Un modelo heterotópico de ratón para estudiar el trasplante de laringe

Resumen

El objetivo de este manuscrito es describir los pasos microquirúrgicos necesarios para realizar un trasplante de laringe heterotópico en ratones. Las ventajas de este modelo de ratón en comparación con otros modelos animales de trasplante de laringe son su costo-efectividad y la disponibilidad de ensayos y datos inmunológicos.

Resumen

El trasplante heterotópico laríngeo, aunque es un procedimiento técnicamente desafiante, ofrece más análisis científicos y beneficios de costos en comparación con otros modelos animales. Aunque fue descrita por primera vez por Shipchandler et al. en 2009, esta técnica no es ampliamente utilizada, posiblemente debido a las dificultades para aprender la técnica microquirúrgica y el tiempo requerido para dominarla. Este documento describe los pasos quirúrgicos en detalle, así como las posibles trampas a evitar, con el fin de fomentar el uso eficaz de esta técnica.

En este modelo, las arterias carótidas bilaterales de la laringe del donante se anastomosan a la arteria carótida receptora y a la vena yugular externa, lo que permite el flujo sanguíneo a través del injerto. El flujo sanguíneo se puede confirmar intraoperatoriamente mediante la visualización del llenado de sangre en las arterias carótidas bilaterales del injerto, el enrojecimiento de las glándulas tiroides del injerto y el sangrado de los microvasos en el injerto. Los elementos cruciales para el éxito incluyen la delicada preservación de los vasos del injerto, la realización del tamaño correcto de arteriotomía y venotomía, y el uso del número apropiado de suturas en las anastomosis arterial-arterial y arterial-venosa para asegurar los vasos sin fugas y evitar la oclusión.

Cualquier persona puede dominar este modelo con suficiente capacitación y realizar el procedimiento en aproximadamente 3 h. Si se realiza con éxito, este modelo permite realizar estudios inmunológicos con facilidad y a bajo costo.

Introducción

Para los pacientes que sufren de daño laríngeo irreparable o cáncer de laringe, una laringectomía total es a menudo la única opción¹. La laringectomía total deja a los pacientes sin la capacidad de respirar y hablar por sí mismos, además de experimentar angustia social y psicológica². Los pacientes con cáncer de laringe que necesitan una laringectomía total son excelentes candidatos potenciales para el trasplante de laringe. Mientras que el trasplante laríngeo humano en el contexto de daño laríngeo irreparable ha sido realizado, el alotrasplante de la laringe se evita actualmente en estos pacientes debido al temor a la recurrencia tumoral, la posibilidad de rechazo crónico y las infecciones derivadas del donante³. La inmunosupresión es la causa principal de estas preocupaciones. La pérdida dramática del primer paciente con trasplante laríngeo parcial debido a la recidiva tumoral después del tratamiento inmunosupresor convencional es evidencia de que se debe diseñar un régimen inmunosupresor apropiado antes de realizar nuevos intentos de trasplante en pacientes con cáncer de laringe ^4,5.

Para comprender mejor la respuesta inmune del huésped a una laringe trasplantada, el primer modelo de trasplante laríngeo en ratas fue desarrollado en 1992 por Strome, y las mejoras en la técnica quirúrgica se realizaron en 2002 ^6,7. Aunque este modelo es efectivo para estudiar el trasplante laríngeo, la falta de agentes inmunológicos específicos para ratas y el mayor costo asociado con los modelos de ratas llevaron al desarrollo de un nuevo modelo de ratón para estudiar el trasplante laríngeo en 2009⁸.

La principal aplicación de la técnica descrita es estudiar diferentes regímenes farmacorrectores inmunosupresores en el trasplante laríngeo. La mejora de las terapias inmunosupresoras actuales puede ampliar el grupo de candidatos y dar lugar a un trasplante seguro en pacientes con cáncer. Los beneficios de este modelo de ratón son su rentabilidad y la amplia disponibilidad de datos inmunológicos y reactivos.

