喉頭移植研究のための異所性マウスモデル

要約

この原稿の目的は、マウスで異所性喉頭移植を行うために必要な顕微手術ステップを説明することです。喉頭移植の他の動物モデルと比較したこのマウスモデルの利点は、その費用対効果と免疫学的アッセイとデータの入手可能性です。

要約

喉頭異所性移植は、技術的に困難な手順ですが、他の動物モデルと比較して、より多くの科学的分析と費用便益を提供します。2009年にShipchandlerらによって最初に記述されましたが、この技術は、おそらく顕微手術技術の習得の難しさとそれを習得するために必要な時間のために、広く使用されていません。このホワイトペーパーでは、この技術の効果的な使用を促進するために、外科的ステップと回避すべき潜在的な落とし穴について詳しく説明します。

このモデルでは、ドナー喉頭の両側頸動脈がレシピエント頸動脈と外頸静脈に吻合され、移植片を通る血流が可能になります。移植片両側頸動脈の血液充満、移植片の甲状腺の発赤、移植片の微小血管からの出血を可視化することで術中に血流を確認することができます。成功のための重要な要素には、移植血管の繊細な保存、正しいサイズの動脈切開と静脈切開の作成、動脈-動脈および動脈-静脈吻合に適切な数の縫合糸を使用して、漏れのない血管を確保し、閉塞を防ぐことが含まれます。

十分なトレーニングを受ければ、誰でもこのモデルに習熟し、約3時間で手順を実行できます。このモデルが正常に実行されれば、免疫学的研究を簡単かつ低コストで実施することができます。

概要

回復不能な喉頭損傷または喉頭癌に苦しむ患者にとって、喉頭全摘出術が唯一の選択肢であることがよくあります¹。喉頭全摘出術は、社会的および心理的苦痛を経験することに加えて、患者を自分で呼吸して話す能力を失わせます²。喉頭全摘出術を必要とする喉頭がん患者は、喉頭移植の優れた潜在的候補です。回復不能な喉頭損傷の設定でのヒト喉頭移植が行われてきましたが、腫瘍再発の恐れ、慢性拒絶反応の可能性、およびドナー由来の感染症のために、喉頭の同種移植は現在避けられています³。免疫抑制は、これらの懸念の主な原因です。従来の免疫抑制治療後の腫瘍再発による最初の部分喉頭移植患者の劇的な喪失は、喉頭癌患者への移植をさらに試みる前に、適切な免疫抑制レジメンを考案する必要があるという証拠^です4,5。

移植された喉頭に対する宿主免疫応答をよりよく理解するために、ラットにおける最初の喉頭移植モデルは1992年にStromeによって開発され、2002年に外科的技術の改良が加えられた^6,7。このモデルは喉頭移植の研究に有効であるが、ラット特異的免疫剤の欠如とラットモデルに関連する高コストは、2009年に喉頭移植を研究するための新しいマウスモデルの開発につながった⁸。

記載された技術の主な用途は、喉頭移植における異なる免疫抑制薬レジメンを研究することである。現在の免疫抑制療法を改善することで、候補プールが広がり、がん患者の安全な移植につながる可能性があります。このマウスモデルの利点は、その費用対効果と免疫学的データと試薬の幅広い入手可能性です。

喉頭移植の免疫抑制治療レジメンに取り組んでいるチームは、この方法を使用して大量の免疫学的データを収集でき、さまざまな薬物レジメンを迅速にテストして比較できます。幹細胞注射など、移植に対する免疫応答を調節できる他の潜在的な治療法も、このモデルを使用してテストできます。最後に、追跡期間を延長することにより、喉頭移植の長期的な全身効果を観察するための実験を考案することができます。

ここで説明する技術は、端から側への吻合を使用して、異所性喉頭移植片に動脈および静脈の流れを提供します。移植片は、ドナーの喉頭、甲状腺、副甲状腺、気管、食道を含む喉頭気管食道(LTE)複合体であり、両側頸動脈と茎は無傷です。一方のドナー頸動脈はレシピエントの頸動脈に吻合されて動脈血流を提供し、もう一方のドナー頸動脈はレシピエントの外頸静脈に吻合され、静脈血流を提供します(図1)。

