Гетеротопная модель мыши для изучения трансплантации гортани

Резюме

Целью этой рукописи является описание микрохирургических этапов, необходимых для выполнения гетеротопной трансплантации гортани у мышей. Преимуществами этой мышиной модели по сравнению с другими животными моделями трансплантации гортани являются ее экономическая эффективность и доступность иммунологических анализов и данных.

Аннотация

Гетеротопная трансплантация гортани, хотя и является технически сложной процедурой, предлагает больше научного анализа и экономических преимуществ по сравнению с другими моделями животных. Хотя эта техника впервые описана Шипчандлером и др. в 2009 году, она не получила широкого распространения, возможно, из-за трудностей в изучении микрохирургической техники и времени, необходимого для ее освоения. В этой статье подробно описываются хирургические этапы, а также потенциальные подводные камни, которых следует избегать, чтобы стимулировать эффективное использование этой техники.

В этой модели двусторонние сонные артерии донорской гортани анастомозируются к сонной артерии реципиента и наружной яремной вене, что позволяет кровотоку через трансплантат. Кровоток может быть подтвержден интраоперационно визуализацией наполнения крови в двусторонних сонных артериях трансплантата, покраснением щитовидной железы трансплантата и кровотечением из микрососудов в трансплантате. Важнейшими элементами успеха являются деликатное сохранение сосудов трансплантата, проведение артериотомии и венотомии правильного размера, а также использование соответствующего количества швов на артериально-артериальных и артериально-венозных анастомозах для обеспечения безопасности сосудов без утечки и предотвращения окклюзии.

Любой желающий может овладеть этой моделью с достаточной подготовкой и выполнить процедуру примерно за 3 часа. В случае успешного выполнения эта модель позволяет проводить иммунологические исследования с легкостью и по низкой цене.

Введение

Для пациентов, страдающих непоправимым повреждением гортани или раком гортани, тотальная ларингэктомия часто является единственным вариантом¹. Тотальная ларингэктомия оставляет пациентов без возможности дышать и говорить самостоятельно, в дополнение к переживанию социального и психологического стресса². Пациенты с раком гортани, которые нуждаются в тотальной ларингэктомии, являются отличными потенциальными кандидатами на трансплантацию гортани. В то время как трансплантация гортани человека в условиях непоправимого повреждения гортани была выполнена, аллотрансплантация гортани в настоящее время избегается у этих пациентов из-за страха рецидива опухоли, возможности хронического отторжения и инфекций донорского происхождения³. Иммуносупрессия является основной причиной этих проблем. Резкая потеря первого пациента с частичной трансплантацией гортани из-за рецидива опухоли после обычного иммуносупрессивного лечения является свидетельством того, что соответствующий иммуносупрессивный режим должен быть разработан до дальнейших попыток трансплантации у пациентов с раком гортани ^4,5.

Чтобы лучше понять иммунный ответ хозяина на пересаженную гортань, первая модель трансплантации гортани у крыс была разработана в 1992 году Стромом, а улучшения в хирургической технике были сделаны в 2002 году ^6,7. Хотя эта модель эффективна для изучения трансплантации гортани, отсутствие специфических для крыс иммунологических агентов и более высокая стоимость, связанная с моделями крыс, привели к разработке новой мышиной модели для изучения трансплантации гортани в 2009^году8.

Основным применением описанной методики является изучение различных схем иммуносупрессивных препаратов при трансплантации гортани. Улучшение современных иммуносупрессивных методов лечения может расширить пул кандидатов и привести к безопасной трансплантации у больных раком. Преимуществами этой мышиной модели являются ее экономическая эффективность и широкая доступность иммунологических данных и реагентов.

Команды, работающие над иммуносупрессивными схемами лечения трансплантации гортани, могут использовать этот метод для сбора большого объема иммунологических данных, а различные схемы лечения могут быть быстро протестированы и сопоставлены. Другие потенциальные методы лечения, которые могут модулировать иммунный ответ на трансплантацию, такие как инъекции стволовых клеток, также могут быть протестированы с использованием этой модели. Наконец, эксперименты могут быть разработаны для наблюдения долгосрочных системных эффектов трансплантации гортани путем продления периода наблюдения.

Метод, описанный здесь, использует сквозные анастомозы для обеспечения артериального и венозного потока к гетеротопному трансплантату гортани. Трансплантат представляет собой ларинготрахеэзофагеальный (LTE) комплекс, включающий гортань, щитовидную железу, паращитовидные железы, трахею и пищевод донора, с двусторонними сонными артериями и нетронутыми ножками. Одна донорская сонная артерия анастомозируется к сонной артерии реципиента и обеспечивает артериальный кровоток, в то время как другая донорская сонная артерия анастомозируется к наружной яремной вене реципиента и обеспечивает венозный кровоток (рисунок 1).

