere meglio la risposta immunitaria dell'ospite a una laringe trapiantata, il primo modello di trapianto laringeo nei ratti è stato sviluppato nel 1992 da Strome, e miglioramenti alla tecnica chirurgica sono stati apportati nel 2002 ^6,7. Sebbene questo modello sia efficace per lo studio del trapianto laringeo, la mancanza di agenti immunologici specifici per il ratto e il costo più elevato associato ai modelli di ratto hanno portato allo sviluppo di un nuovo modello murino per lo studio del trapianto laringeo nel 2009⁸.

L'applicazione principale della tecnica descritta è studiare diversi regimi farmacologici immunosoppressori nel trapianto laringeo. Il miglioramento delle attuali terapie immunosoppressive può ampliare il pool di candidati e portare a un trapianto sicuro nei pazienti oncologici. I vantaggi di questo modello murino sono il suo rapporto costo-efficacia e l'ampia disponibilità di dati immunologici e reagenti.

I team che lavorano su regimi di trattamento immunosoppressivo per il trapianto laringeo possono utilizzare questo metodo per raccogliere un grande volume di dati immunologici e diversi regimi farmacologici possono essere rapidamente testati e confrontati. Altre potenziali modalità di trattamento che possono modulare la risposta immunitaria al trapianto, come le iniezioni di cellule staminali, possono anche essere testate utilizzando questo modello. Infine, possono essere ideati esperimenti per osservare gli effetti sistemici a lungo termine del trapianto laringeo estendendo il periodo di follow-up.

La tecnica qui descritta utilizza anastomosi end-to-side per fornire flusso arterioso e venoso a un innesto eterotopico di laringe. L'innesto è un complesso laringotracheoesofageo (LTE) che comprende la laringe, le ghiandole tiroidee, le ghiandole paratiroidi, la trachea e l'esofago del donatore, con arterie carotidi bilaterali e peduncoli intatti. Un'arteria carotide donatrice è anastomizzata all'arteria carotide ricevente e fornisce il flusso sanguigno arterioso, mentre l'altra arteria carotide donatrice è anastomizzata alla vena giugulare esterna ricevente e fornisce il flusso sanguigno venoso (Figura 1).

Sono state apportate diverse modifiche alla tecnica chirurgica del modello di ratto per garantire il successo nel modello murino. Ad esempio, è stato utilizzato un agente anestetico inalato al posto di un agente iniettabile per aumentare il controllo sulla profondità dell'anestesia e ridurre le complicanze. La sutura continua viene utilizzata nell'anastomosi arterioso-arteriosa nei ratti; Tuttavia, a causa delle dimensioni ridotte dei vasi del topo, questo è tecnicamente difficile e può causare il restringimento del lume 7 del vaso^. Di conseguenza, le suture interrotte vengono utilizzate nel modello murino e migliorano la pervietà del vaso. Inoltre, nel modello di ratto, il peduncolo dell'arteria tiroidea superiore (STA) viene sezionato e visualizzato. Date le dimensioni più piccole della STA nei topi, questa dissezione potrebbe causare danni e persino la transezione dello STA. Di conseguenza, non viene sezionato nel modello murino. Invece, la fascia vicina viene preservata per garantire che la STA sia mantenuta intatta.

Le principali potenziali insidie di questa tecnica includono il danneggiamento dei peduncoli complessi LTE del donatore, l'arteriotomia o la venotomia di dimensioni errate, l'occlusione dei vasi nei siti di anastomosi o il lasciare spazi vuoti nei siti di anastomosi che possono causare sanguinamento. Per evitare questi passi falsi, è necessario prestare attenzione quando si procura l'innesto del donatore lasciando un bracciale di tessuto attorno al peduncolo STA. L'arteriotomia e la venotomia dovrebbero essere abbastanza grandi da consentire il flusso sanguigno, ma abbastanza piccole da prevenire perdite. Un numero appropriato di punti di sutura dovrebbe essere usato per le anastomosi per chiudere eventuali spazi vuoti, ma non troppi per occludere i vasi.

Se si ottiene familiarità con le tecniche microchirurgiche, questa procedura può essere eseguita in circa 3 ore. Questo modello di trapianto laringeo può essere eseguito in modo affidabile nei topi e utilizzato per studiare la risposta immunitaria dell'ospite dopo allotrapianto composito vascolarizzato.