マウスモデルでの成功を確実にするために、ラットモデルの外科的技術にいくつかの変更が加えられました。たとえば、麻酔の深さの制御を強化し、合併症を減らすために、注射剤の代わりに吸入麻酔薬が使用されました。連続縫合は、ラットの動脈 - 動脈吻合に使用される。しかしながら、マウス血管のサイズが小さいため、これは技術的に困難であり、血管内腔の狭窄を引き起こす可能性がある⁷。その結果、中断された縫合糸がマウスモデルで使用され、血管の開存性が改善されます。さらに、ラットモデルでは、上甲状腺動脈(STA)茎を解剖し、視覚化します。マウスのSTAのサイズが小さいことを考えると、この解剖はSTAの損傷、さらには切断をもたらす可能性があります。その結果、マウスモデルでは解剖されない。代わりに、STAが無傷に保たれるように、近くの筋膜が保存されます。

この技術の主な潜在的な落とし穴には、ドナーLTE複雑な茎の損傷、誤ったサイズの動脈切開または静脈切開、吻合部位での血管閉塞、または出血を引き起こす可能性のある吻合部位のギャップの残しが含まれます。これらの失敗を避けるために、STA茎の周りに組織のカフを残してドナー移植片を調達するときは注意が必要です。動脈切開術と静脈切開術は、血流を可能にするのに十分な大きさである必要がありますが、漏れを防ぐのに十分小さい必要があります。吻合部が隙間を埋めるために適切な数の縫合糸を使用する必要がありますが、血管を閉塞するには多すぎないでください。

顕微手術技術に精通している場合、この手順は約3時間で実行できます。この喉頭移植モデルは、マウスで確実に実施することができ、血管新生複合同種移植後の宿主免疫応答の研究に使用できます。

プロトコル

この研究は、メイヨークリニックの施設動物管理および使用委員会(IACUC)に準拠して実施されました。BalbCマウス(10-12週齢)をドナーとして使用し、C57/BL6マウス(10-12週齢)をレシピエントとして使用したのは、それらの主要な組織適合遺伝子複合体であるH-2DbおよびH-2Kbがそれぞれ免疫学的に不適合であり、したがって移植片に対する免疫応答をさらに研究することができるためである。手術中に使用されたすべての器具は滅菌され(補足図 S1 および 補足図S2を参照)、IACUCの指示に従ってプロトコル全体を通して手術野を無菌状態に保ちました。