Los equipos que trabajan en regímenes de tratamiento inmunosupresores para el trasplante de laringe pueden usar este método para recopilar un gran volumen de datos inmunológicos, y se pueden probar y comparar rápidamente diferentes regímenes farmacológicos. Otras posibles modalidades de tratamiento que pueden modular la respuesta inmune al trasplante, como las inyecciones de células madre, también se pueden probar utilizando este modelo. Finalmente, se pueden diseñar experimentos para observar los efectos sistémicos a largo plazo del trasplante de laringe mediante la extensión del período de seguimiento.

La técnica descrita aquí utiliza anastomosis de extremo a lado para proporcionar flujo arterial y venoso a un injerto de laringe heterotópico. El injerto es un complejo laringotraqueoesofágico (LTE) que comprende la laringe, las glándulas tiroides, las glándulas paratiroides, la tráquea y el esófago del donante, con arterias carótidas bilaterales y pedículos intactos. Una arteria carótida del donante se anastomosa a la arteria carótida receptora y proporciona flujo sanguíneo arterial, mientras que la otra arteria carótida del donante se anastomosa a la vena yugular externa receptora y proporciona flujo sanguíneo venoso (Figura 1).

Se realizaron varias modificaciones a la técnica quirúrgica del modelo de rata para asegurar el éxito en el modelo de ratón. Por ejemplo, se utilizó un agente anestésico inhalado en lugar de un agente inyectable para aumentar el control sobre la profundidad de la anestesia y reducir las complicaciones. La sutura continua se utiliza en la anastomosis arterial-arterial en ratas; Sin embargo, debido al tamaño más pequeño de los vasos de ratón, esto es técnicamente difícil y puede causar estrechamiento de la luz del vaso⁷. Como resultado, las suturas interrumpidas se utilizan en el modelo de ratón y dan como resultado una mejor permeabilidad de los vasos. Además, en el modelo de rata, el pedículo de la arteria tiroidea superior (STA) se disecciona y visualiza. Dado el tamaño más pequeño del STA en ratones, esta disección podría resultar en daño e incluso transección del STA. Como resultado, no se disecciona en el modelo de ratón. En cambio, la fascia cercana se conserva para garantizar que el STA se mantenga intacto.

Las principales dificultades potenciales de esta técnica incluyen dañar los pedículos del complejo LTE del donante, hacer una arteriotomía o venotomía de tamaño incorrecto, oclusión de vasos en los sitios de anastomosis o dejar huecos en los sitios de anastomosis que pueden causar sangrado. Para evitar estos errores, se debe tener cuidado al obtener el injerto del donante dejando un manguito de tejido alrededor del pedículo STA. La arteriotomía y la venotomía deben ser lo suficientemente grandes como para permitir el flujo sanguíneo, pero lo suficientemente pequeñas como para evitar fugas. Se debe usar un número apropiado de suturas para que las anastomosis cierren cualquier brecha, pero no demasiadas para ocluir los vasos.

Si se obtiene familiaridad con las técnicas microquirúrgicas, este procedimiento se puede realizar en aproximadamente 3 h. Este modelo de trasplante laríngeo se puede realizar de forma fiable en ratones y utilizarse para estudiar la respuesta inmune del huésped después del alotrasplante compuesto vascularizado.

Protocolo

Esta investigación se realizó de conformidad con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Mayo Clinic. Los ratones BalbC (10-12 semanas de edad) se utilizaron como donantes y los ratones C57 / BL6 (10-12 semanas de edad) se utilizaron como receptores porque sus principales complejos de histocompatibilidad, H-2Db y H-2Kb, respectivamente, son inmunológicamente incompatibles y, por lo tanto, la respuesta inmune al injerto puede estudiarse más a fondo. Todos los instrumentos utilizados durante la cirugía fueron esterilizados (ver Figura Suplementaria S1 y Figura Suplementaria S2), y el campo quirúrgico se mantuvo estéril durante todo el protocolo según las instrucciones de IACUC.