Protocollo

Questa ricerca è stata eseguita in conformità con il Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). I topi BalbC (10-12 settimane) sono stati utilizzati come donatori e i topi C57 / BL6 (10-12 settimane) sono stati utilizzati come riceventi perché i loro principali complessi di istocompatibilità, H-2Db e H-2Kb, rispettivamente, sono immunologicamente incompatibili e quindi la risposta immunitaria all'innesto può essere ulteriormente studiata. Tutti gli strumenti utilizzati durante l'intervento chirurgico sono stati sterilizzati (vedi Figura supplementare S1 e Figura supplementare S2) e il campo chirurgico è stato mantenuto sterile per tutto il protocollo secondo le istruzioni IACUC.

1. Chirurgia del donatore e acquisizione dell'innesto

1. Iniettare al donatore buprenorfina a rilascio prolungato (3,25 mg/kg di peso corporeo per via sottocutanea) 30 minuti prima di iniziare la procedura. Posizionare il topo nella scatola dell'anestesia del roditore per l'induzione dell'anestesia al 3% di isoflurano erogato con 1 L/min O₂ flusso. Dopo che l'animale è completamente anestetizzato, trasferire il topo nell'area di rasatura e somministrare isoflurano all'1,5% con flusso di 1 L/min O₂ per il mantenimento dell'anestesia. Confermare la profondità dell'anestesia con un pizzico di punta.
2. Rasare il petto e il collo del topo fino alla mascella e applicare la crema depilatoria. Dopo 30 secondi, pulire la crema con una garza sterile bagnata con acqua e trasferire il mouse nell'area chirurgica.
3. Applicare lubrificante per gli occhi del topo. Posizionare il mouse su una piastra riscaldante supplementare drappeggiata per garantire una corretta temperatura corporea.
4. Immobilizzare il topo, preparare l'area chirurgica tre volte con iodio povidone e alcool, quindi drappeggiare il topo.
   NOTA: Controllare la profondità dell'anestesia con un pizzico del dito del piede e mantenere l'anestesia all'1,5% di isoflurano e 1 L / min O₂ flusso tramite una maschera facciale durante la procedura.
5. Fai una piccola incisione orizzontale appena superiore alla tacca soprasternale. Usando le forbici sottili, sollevare la pelle bilateralmente attraverso quell'incisione fino alla mandibola. Eliminare un segmento cutaneo a forma di trapezio con conseguente esposizione delle ghiandole salivari bilaterali, dei muscoli sternomastoidei, dei muscoli digastrici e dell'aspetto superiore dello sterno (Figura 2A).
6. Eliminare le ghiandole salivari bilaterali usando il cauterizzazione nella parte superiore dove viene visualizzata una piccola vena che viaggia attraverso la ghiandola (Figura 2A).
   NOTA: Se non si presta attenzione a cauterizzare la nave prima di rimuovere la ghiandola, in questa fase si può riscontrare un sanguinamento significativo.
7. Ritrarre delicatamente i tessuti linfoidi e adiposi lateralmente per esporre i muscoli sternomastoidi e cinghia. Sezionare i muscoli sternomastoidei bilaterali dai tessuti circostanti e ritrarli lateralmente usando i divaricatori.
   NOTA: Questa manovra esporrà completamente il complesso LTE con i muscoli della cinghia e fornirà uno spazio di lavoro confortevole per la dissezione delle arterie carotidi (Figura 2B).
8. Fare un'incisione della linea mediana tra i muscoli della cinghia e asportarli bilateralmente, facendo attenzione a non danneggiare la ghiandola tiroidea sottostante e lasciandola sul complesso LTE.