1.ドナー手術と移植片調達

1. 手順を開始する前に、徐放性ブプレノルフィン(3.25 mg / kg体重を皮下投与)をドナーに注射します。.マウスをげっ歯類の麻酔ボックスに入れて、1 L / minO₂ フローで送達される3%イソフルランで麻酔導入します。動物が完全に麻酔された後、マウスをシェービング領域に移し、麻酔の維持のために1 L / minO₂ フローで1.5%イソフルランを投与します。つま先ピンチで麻酔の深さを確認します。
2. マウスの胸と首を顎のラインまで剃り、脱毛クリームを塗ります。30秒後、水で濡らした滅菌ガーゼパッドでクリームを拭き取り、マウスを手術領域に移します。
3. マウスの目に目の潤滑剤を塗ります。適切な体温を確保するために、ドレープされた補助加熱パッドにマウスを置きます。
4. マウスを固定し、ポビドンヨードとアルコールで手術部位を3回準備してから、マウスをドレープします。
   注:つま先のつまみで麻酔の深さを確認し、手順全体を通してフェイスマスクを介して1.5%イソフルランと1 L / minO₂の流れで麻酔を維持します。
5. 胸骨上ノッチのすぐ上に小さな水平切開を行います。細かいハサミを使用して、その切開部を通して下顎骨まで皮膚を両側に持ち上げます。台形の皮膚部分を切除し、両側唾液腺、胸骨乳突筋、二腹筋、および胸骨の優れた側面を露出させます(図2A)。
6. 両側唾液腺を切除し、腺を通る小さな静脈が視覚化される上部で焼灼を使用します(図2A)。
   注意: 腺を取り除く前に血管を焼灼するように注意しないと、このステップで重大な出血が発生する可能性があります。
7. リンパ組織と脂肪組織を横方向に静かに引っ込めて、胸骨乳突起とストラップの筋肉を露出させます。両側の胸骨乳突筋を周囲の組織から解剖し、開創器を使用して横方向に引っ込めます。
   注意: この操作により、ストラップの筋肉を備えたLTE複合体が完全に露出し、頸動脈を解剖するための快適な作業スペースが提供されます(図2B)。
8. ストラップの筋肉の間に正中線を切開し、両側に切除し、下にある甲状腺を傷つけないように注意し、LTE複合体に残します。
   注意: このステップの後、両側頸動脈が見えるはずです(図2C)。
9. 総頸動脈を下鎖骨のレベルまで、頸動脈分岐部を上方に円周方向に解剖する。頸動脈から迷走神経と内頸静脈を解剖します。調達した移植片にそれらを含めないでください。
   注:上甲状腺動脈は、内側に移動する分岐点よりもすぐ上に見えます。この血管を囲む薄い筋膜はそのままにして、円周方向に解剖しようとしないでください。この血管はLTE複合体に血流を供給し、移植後に茎として機能します。この船の保存は最も重要です。
10. 内頸動脈と外頸動脈を結紮して分裂させることができるほど十分に高く解剖します。血管の視覚化が困難な場合は、別のリトラクターを使用して顎二腹筋を横方向に引っ込めます。
    注意: 上甲状腺動脈への損傷を防ぐために、分岐部に近い外頸動脈を解剖することは避けてください。このステップでは、外頸動脈から分岐し、内頸動脈と平行に続く後頭動脈に遭遇する可能性があり、より大きく、より深く見られる内頸動脈と混同しないでください(図2D)。
11. 8-0を使うナイロン縫合糸は、頸動脈分岐部より2〜3mm優れた内頸動脈を結紮する。上甲状腺動脈の分岐点より少なくとも3 mm上の外頸動脈を結睭にします。
    注:これらの結紮後、LTE複合体は上甲状腺動脈 を介して 両側頸動脈に足を取られます。
12. 総頸動脈を胸骨の高さで結紮し、結紮された血管をすべて両側に切断します。さらなる解剖中の偶発的な損傷を避けるために、血管茎をLTE複合体の上に保ちます。ガス漏れや不注意による麻酔の喪失を防ぐために、気道を切る前に動物の有効期限が切れていることを確認してください。
13. 舌骨下筋を舌骨のレベルで分割します。舌骨のすぐ下の前咽頭切開術を作成します。切開部を椎前筋膜まで運び、LTE複合体を上手に解放します。
14. 第5気管リングの下の気管を横断し、切開部を食道を通って椎前筋膜まで運び、LTE複合体を下方に解放します。気管と食道を下の椎骨前筋膜から下方向から上方向へと解放します。
    注意: さらなる解剖中の偶発的な損傷を避けるために、血管茎をLTE複合体の上に保ちます。
15. 舌骨のすぐ下の前咽頭切開術を作成します。切開部を椎前筋膜まで運び、LTE複合体を上手に解放します。LTE複合体と周囲の組織の間で残りのリンパ系または結合組織の付着物を分割します。移植片を取り除きます。
    注意: 移植片には、ドナーの喉頭、気管、甲状腺、副甲状腺、食道、および喉頭筋が複合ユニットとして含まれています(図2E)。

2.グラフトの準備

1. 調達した移植片を滅菌ペトリ皿に入れ、通常の生理食塩水で洗って血栓を取り除きます。マイクロ鉗子を使用して、両側頸動脈から血液と血栓をやさしく搾乳します。1mmのマイクロ拡張器を使用して両側頸動脈を拡張します。
2. 30 Gの鈍い先端の針を使用して、各頸動脈に約2 mLのヘパリン化生理食塩水を注入し、移植片を洗い流します。
   注:血液と生理食塩水が対側頸動脈と小さな自由血管の端から洗い流されているのが見られ、無傷の上甲状腺動脈が確認されます。
3. 外膜を動脈端から切り取って、吻合のためにきれいな縁を作ります。
   注:移植片はヘパリン処理生理食塩水に残すことができ、レシピエントに移植する前に最大3時間短い休憩を取ることができます⁹。