1. Cirugía de donantes y obtención de injertos

1. Inyecte al donante buprenorfina de liberación prolongada (3,25 mg/kg de peso corporal por vía subcutánea) 30 min antes de comenzar el procedimiento. Coloque el ratón en la caja de anestesia para roedores para la inducción de anestesia al 3% de isoflurano administrado con 1 L / min O₂ flujo. Después de que el animal esté completamente anestesiado, transfiera el ratón al área de afeitado y administre isoflurano al 1,5% con 1 L / min O₂ de flujo para el mantenimiento de la anestesia. Confirme la profundidad de la anestesia con un pellizco en el dedo del pie.
2. Afeite el pecho y el cuello del ratón hasta la línea de la mandíbula y aplica crema depilatoria. Después de 30 s, limpie la crema con una gasa estéril humedecida con agua y transfiera el ratón al área quirúrgica.
3. Aplique lubricante para los ojos del ratón. Coloque el mouse en una almohadilla térmica suplementaria para garantizar una temperatura corporal adecuada.
4. Inmovilice al ratón, prepare el área quirúrgica tres veces con povidona yodada y alcohol, y luego cubra el ratón.
   NOTA: Verifique la profundidad de la anestesia con un pellizco en el dedo del pie y mantenga la anestesia al 1,5% de isoflurano y 1 L / min de flujo de_O2 a través de una máscara facial durante todo el procedimiento.
5. Haga una pequeña incisión horizontal justo superior a la muesca supraesternal. Usando tijeras finas, eleve la piel bilateralmente a través de esa incisión hasta la mandíbula. Extirpar un segmento de piel de forma trapezoidal que resulta en la exposición de las glándulas salivales bilaterales, los músculos esternomastoides, los músculos digástricos y el aspecto superior del esternón (Figura 2A).
6. Extirpar las glándulas salivales bilaterales usando cauterio en la parte superior donde se visualiza una pequeña vena que viaja a través de la glándula (Figura 2A).
   NOTA: Si no se tiene cuidado de cauterizar el vaso antes de extirpar la glándula, se puede encontrar un sangrado significativo en este paso.
7. Retraiga suavemente los tejidos linfoides y adiposos lateralmente para exponer los músculos esternomatoides y de correa. Diseccionar los músculos esternotastoides bilaterales de los tejidos circundantes y retraerlos lateralmente usando retractores.
   NOTA: Esta maniobra expondrá completamente el complejo LTE con los músculos de la correa y proporcionará un espacio de trabajo cómodo para la disección de las arterias carótidas (Figura 2B).
8. Haga una incisión en la línea media entre los músculos de la correa y escúbralos bilateralmente, teniendo cuidado de no dañar la glándula tiroides subyacente y dejándola en el complejo LTE.
   NOTA: Después de este paso, las arterias carótidas bilaterales deben ser visibles (Figura 2C).
9. Diseccionar circunferencialmente las arterias carótidas comunes al nivel de la clavícula inferiormente y al nivel de la bifurcación carotídea superiormente. Diseccionar el nervio vago y la vena yugular interna de las arterias carótidas. No los incluya en el injerto adquirido.
   NOTA: La arteria tiroidea superior se puede ver justo superior a la bifurcación que viaja medialmente. Deje intacta la delgada fascia que rodea este vaso y no intente diseccionarlo circunferencialmente. Este vaso suministra el flujo sanguíneo al complejo LTE y servirá como pedículo después del trasplante. La preservación de este recipiente es de suma importancia.
10. Diseccionar las arterias carótidas internas y externas lo suficientemente superior como para poder ligar y dividir. Si hay dificultad con la visualización de los vasos, use un retractor separado para retraer los músculos digásgricos lateralmente.
    NOTA: Evite diseccionar la arteria carótida externa más cerca de la bifurcación para evitar cualquier daño a la arteria tiroidea superior. En este paso, la arteria occipital, que se ramifica desde la carótida externa y sigue paralela a la arteria carótida interna, se puede encontrar y no debe confundirse con la arteria carótida interna, que es más grande y se encuentra más profunda (Figura 2D).
11. Uso de 8-0 suturas de nylon, ligan las arterias carótidas internas de 2 a 3 mm superiores a la bifurcación carotídea. Ligate las arterias carótidas externas al menos 3 mm superiores al punto de ramificación de la arteria tiroidea superior.
    NOTA: Después de estas ligaduras, el complejo LTE se pediculizará a través de las arterias tiroideas superiores a las arterias carótidas bilaterales.
12. Ligate las arterias carótidas comunes a nivel del esternón y corta todos los vasos ligados bilateralmente. Mantenga los pedículos vasculares en la parte superior del complejo LTE para evitar daños accidentales durante la disección adicional. Para evitar cualquier fuga de gas o pérdida inadvertida de anestesia, asegúrese de que el animal haya expirado antes de hacer cualquier corte de las vías respiratorias.
13. Dividir los músculos infrahioideos a nivel del hioides. Crear una faringotomía anterior justo inferior al hioides. Lleve la incisión hasta la fascia prevertebral para liberar el complejo LTE superiormente.
14. Transecto la tráquea por debajo del quinto anillo traqueal y lleve la incisión a través del esófago hasta la fascia prevertebral para liberar el complejo LTE inferiormente. Libere la tráquea y el esófago de la fascia prevertebral subyacente de una dirección inferior a superior.
    NOTA: Mantenga los pedículos vasculares en la parte superior del complejo LTE para evitar daños accidentales durante una disección adicional.
15. Crear una faringotomía anterior justo inferior al hioides. Lleve la incisión hasta la fascia prevertebral para liberar el complejo LTE superiormente. Divida cualquier unión de tejido linfoide o conectivo restante entre el complejo LTE y el tejido circundante. Retire el injerto.
    NOTA: El injerto contiene la laringe, tráquea, glándulas tiroides, glándulas paratiroides, esófago y músculos laríngeos del donante como una unidad compuesta (Figura 2E).