Несколько модификаций были внесены в хирургическую технику модели крысы, чтобы обеспечить успех в мышиной модели. Например, вместо инъекционного агента использовался ингаляционный анестетик для повышения контроля над глубиной анестезии и уменьшения осложнений. Непрерывное наложение швов применяется при артериально-артериальном анастомозе у крыс; однако из-за меньшего размера сосудов мышей это технически сложно и может вызвать сужение просвета сосуда⁷. В результате прерывистые швы используются в мышиной модели и приводят к улучшению проходимости сосудов. Кроме того, в модели крысы верхняя ножка щитовидной артерии (STA) рассечена и визуализирована. Учитывая меньший размер STA у мышей, это рассечение может привести к повреждению и даже трансекции STA. В результате он не препарируется в мышиной модели. Вместо этого близлежащая фасция сохраняется, чтобы гарантировать, что STA остается нетронутым.

Основные потенциальные подводные камни этого метода включают повреждение донорских ножек комплекса LTE, проведение артериотомии или венотомии неправильного размера, окклюзию сосудов в местах анастомоза или оставление пробелов в местах анастомоза, которые могут вызвать кровотечение. Чтобы избежать этих ошибок, необходимо соблюдать осторожность при приобретении донорского трансплантата, оставляя манжету ткани вокруг ножки STA. Артериотомия и венотомия должны быть достаточно большими, чтобы обеспечить кровоток, но достаточно маленькими, чтобы предотвратить утечку. Для анастомозов должно быть использовано соответствующее количество швов, чтобы закрыть любые промежутки, но не слишком много, чтобы закрыть сосуды.

Если получено знакомство с микрохирургическими методиками, эту процедуру можно выполнить примерно через 3 ч. Эта модель трансплантации гортани может быть надежно выполнена на мышах и использована для изучения иммунного ответа хозяина после васкуляризированной композитной аллотрансплантации.

протокол

Это исследование было выполнено в соответствии с Комитетом по уходу и использованию животных клиники Майо (IACUC). Мыши BalbC (10-12 недель) использовались в качестве доноров, а мыши C57 / BL6 (10-12 недель) использовались в качестве реципиентов, потому что их основные комплексы гистосовместимости, H-2Db и H-2Kb, соответственно, иммунологически несовместимы, и поэтому иммунный ответ на трансплантат может быть дополнительно изучен. Все инструменты, используемые во время операции, были стерилизованы (см. Дополнительный рисунок S1 и Дополнительный рисунок S2), а хирургическое поле оставалось стерильным на протяжении всего протокола в соответствии с инструкциями IACUC.