3.レシピエント手術と血管の吻合

1. 麻酔導入、剃毛、および外科的準備ステップに続くドナーについて説明したのと同じ方法でレシピエントマウスを準備する。手術開始の30分前に、レシピエントマウスに徐放性鎮痛剤を皮下注射します。
2. メスを使用して、顎のラインから下にある胸骨まで伸びる正中線の首の切開を行います。左側の皮膚を持ち上げ、横方向に引っ込めます。
3. 左唾液腺を切除し、前述のように上血管を焼灼する。目に見える血管を低温焼灼で分割し、下にある外頸静脈を傷つけないように注意して、脂肪組織とリンパ組織を切除します(図3A)。
4. 外頸静脈を円周方向に解剖します。吻合のために血管の少なくとも5mmの明確な長さを使用してください。低温焼灼または結紮液を使用して、頸静脈から分岐する比較的大きな静脈を分割します。
5. 胸骨乳突筋を解剖し、横方向に引っ込めます。解剖した静脈を筋肉の後ろで保護して、開創器との直接接触を避けてください。
6. 左ストラップの筋肉を切除して、レシピエント頸動脈にアクセスします。鎖骨から頸動脈分岐部まで総頸動脈を円周方向に解剖する(図3B)。
7. 背景資料を外頸静脈の下に通し、二重近似V3血管クランプを適用します。
8. 目的の静脈切開の位置に外頸静脈の前壁に10-0ナイロン縫合糸を置き、この縫合糸を使用して前方に引っ張り、血管をテント張ります。
9. 適切なサイズのシングルスリット静脈切開を作成するのに十分な深さのマイクロハサミで縫合糸にカットし、カットが静脈壁を完全に貫通していることを確認します。
10. 30 Gの先端が鈍い針を使用して、静脈の内側をヘパリン化生理食塩水で洗い流します。
11. ドナーLTE複合体をレシピエントの左頸動脈と左外頸静脈の間に配置します。ドナー左頸動脈の自由端をレシピエントの左外頸静脈に合わせ、鋭いハサミで血管の端を面取りします。
12. 4本の10-0ナイロン中断縫合糸を用いて、ドナーは頸動脈を左に、レシピエントは外頸静脈を端から左右に吻合した。
13. 背景物質をレシピエントの共通頸動脈の下にスライドさせ、二重近似A3血管クランプをレシピエントの共通頸動脈に配置します。静脈切開と同じ方法で動脈切開を作成します。
    注意: 動脈切開術がドナー頸動脈の内腔と同じサイズであることを確認してください。大きすぎると、クランプを取り外した後に大量の出血が発生します。小さすぎると、移植片への血流が妨げられます。
14. ドナー右頚動脈をレシピエント左頚動脈に吻合し、6本の10−0ナイロン中断縫合糸を用いて端から左右にした。
    注:正しい微小血管技術は、血管吻合全体を通して尊重されるべきです。後壁を通過すると、血流がかなり収縮し、移植片の生存が危険にさらされます。血管のサイズが小さいため、縫合糸をやり直そうとすることは非常に困難です。
15. 静脈側のクランプを取り外します。出血が発生した場合は、綿の先端で穏やかな圧力をかけてください。
16. 動脈のクランプを外し、すぐに綿の先端で穏やかな圧力をかけます。
    注:このステップでは出血が予想され、通常は穏やかな圧力で1分後に止まります。
17. 動脈と静脈の血流の完全性を確認してください。
    注:無傷の動脈流では、ドナー頸動脈の脈動が通常見られ、ドナー甲状腺は紅潮した透明な色から元の赤みがかった色に戻ります。LTE複合体上の小血管の赤い着色も観察することができます。
18. ヘパリン化生理食塩水で手術野を洗浄し、5-0モノフィラメント縫合糸で皮膚切開部をランニング方式で閉じます。切開部に抗生物質軟膏または皮膚接着剤を塗布します。
19. 手術中の体液損失を考慮して、1mLの温かい生理食塩水を皮下注射します。
20. 麻酔を停止し、マウスを回復ケージに移します。低体温症を避けるために、完全に目覚めるまで加熱パッドでマウスを観察します。

結果

移植成功の確認
上記のプロトコルを使用して、血管クランプを取り外した後のドナー頸動脈の脈動を観察することによってLTE複合体への血流を評価することができる。脈動は通常目に見え、ドナー動脈の即時の赤い着色は活発な血流を確認します(図4A)。吻合が効果的でない場合、動脈は脈動がなく、部分的につぶれているように見え、色が薄くなります...