2. Preparación del injerto

1. Coloque el injerto obtenido en una placa de Petri estéril y lávelo con solución salina normal para eliminar cualquier coágulo de sangre. Usando micro fórceps, ordeña suavemente la sangre y los coágulos de las arterias carótidas bilaterales. Dilatar las arterias carótidas bilaterales utilizando microdilatadores de 1 mm.
2. Con una aguja roma de 30 G, inyecte aproximadamente 2 ml de solución salina heparinizada en cada arteria carótida para enjuagar el injerto.
   NOTA: Se puede ver sangre y solución salina saliendo de la arteria carótida contralateral y los pequeños extremos de los vasos libres, lo que confirma las arterias tiroideas superiores intactas.
3. Extirpe la adventicia lejos de los extremos arteriales para que tengan bordes limpios para la anastomosis.
   NOTA: El injerto se puede dejar en solución salina heparinizada y se puede tomar un breve descanso de hasta 3 h antes de trasplantarlo al receptor⁹.

3. Cirugía del receptor y anastomosis de los vasos

1. Prepare el ratón receptor de la misma manera que se describe para el donante después de los pasos de inducción de anestesia, afeitado y preparación quirúrgica. Inyecte al ratón receptor analgésico de liberación prolongada por vía subcutánea 30 min antes del inicio de la cirugía.
2. Usando un bisturí, haga una incisión en la línea media del cuello que se extienda desde la línea de la mandíbula superiormente hasta el esternón inferiormente. Eleve la piel del lado izquierdo y retírela lateralmente.
3. Extirpar la glándula salival izquierda, cauterizando los vasos superiores como se describió anteriormente. Extirpar el tejido adiposo y linfoide dividiendo cualquier vaso visible con cauterización a baja temperatura, teniendo cuidado de no dañar la vena yugular externa subyacente (Figura 3A).
4. Diseccionar la vena yugular externa circunferencialmente. Use al menos 5 mm de longitud clara del vaso para la anastomosis. Use cauterización a baja temperatura o ligar y divida cualquier vena relativamente grande que se ramifique de la vena yugular.
5. Diseccionar el músculo esternomatoideo y retraerlo lateralmente. Mantenga la vena diseccionada protegida detrás del músculo para evitar el contacto directo con el retractor.
6. Extirpe los músculos de la correa izquierda para obtener acceso a la arteria carótida receptora. Diseccionar circunferencialmente la arteria carótida común desde la clavícula hacia abajo hasta la bifurcación carotídea superiormente (Figura 3B).
7. Pase el material de fondo por debajo de la vena yugular externa y aplique las abrazaderas de vaso V3 de doble aproximación.
8. Coloque una sutura de nylon 10-0 a través de la pared anterior de la vena yugular externa en la ubicación de la venotomía deseada y use esta sutura para tirar anteriormente y colocar el vaso.
9. Corte la sutura con microtijeras lo suficientemente profundas como para crear la venotomía de una sola hendidura del tamaño adecuado y asegurarse de que el corte sea completamente a través de la pared venosa.
10. Con una aguja roma de 30 G, enjuague el interior de la vena con solución salina heparinizada.