   NOTA: Dopo questo passaggio, le arterie carotidi bilaterali dovrebbero essere visibili (Figura 2C).
9. Sezionare circonferenzialmente le arterie carotidi comuni al livello della clavicola inferiormente e al livello della biforcazione carotidea superiormente. Sezionare il nervo vago e la vena giugulare interna dalle arterie carotidi. Non includerli nell'innesto procurato.
   NOTA: L'arteria tiroidea superiore può essere vista appena superiore alla biforcazione che viaggia medialmente. Lasciare intatta la fascia sottile che circonda questo vaso e non tentare di sezionarlo circonferenzialmente. Questa nave fornisce il flusso sanguigno al complesso LTE e fungerà da peduncolo dopo il trapianto. La conservazione di questa nave è della massima importanza.
10. Sezionare le arterie carotidi interne ed esterne abbastanza in alto da essere in grado di legare e dividere. Se c'è difficoltà con la visualizzazione dei vasi, utilizzare un divaricatore separato per ritrarre i muscoli digastrici lateralmente.
    NOTA: Evitare di sezionare l'arteria carotide esterna più vicino alla biforcazione per evitare danni all'arteria tiroidea superiore. In questa fase, l'arteria occipitale, che si dirama dalla carotide esterna e segue parallelamente all'arteria carotide interna, può essere incontrata e non deve essere confusa con l'arteria carotide interna, che è più grande e si trova più in profondità (Figura 2D).
11. Utilizzo di 8-0 suture di nylon, ligate le arterie carotidi interne da 2 a 3 mm superiori alla biforcazione carotidea. Ligare le arterie carotidi esterne almeno 3 mm superiore al punto di ramificazione dell'arteria tiroidea superiore.
    NOTA: Dopo queste legature, il complesso LTE sarà pedicolata attraverso le arterie tiroidee superiori alle arterie carotidi bilaterali.
12. Ligare le arterie carotidi comuni a livello dello sterno e tagliare bilateralmente tutti i vasi legati. Mantenere i peduncoli vascolari sulla parte superiore del complesso LTE per evitare danni accidentali durante un'ulteriore dissezione. Per evitare perdite di gas o perdita involontaria di anestesia, assicurarsi che l'animale sia scaduto prima di effettuare tagli alle vie aeree.
13. Dividere i muscoli infraioidi a livello dello ioide. Creare una faringotomia anteriore appena inferiore allo ioide. Portare l'incisione fino alla fascia prevertebrale per liberare il complesso LTE superiormente.
14. Transettare la trachea sotto il quinto anello tracheale e portare l'incisione attraverso l'esofago fino alla fascia prevertebrale per liberare il complesso LTE inferiormente. Liberare la trachea e l'esofago dalla fascia prevertebrale sottostante da una direzione inferiore a superiore.
    NOTA: Mantenere i peduncoli vascolari sulla parte superiore del complesso LTE per evitare danni accidentali durante un'ulteriore dissezione.
15. Creare una faringotomia anteriore appena inferiore allo ioide. Portare l'incisione fino alla fascia prevertebrale per liberare il complesso LTE superiormente. Dividere eventuali attacchi linfoidi o del tessuto connettivo rimanenti tra il complesso LTE e il tessuto circostante. Rimuovere l'innesto.
    NOTA: L'innesto contiene la laringe donatrice, la trachea, le ghiandole tiroidee, le ghiandole paratiroidi, l'esofago e i muscoli laringei come unità composita (Figura 2E).