1. Донорская хирургия и закупка трансплантата

1. Вводят донору бупренорфин с пролонгированным высвобождением (3,25 мг/кг массы тела подкожно) за 30 мин до начала процедуры. Поместите мышь в ящик для анестезии грызунов для индукции анестезии при 3% изофлуране, доставляемом потоком 1 л /мин O₂ . После того, как животное будет полностью обезболено, перенесите мышь в область бритья и введите 1,5% изофлурана с потоком 1 л/мин O₂ для поддержания анестезии. Подтвердите глубину анестезии ущемлением пальца ноги.
2. Побрейте грудь и шею мыши до линии челюсти и нанесите крем для депиляции. Через 30 с протрите крем стерильной марлевой прокладкой, смоченной водой, и перенесите мышь в хирургическую область.
3. Нанесите смазку для глаз мыши на глаза мыши. Поместите мышь на драпированную дополнительную грелку, чтобы обеспечить правильную температуру тела.
4. Обездвижьте мышь, трижды подготовьте хирургическую область повидон-йодом и спиртом, а затем задрапируйте мышь.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте глубину анестезии с помощью щипка пальца ноги и поддерживайте анестезию на уровне 1,5% изофлурана и 1 л / мин O₂ потока через маску для лица на протяжении всей процедуры.
5. Сделайте небольшой горизонтальный разрез, чуть превосходящий надгрудничную выемку. Используя тонкие ножницы, поднимите кожу двусторонне через этот разрез до нижней челюсти. Иссечение трапециевидного сегмента кожи, приводящего к воздействию двусторонних слюнных желез, стерномастоидных мышц, дигастральных мышц и верхнего аспекта грудины (рисунок 2А).
6. Иссечение двусторонних слюнных желез с помощью прижигания в верхней части, где визуализируется небольшая вена, проходящая через железу (рисунок 2А).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если не принять меры для прижигания сосуда перед удалением железы, на этом этапе может возникнуть значительное кровотечение.
7. Осторожно втягивайте лимфоидную и жировую ткани сбоку, чтобы обнажить грудиномастоидные и ремешковые мышцы. Рассекайте двусторонние грудиномастоидные мышцы от окружающих тканей и втягивайте их латерально с помощью втягивателей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот маневр полностью обнажит комплекс LTE с ремешковыми мышцами и обеспечит комфортное рабочее пространство для рассечения сонных артерий (рисунок 2B).
8. Сделайте разрез средней линии между мышцами ремешка и двусторонне иссекните их, заботясь о том, чтобы не повредить подлежащую щитовидную железу и оставив ее на комплексе LTE.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После этого этапа должны быть видны двусторонние сонные артерии (рисунок 2C).
9. По окружности рассекают общие сонные артерии до уровня ключицы ниже и до уровня бифуркации сонной артерии выше. Рассечение блуждающего нерва и внутренней яремной вены от сонных артерий. Не включайте их в закупаемый трансплантат.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Верхняя щитовидная артерия может быть замечена только выше бифуркации, путешествующей медиально. Оставьте тонкую фасцию, окружающую этот сосуд, неповрежденной и не пытайтесь рассечь ее по окружности. Этот сосуд снабжает кровоток к комплексу LTE и будет служить ножкой после трансплантации. Сохранение этого судна имеет первостепенное значение.
10. Рассекайте внутренние и наружные сонные артерии достаточно далеко, чтобы иметь возможность связывать и разделять. Если есть трудности с визуализацией сосудов, используйте отдельный втягиватель для втягивания дигастральных мышц сбоку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте рассечения наружной сонной артерии ближе к бифуркации, чтобы предотвратить любое повреждение верхней артерии щитовидной железы. На этом этапе можно встретить затылочную артерию, которая ответвляется от наружной сонной артерии и следует параллельно внутренней сонной артерии, и ее не следует путать с внутренней сонной артерией, которая больше и находится глубже (рисунок 2D).
11. Использование 8-0 нейлоновые швы, перевязывают внутренние сонные артерии на 2 - 3 мм лучше, чем сонная бифуркация. Лигат наружных сонных артерий не менее чем на 3 мм превосходит точку ветвления верхней щитовидной артерии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После этих перевязок комплекс LTE будет педикирован через верхние артерии щитовидной железы к двусторонним сонным артериям.
12. Обжигайте общие сонные артерии на уровне грудины и перерезайте все перевязанные сосуды двусторонне. Держите сосудистые ножки поверх комплекса LTE, чтобы избежать случайного повреждения во время дальнейшего рассечения. Чтобы предотвратить утечку газа или непреднамеренную потерю анестезии, убедитесь, что срок годности животного истек, прежде чем делать какие-либо порезы дыхательных путей.
13. Разделите инфрагиоидные мышцы на уровне подъязычной кости. Создают переднюю глоточную глотокомию, как раз уступающую подъязычной. Проведите разрез вниз к превертебральной фасции, чтобы лучше освободить комплекс LTE.
14. Трансектируйте трахею ниже пятого трахеального кольца и проведите разрез через пищевод вниз к превертебральной фасции, чтобы освободить комплекс LTE ниже. Освободите трахею и пищевод от подлежащей превертебральной фасции с нижнего к верхнему направлению.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите сосудистые ножки поверх комплекса LTE, чтобы избежать случайного повреждения во время дальнейшего рассечения.
15. Создают переднюю глоточную глотокомию, как раз уступающую подъязычной. Проведите разрез вниз к превертебральной фасции, чтобы лучше освободить комплекс LTE. Разделите все оставшиеся лимфоидные или соединительнотканные соединения между комплексом LTE и окружающими тканями. Удалите трансплантат.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трансплантат содержит донорскую гортань, трахею, щитовидную железу, паращитовидные железы, пищевод и мышцы гортани в качестве составной единицы (рисунок 2E).

2. Подготовка трансплантата

1. Поместите полученный трансплантат в стерильную чашку Петри и вымойте его обычным физиологическим раствором, чтобы избавиться от любых сгустков крови. Используя микрощипцы, осторожно дойте кровь и сгустки из двусторонних сонных артерий. Расширяют двусторонние сонные артерии с помощью микродилаторов 1 мм.
2. Используя иглу с тупым наконечником 30 г, введите примерно 2 мл гепаринизированного физиологического раствора в каждую сонную артерию, чтобы промыть трансплантат.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кровь и физиологический раствор могут быть замечены вымыванием из контралатеральной сонной артерии и небольших свободных окончаний сосудов, что подтверждает интактные верхние артерии щитовидной железы.
3. Иссечь адвентицию от артериальных концов, чтобы у них были чистые края для анастомоза.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Трансплантат можно оставить в гепаринизированном физиологическом растворе и сделать небольшой перерыв на срок до 3 ч, прежде чем пересаживать его реципиенту⁹.