11. Coloque el complejo LTE del donante entre la arteria carótida izquierda del receptor y la vena yugular externa izquierda. Alinee el extremo libre de la arteria carótida izquierda del donante hacia la vena yugular externa izquierda receptora y biselle los extremos de los vasos con tijeras afiladas.
12. Usando cuatro suturas interrumpidas de nylon 10-0, anastomosar la arteria carótida izquierda del donante y la vena yugular externa izquierda del receptor de manera integral a lateral.
13. Deslice el material de fondo debajo de la arteria carótida común receptora y coloque las pinzas de doble aproximación del vaso A3 en la arteria carótida común receptora. Crear una arteriotomía de la misma manera que la venotomía.
    NOTA: Asegúrese de que la arteriotomía sea del mismo tamaño que la luz de la arteria carótida del donante. Si es demasiado grande, se producirá sangrado profuso después de que se retiren las pinzas. Si es demasiado pequeño, se obstruirá el flujo sanguíneo al injerto.
14. Anastomosar la arteria carótida derecha del donante a la arteria carótida izquierda receptora de manera integral a lateral utilizando seis suturas interrumpidas de nylon 10-0.
    NOTA: Se debe respetar la técnica microvascular correcta durante toda la anastomosis vascular. Pasar a través de la pared posterior resulta en un flujo sanguíneo considerablemente restringido, poniendo en peligro la supervivencia del injerto. Debido al pequeño tamaño de los vasos, tratar de rehacer las suturas es muy difícil.
15. Retire las pinzas del lado venoso. Si se encuentra sangrado, aplique una presión suave con puntas de algodón.
16. Retire las pinzas de la arteria e inmediatamente aplique una presión suave con puntas de algodón.
    NOTA: Se espera algo de sangrado en este paso, que generalmente se detiene después de 1 minuto con una presión suave.
17. Verifique la integridad del flujo sanguíneo en la arteria y la vena.
    NOTA: Con el flujo arterial intacto, generalmente se observa pulsación de la arteria carótida del donante, y la glándula tiroides del donante cambia de su color transparente enrojecido a su color rojizo original. También se puede observar la coloración roja de los pequeños recipientes en el complejo LTE.
18. Irrigar el campo quirúrgico con solución salina heparinizada y cerrar la incisión de la piel con una sutura de monofilamento 5-0 en forma de correr. Aplique ungüento antibiótico o un adhesivo para la piel en la incisión.
19. Inyecte 1 ml de solución salina tibia por vía subcutánea para tener en cuenta la pérdida de líquido durante la cirugía.
20. Detenga la anestesia y transfiera el ratón a una jaula de recuperación. Observe el ratón en una almohadilla térmica hasta que esté completamente despierto para evitar la hipotermia.

Resultados

Confirmación del éxito del trasplante
Utilizando el protocolo descrito anteriormente, es posible evaluar el flujo sanguíneo al complejo LTE observando la pulsación de la arteria carótida del donante después de retirar las pinzas de los vasos. La pulsación es típicamente visible, y la coloración roja inmediata de la arteria donante confirma el flujo sanguíneo activo (Figura 4A). Si la anastomosis no es efectiva, la arteria no tendrá pulsación, se verá parcialm...