ディスカッション

喉頭がんの発生率と有病率は、過去30年間でそれぞれ12%と24%増加しており、これらの患者の多くは治療のために喉頭切除術を受けています¹⁰。この手順は人の生活の質を著しく悪化させるため、代替治療が望まれます。喉頭の血管化複合同種移植は、患者の呼吸能力および発話能力を改善することができる。ただし、この技術をこの患者集団に臨床的に利用する前に、まだ研...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1 Paperclips	Staples	OP-7404	Clips are shaped manually to be used as retractors
1 cc Insulin Syringes	BD	329412	27 G 5/8
10-0 Ethilon Nylon Suture	Ethicon	2870G
25 G Precision Glide Needle	BD	305125	1 in
3 mL Luer-Lok Tip Syringe	BD	309657
30 G Sterile Standard Blunt Needles	Cellink	NZ5300505001
5-0 Monocryl Suture	Ethicon	Y822G
8-0 Ethilon Nylon Suture	Ethicon	2815G
Adson Forceps	Fine Science Tools	11027-12	Straight, 1 x 2 teeth
Adventitia scissors	S&T	SAS-10	19 mm, 10 cm, straight
Angled Forceps	Fine Science Tools	00109-11	45/11 cm
Artifical Tears Lubricant Opthalmic Ointment	Akorn Animal Health	59399-162-35
Bandaid Fabric Fingertip	Cardinal Healthcare	299399
Betadine Solution Swabsticks	Purdue Products	67618-153-01
Buprenex Injection	CIII	12495-0757-1	0.3 mg/mL
Clamp applying forceps without lock	Accurate Surgical & Scientific Instruments	ASSI.CAF5	14 cm
Cotton Swabs	Puritan	10806-001-PK
DeBakey forceps
Dermabond Mini	Cardinal Healthcare	315999
Dissecting Boards	Mopec	22-444-314
Falcon Sterile Disposable Petri Dish	Corning	25373-041	35 mm
Fine Scisssors	Fine Science Tools	14029-10	Curved Sharp-Blunt 10 cm
Golden A5 2-Speed Blade Clipper	Oster	008OST-78005-140	#10
Hair Remover Sensitive Formula	Nair	2260000033
Heparin	Meitheal Pharmaceuticals	71288-4O2-10	10,000 USP units per 10 mL
Isoflurane	Piramal Healthcare	66794-013-25
Low-Temp Micro Fine Tip Cautery	Bovie Medical	AA90
Mercian Visibility Background Material	Synovis Micro Companies	VB3	Green
Microvascular Approximator Clamp without Frame	Accurate Surgical & Scientific Instruments	ASSI.ABB11V	0.4-1 mm Vessel Diameter
Mouse face mask kit	Xenotec	XRK-S	Small
Needle holder	S&T	C-14 W	5.5", 8 mm, 0.4 mm
Press n' Seal	Glad	70441
Scalpel	Braun	BA210	10 blade
Single Mini Vessel Clamp	Accurate Surgical & Scientific Instruments	ASSI.ABB11M	.31 (8 mm), 3 x 1 mm Rnd. Bl., Black Pair
Stereomicroscope	Olympus	SZ61
Sterile Alcohol Prep Pads	Fisherbrand	06-669-62
Sterile Disposable Drape Sheets	Dynarex	DYN4410-CASE
Sterile Gauze Pads	Dukal	1212
Sterile Saline	Hospira	236173	NaCl 0.9%
Sterile Surgical Gloves	Gammex	851_A
Straight Forceps	Fine Science Tools	00108-11	11 cm
Tissue forceps	Accurate Surgical & Scientific Instruments	ASSI.JFLP3	13.5 cm, 8 mm, 0.3 mm
Vannas Pattern Scissors	Accurate Surgical & Scientific Instruments	ASSI.SDC15RV	15 cm, 8 mm, curved 7mm blade
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-10	3 mm cutting edge, curved
Vessel Dilator Tip	Fine Science Tools	00126-11	Diameter 0.1 mm/Angled 10/11 cm
Vessel Dilator, Classic line	S&T	D-5a.3 W	9 mm, 0.3 mm, angled 10