3. Реципиентная хирургия и анастомоз сосудов

1. Подготовьте мышь-реципиент таким же образом, как описано для донора после этапа индукции анестезии, бритья и хирургической подготовки. Вводят мышке-реципиенту анальгетик пролонгированного высвобождения подкожно за 30 мин до начала операции.
2. Используя скальпель, сделайте разрез средней линии шеи, простирающийся от линии челюсти выше грудины ниже. Приподнимите кожу с левой стороны и втяните ее сбоку.
3. Иссекайте левую слюнную железу, прижигая высшие сосуды, как описано ранее. Иссекайте жировую и лимфоидную ткань, разделяя любые видимые сосуды низкотемпературным прижиганием, следя за тем, чтобы не повредить подлежащую внешнюю яремную вену (рисунок 3А).
4. Рассекните наружную яремную вену по окружности. Используйте не менее 5 мм прозрачной длины сосуда для анастомоза. Используйте низкотемпературное прижигание или лигат и разделите любые относительно крупные вены, ответвляющиеся от яремной вены.
5. Рассекните грудиномастоидную мышцу и втяните ее латерально. Держите рассеченную вену защищенной позади мышцы, чтобы избежать прямого контакта с втягивающим устройством.
6. Иссекните мышцы левого ремня, чтобы получить доступ к сонной артерии реципиента. По окружности рассекают общую сонную артерию от ключицы ниже до бифуркации сонной артерии (рисунок 3B).
7. Пропустите фоновый материал под наружную яремную вену и нанесите двойные приближающиеся зажимы сосуда V3.
8. Поместите нейлоновый шов 10-0 через переднюю стенку наружной яремной вены в месте нужной венотомии и используйте этот шов, чтобы вытянуть переднюю часть и зафиксировать сосуд.
9. Нарежьте на шов микросубами достаточно глубоко, чтобы создать венотомию подходящего размера однощелевую и обеспечить, чтобы разрез полностью проходил через венозную стенку.
10. Используя иглу с тупым наконечником 30 г, промыть внутреннюю часть вены гепаринизированным физиологическим раствором.
11. Поместите донорский комплекс LTE между левой сонной артерией реципиента и левой наружной яремной веной. Выровняйте свободный конец донорской левой сонной артерии по направлению к левой наружной яремной вене реципиента и острыми ножницами скосите концы сосудов.
12. Используя четыре 10-0 нейлоновых прерванных швов, анастомоз донора левой сонной артерии и реципиента оставила наружную яремную вену сквозным способом.
13. Сдвиньте фоновый материал под общую сонную артерию реципиента и поместите двойные приближающиеся зажимы сосуда А3 на общую сонную артерию реципиента. Создайте артериотомию таким же образом, как и венотомию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что артериотомия имеет тот же размер, что и просвет донорской сонной артерии. Если он слишком большой, после снятия зажимов возникнет обильное кровотечение. Если он слишком мал, приток крови к трансплантату будет затруднен.
14. Анастомоз донорской правой сонной артерии к левой сонной артерии реципиента сквозным способом с использованием шести 10-0 нейлоновых прерванных швов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Правильная микрососудистая техника должна соблюдаться во всем анастомозе сосудов. Прохождение через заднюю стенку приводит к значительному сужению кровотока, что ставит под угрозу выживание трансплантата. Из-за небольших размеров сосудов пытаться переделать швы очень сложно.
15. Снимите зажимы на венозной стороне. При обнаружении кровотечения примените мягкое давление ватными наконечниками.
16. Снимите зажимы на артерии и сразу же приложите мягкое давление ватными наконечниками.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе ожидается некоторое кровотечение, которое обычно прекращается через 1 мин при мягком давлении.
17. Проверьте целостность кровотока в артерии и вене.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При интактном артериальном потоке обычно наблюдается пульсация донорской сонной артерии, и донорская щитовидная железа меняется от своего покрасневшего прозрачного цвета обратно к своему первоначальному красноватому цвету. Также может наблюдаться красная окраска малых судов на комплексе LTE.
18. Орошайте операционное поле гепаринизированным физиологическим раствором и закройте разрез кожи 5-0 монофиламентным швом в режиме бега. Нанесите антибиотическую мазь или кожный клей на разрез.
19. Введите 1 мл теплого физиологического раствора подкожно, чтобы учесть потерю жидкости во время операции.
20. Прекратите анестезию и переведите мышь в клетку восстановления. Наблюдайте за мышью на грелке до тех пор, пока она полностью не проснется, чтобы избежать переохлаждения.