Discusión

La incidencia y prevalencia de cáncer de laringe han aumentado en 12% y 24%, respectivamente, durante las últimas tres décadas, y muchos de estos pacientes se someten a una laringectomía para el tratamiento¹⁰. Este procedimiento empeora significativamente la calidad de vida de una persona y, por lo tanto, se desea un tratamiento alternativo. El alotrasplante compuesto vascularizado de la laringe puede mejorar la capacidad del paciente para respirar y hablar; Sin embargo, todavía se requiere i...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1 Paperclips	Staples	OP-7404	Clips are shaped manually to be used as retractors
1 cc Insulin Syringes	BD	329412	27 G 5/8
10-0 Ethilon Nylon Suture	Ethicon	2870G
25 G Precision Glide Needle	BD	305125	1 in
3 mL Luer-Lok Tip Syringe	BD	309657
30 G Sterile Standard Blunt Needles	Cellink	NZ5300505001
5-0 Monocryl Suture	Ethicon	Y822G
8-0 Ethilon Nylon Suture	Ethicon	2815G
Adson Forceps	Fine Science Tools	11027-12	Straight, 1 x 2 teeth
Adventitia scissors	S&T	SAS-10	19 mm, 10 cm, straight
Angled Forceps	Fine Science Tools	00109-11	45/11 cm
Artifical Tears Lubricant Opthalmic Ointment	Akorn Animal Health	59399-162-35
Bandaid Fabric Fingertip	Cardinal Healthcare	299399
Betadine Solution Swabsticks	Purdue Products	67618-153-01
Buprenex Injection	CIII	12495-0757-1	0.3 mg/mL
Clamp applying forceps without lock	Accurate Surgical & Scientific Instruments	ASSI.CAF5	14 cm
Cotton Swabs	Puritan	10806-001-PK
DeBakey forceps
Dermabond Mini	Cardinal Healthcare	315999
Dissecting Boards	Mopec	22-444-314
Falcon Sterile Disposable Petri Dish	Corning	25373-041	35 mm
Fine Scisssors	Fine Science Tools	14029-10	Curved Sharp-Blunt 10 cm
Golden A5 2-Speed Blade Clipper	Oster	008OST-78005-140	#10
Hair Remover Sensitive Formula	Nair	2260000033
Heparin	Meitheal Pharmaceuticals	71288-4O2-10	10,000 USP units per 10 mL
Isoflurane	Piramal Healthcare	66794-013-25
Low-Temp Micro Fine Tip Cautery	Bovie Medical	AA90
Mercian Visibility Background Material	Synovis Micro Companies	VB3	Green
Microvascular Approximator Clamp without Frame	Accurate Surgical & Scientific Instruments	ASSI.ABB11V	0.4-1 mm Vessel Diameter
Mouse face mask kit	Xenotec	XRK-S	Small
Needle holder	S&T	C-14 W	5.5", 8 mm, 0.4 mm
Press n' Seal	Glad	70441
Scalpel	Braun	BA210	10 blade
Single Mini Vessel Clamp	Accurate Surgical & Scientific Instruments	ASSI.ABB11M	.31 (8 mm), 3 x 1 mm Rnd. Bl., Black Pair
Stereomicroscope	Olympus	SZ61
Sterile Alcohol Prep Pads	Fisherbrand	06-669-62
Sterile Disposable Drape Sheets	Dynarex	DYN4410-CASE
Sterile Gauze Pads	Dukal	1212
Sterile Saline	Hospira	236173	NaCl 0.9%
Sterile Surgical Gloves	Gammex	851_A
Straight Forceps	Fine Science Tools	00108-11	11 cm
Tissue forceps	Accurate Surgical & Scientific Instruments	ASSI.JFLP3	13.5 cm, 8 mm, 0.3 mm
Vannas Pattern Scissors	Accurate Surgical & Scientific Instruments	ASSI.SDC15RV	15 cm, 8 mm, curved 7mm blade
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-10	3 mm cutting edge, curved
Vessel Dilator Tip	Fine Science Tools	00126-11	Diameter 0.1 mm/Angled 10/11 cm
Vessel Dilator, Classic line	S&T	D-5a.3 W	9 mm, 0.3 mm, angled 10