2. Preparazione dell'innesto

1. Posizionare l'innesto procurato in una piastra di Petri sterile e lavarlo con soluzione salina normale per eliminare eventuali coaguli di sangue. Utilizzando micro pinze, mungere delicatamente il sangue e coaguli dalle arterie carotidi bilaterali. Dilatare le arterie carotidi bilaterali usando microdilatatori da 1 mm.
2. Utilizzando un ago a punta smussata da 30 G, iniettare circa 2 ml di soluzione salina eparinizzata in ciascuna arteria carotide per lavare l'innesto.
   NOTA: Il sangue e la soluzione salina possono essere visti fluire fuori dall'arteria carotide controlaterale e piccole estremità dei vasi liberi, che conferma intatte arterie tiroidee superiori.
3. Eliminare l'avventizia lontano dalle estremità arteriose in modo che abbiano bordi puliti per l'anastomosi.
   NOTA: L'innesto può essere lasciato in soluzione salina eparinizzata e una breve pausa può essere presa per un massimo di 3 ore prima di trapiantarlo nel ricevente⁹.

3. Chirurgia ricevente e anastomosi dei vasi

1. Preparare il topo ricevente nello stesso modo descritto per il donatore dopo l'induzione dell'anestesia, la rasatura e le fasi di preparazione chirurgica. Iniettare al topo ricevente un analgesico a rilascio prolungato per via sottocutanea 30 minuti prima dell'inizio dell'intervento.
2. Usando un bisturi, fai un'incisione del collo della linea mediana che si estende dalla mascella superiormente allo sterno inferiormente. Sollevare la pelle sul lato sinistro e ritrarla lateralmente.
3. Eliminare la ghiandola salivare sinistra, cauterizzando i vasi superiori come descritto in precedenza. Asportare il tessuto adiposo e linfoide dividendo eventuali vasi visibili con cauterizzazione a bassa temperatura, facendo attenzione a non danneggiare la vena giugulare esterna sottostante (Figura 3A).
4. Sezionare circonferenzialmente la vena giugulare esterna. Utilizzare almeno 5 mm di lunghezza libera della nave per l'anastomosi. Utilizzare cauterizzazione o ligate a bassa temperatura e dividere eventuali vene relativamente grandi che si diramano dalla vena giugulare.
5. Sezionare il muscolo sternomastoideo e ritrarlo lateralmente. Mantenere la vena sezionata protetta dietro il muscolo per evitare il contatto diretto con il divaricatore.
6. Eliminare i muscoli della cinghia sinistra per accedere all'arteria carotide ricevente. Sezionare circonferenzialmente l'arteria carotide comune dalla clavicola inferiormente fino alla biforcazione carotidea superiormente (Figura 3B).
7. Passare il materiale di fondo sotto la vena giugulare esterna e applicare i morsetti V3 a doppia approssimazione del vaso.
8. Posizionare una sutura di nylon 10-0 attraverso la parete anteriore della vena giugulare esterna nella posizione della venotomia desiderata e utilizzare questa sutura per tirare anteriormente e tendere la nave.
9. Tagliare la sutura con microforbici abbastanza in profondità da creare la venotomia a fessura singola della giusta dimensione e assicurarsi che il taglio sia completamente attraverso la parete venosa.
10. Utilizzando un ago a punta smussata da 30 G, lavare l'interno della vena con soluzione salina eparinizzata.
11. Posizionare il complesso LTE del donatore tra l'arteria carotide sinistra ricevente e la vena giugulare esterna sinistra. Allineare l'estremità libera dell'arteria carotide sinistra del donatore verso la vena giugulare esterna sinistra del ricevente e smussare le estremità dei vasi con forbici affilate.
12. Utilizzando quattro suture interrotte in nylon 10-0, anastomosi l'arteria carotide sinistra del donatore e la vena giugulare esterna sinistra del ricevente in modo end-to-side.
13. Far scorrere il materiale di sfondo sotto l'arteria carotide comune ricevente e posizionare i morsetti del vaso A3 a doppia approssimazione sull'arteria carotide comune ricevente. Creare un'arteriotomia allo stesso modo della venotomia.
    NOTA: Assicurarsi che l'arteriotomia abbia le stesse dimensioni del lume dell'arteria carotide del donatore. Se è troppo grande, si verificherà un sanguinamento abbondante dopo la rimozione dei morsetti. Se è troppo piccolo, il flusso di sangue all'innesto sarà ostruito.
14. Anastomosi l'arteria carotide destra del donatore all'arteria carotide sinistra ricevente in modo end-to-side utilizzando sei suture interrotte in nylon 10-0.
    NOTA: La corretta tecnica microvascolare deve essere rispettata durante tutta l'anastomosi del vaso. Il passaggio attraverso la parete posteriore provoca un flusso sanguigno notevolmente ristretto, mettendo in pericolo la sopravvivenza dell'innesto. A causa delle piccole dimensioni delle navi, cercare di rifare le suture è molto difficile.
15. Rimuovere i morsetti sul lato venoso. Se si riscontra sanguinamento, applicare una leggera pressione con punte di cotone.
16. Rimuovere i morsetti sull'arteria e applicare immediatamente una leggera pressione con punte di cotone.
    NOTA: In questa fase è previsto un certo sanguinamento, che di solito si interrompe dopo 1 minuto con una leggera pressione.
17. Controllare l'integrità del flusso sanguigno nell'arteria e nella vena.
    NOTA: Con il flusso arterioso intatto, di solito si vede la pulsazione dell'arteria carotide del donatore e la ghiandola tiroidea del donatore cambia dal suo colore trasparente arrossato al suo colore rossastro originale. Si può anche osservare la colorazione rossa delle piccole navi sul complesso LTE.
18. Irrigare il campo chirurgico con soluzione salina eparinizzata e chiudere l'incisione cutanea con una sutura monofilamento 5-0 in modo corrente. Applicare un unguento antibiotico o un adesivo cutaneo sull'incisione.
19. Iniettare 1 mL di soluzione salina calda per via sottocutanea per tenere conto della perdita di liquidi durante l'intervento chirurgico.
20. Interrompere l'anestesia e trasferire il mouse in una gabbia di recupero. Osservare il mouse su una piastra riscaldante fino a quando non è completamente sveglio per evitare l'ipotermia.