Результаты

Подтверждение успешной трансплантации
Используя протокол, описанный выше, можно оценить приток крови к комплексу LTE, наблюдая пульсацию донорской сонной артерии после удаления зажимов сосудов. Пульсация обычно видна, а немедленная красная окраска донорской артерии подтвер...

Обсуждение

Заболеваемость и распространенность рака гортани увеличились на 12% и 24% соответственно за последние три десятилетия, и многие из этих пациентов проходят ларингэктомию для лечения¹⁰. Эта процедура значительно ухудшает качество жизни человека, а потому желательно альтернат?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1 Paperclips	Staples	OP-7404	Clips are shaped manually to be used as retractors
1 cc Insulin Syringes	BD	329412	27 G 5/8
10-0 Ethilon Nylon Suture	Ethicon	2870G
25 G Precision Glide Needle	BD	305125	1 in
3 mL Luer-Lok Tip Syringe	BD	309657
30 G Sterile Standard Blunt Needles	Cellink	NZ5300505001
5-0 Monocryl Suture	Ethicon	Y822G
8-0 Ethilon Nylon Suture	Ethicon	2815G
Adson Forceps	Fine Science Tools	11027-12	Straight, 1 x 2 teeth
Adventitia scissors	S&T	SAS-10	19 mm, 10 cm, straight
Angled Forceps	Fine Science Tools	00109-11	45/11 cm
Artifical Tears Lubricant Opthalmic Ointment	Akorn Animal Health	59399-162-35
Bandaid Fabric Fingertip	Cardinal Healthcare	299399
Betadine Solution Swabsticks	Purdue Products	67618-153-01
Buprenex Injection	CIII	12495-0757-1	0.3 mg/mL
Clamp applying forceps without lock	Accurate Surgical & Scientific Instruments	ASSI.CAF5	14 cm
Cotton Swabs	Puritan	10806-001-PK
DeBakey forceps
Dermabond Mini	Cardinal Healthcare	315999
Dissecting Boards	Mopec	22-444-314
Falcon Sterile Disposable Petri Dish	Corning	25373-041	35 mm
Fine Scisssors	Fine Science Tools	14029-10	Curved Sharp-Blunt 10 cm
Golden A5 2-Speed Blade Clipper	Oster	008OST-78005-140	#10
Hair Remover Sensitive Formula	Nair	2260000033
Heparin	Meitheal Pharmaceuticals	71288-4O2-10	10,000 USP units per 10 mL
Isoflurane	Piramal Healthcare	66794-013-25
Low-Temp Micro Fine Tip Cautery	Bovie Medical	AA90
Mercian Visibility Background Material	Synovis Micro Companies	VB3	Green
Microvascular Approximator Clamp without Frame	Accurate Surgical & Scientific Instruments	ASSI.ABB11V	0.4-1 mm Vessel Diameter
Mouse face mask kit	Xenotec	XRK-S	Small
Needle holder	S&T	C-14 W	5.5", 8 mm, 0.4 mm
Press n' Seal	Glad	70441
Scalpel	Braun	BA210	10 blade
Single Mini Vessel Clamp	Accurate Surgical & Scientific Instruments	ASSI.ABB11M	.31 (8 mm), 3 x 1 mm Rnd. Bl., Black Pair
Stereomicroscope	Olympus	SZ61
Sterile Alcohol Prep Pads	Fisherbrand	06-669-62
Sterile Disposable Drape Sheets	Dynarex	DYN4410-CASE
Sterile Gauze Pads	Dukal	1212
Sterile Saline	Hospira	236173	NaCl 0.9%
Sterile Surgical Gloves	Gammex	851_A
Straight Forceps	Fine Science Tools	00108-11	11 cm
Tissue forceps	Accurate Surgical & Scientific Instruments	ASSI.JFLP3	13.5 cm, 8 mm, 0.3 mm
Vannas Pattern Scissors	Accurate Surgical & Scientific Instruments	ASSI.SDC15RV	15 cm, 8 mm, curved 7mm blade
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-10	3 mm cutting edge, curved
Vessel Dilator Tip	Fine Science Tools	00126-11	Diameter 0.1 mm/Angled 10/11 cm
Vessel Dilator, Classic line	S&T	D-5a.3 W	9 mm, 0.3 mm, angled 10