Risultati

Conferma del successo del trapianto
Utilizzando il protocollo sopra descritto, è possibile valutare il flusso sanguigno al complesso LTE osservando la pulsazione dell'arteria carotide del donatore dopo aver rimosso i morsetti dei vasi. La pulsazione è tipicamente visibile e l'immediata colorazione rossa dell'arteria donatrice conferma il flusso sanguigno attivo (Figura 4A). Se l'anastomosi non è efficace, l'arteria non avrà pulsazione, apparirà parzialmente collassat...

Discussione

L'incidenza e la prevalenza del cancro della laringe sono aumentate rispettivamente del 12% e del 24% negli ultimi tre decenni e molti di questi pazienti subiscono una laringectomia per il trattamento¹⁰. Questa procedura peggiora significativamente la qualità della vita di una persona e quindi è necessario un trattamento alternativo. L'allotrapianto composito vascolarizzato della laringe può migliorare la capacità del paziente di respirare e parlare; Tuttavia, la ricerca è ancora necessaria p...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1 Paperclips	Staples	OP-7404	Clips are shaped manually to be used as retractors
1 cc Insulin Syringes	BD	329412	27 G 5/8
10-0 Ethilon Nylon Suture	Ethicon	2870G
25 G Precision Glide Needle	BD	305125	1 in
3 mL Luer-Lok Tip Syringe	BD	309657
30 G Sterile Standard Blunt Needles	Cellink	NZ5300505001
5-0 Monocryl Suture	Ethicon	Y822G
8-0 Ethilon Nylon Suture	Ethicon	2815G
Adson Forceps	Fine Science Tools	11027-12	Straight, 1 x 2 teeth
Adventitia scissors	S&T	SAS-10	19 mm, 10 cm, straight
Angled Forceps	Fine Science Tools	00109-11	45/11 cm
Artifical Tears Lubricant Opthalmic Ointment	Akorn Animal Health	59399-162-35
Bandaid Fabric Fingertip	Cardinal Healthcare	299399
Betadine Solution Swabsticks	Purdue Products	67618-153-01
Buprenex Injection	CIII	12495-0757-1	0.3 mg/mL
Clamp applying forceps without lock	Accurate Surgical & Scientific Instruments	ASSI.CAF5	14 cm
Cotton Swabs	Puritan	10806-001-PK
DeBakey forceps
Dermabond Mini	Cardinal Healthcare	315999
Dissecting Boards	Mopec	22-444-314
Falcon Sterile Disposable Petri Dish	Corning	25373-041	35 mm
Fine Scisssors	Fine Science Tools	14029-10	Curved Sharp-Blunt 10 cm
Golden A5 2-Speed Blade Clipper	Oster	008OST-78005-140	#10
Hair Remover Sensitive Formula	Nair	2260000033
Heparin	Meitheal Pharmaceuticals	71288-4O2-10	10,000 USP units per 10 mL
Isoflurane	Piramal Healthcare	66794-013-25
Low-Temp Micro Fine Tip Cautery	Bovie Medical	AA90
Mercian Visibility Background Material	Synovis Micro Companies	VB3	Green
Microvascular Approximator Clamp without Frame	Accurate Surgical & Scientific Instruments	ASSI.ABB11V	0.4-1 mm Vessel Diameter
Mouse face mask kit	Xenotec	XRK-S	Small
Needle holder	S&T	C-14 W	5.5", 8 mm, 0.4 mm
Press n' Seal	Glad	70441
Scalpel	Braun	BA210	10 blade
Single Mini Vessel Clamp	Accurate Surgical & Scientific Instruments	ASSI.ABB11M	.31 (8 mm), 3 x 1 mm Rnd. Bl., Black Pair
Stereomicroscope	Olympus	SZ61
Sterile Alcohol Prep Pads	Fisherbrand	06-669-62
Sterile Disposable Drape Sheets	Dynarex	DYN4410-CASE
Sterile Gauze Pads	Dukal	1212
Sterile Saline	Hospira	236173	NaCl 0.9%
Sterile Surgical Gloves	Gammex	851_A
Straight Forceps	Fine Science Tools	00108-11	11 cm
Tissue forceps	Accurate Surgical & Scientific Instruments	ASSI.JFLP3	13.5 cm, 8 mm, 0.3 mm
Vannas Pattern Scissors	Accurate Surgical & Scientific Instruments	ASSI.SDC15RV	15 cm, 8 mm, curved 7mm blade
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-10	3 mm cutting edge, curved
Vessel Dilator Tip	Fine Science Tools	00126-11	Diameter 0.1 mm/Angled 10/11 cm
Vessel Dilator, Classic line	S&T	D-5a.3 W	9 mm, 0.3 mm, angled 10