Un modèle murin hétérotopique pour étudier la transplantation laryngée

Résumé

Le but de ce manuscrit est de décrire les étapes microchirurgicales nécessaires pour réaliser une greffe de larynx hétérotopique chez la souris. Les avantages de ce modèle murin par rapport à d’autres modèles animaux de transplantation laryngée sont son rapport coût-efficacité et la disponibilité de tests et de données immunologiques.

Résumé

La transplantation hétérotopique laryngée, bien qu’il s’agisse d’une procédure techniquement difficile, offre plus d’analyses scientifiques et d’avantages en termes de coûts par rapport à d’autres modèles animaux. Bien que décrite pour la première fois par Shipchandler et al. en 2009, cette technique n’est pas largement utilisée, peut-être en raison des difficultés d’apprentissage de la technique microchirurgicale et du temps nécessaire pour la maîtriser. Cet article décrit en détail les étapes chirurgicales, ainsi que les pièges potentiels à éviter, afin d’encourager une utilisation efficace de cette technique.

Dans ce modèle, les artères carotides bilatérales du larynx donneur sont anastomosées à l’artère carotide receveuse et à la veine jugulaire externe, ce qui permet le flux sanguin à travers la greffe. Le flux sanguin peut être confirmé en peropératoire par la visualisation du remplissage sanguin dans les artères carotides bilatérales du greffon, la rougeur des glandes thyroïdes du greffon et le saignement des microvaisseaux dans le greffon. Les éléments cruciaux du succès comprennent la préservation délicate des vaisseaux du greffon, la fabrication d’artériotomie et de veinotomie de taille correcte et l’utilisation du nombre approprié de sutures sur les anastomoses artério-artérielles et artério-veineuses pour sécuriser les vaisseaux sans fuite et prévenir l’occlusion.

N’importe qui peut devenir compétent dans ce modèle avec une formation suffisante et effectuer la procédure en environ 3 heures. S’il est réalisé avec succès, ce modèle permet d’effectuer des études immunologiques facilement et à faible coût.

Introduction

Pour les patients souffrant de lésions irréparables du larynx ou d’un cancer du larynx, une laryngectomie totale est souvent la seule option¹. La laryngectomie totale laisse les patients sans la capacité de respirer et de parler par eux-mêmes, en plus d’éprouver une détresse sociale et psychologique². Les patients atteints d’un cancer du larynx qui ont besoin d’une laryngectomie totale sont d’excellents candidats potentiels pour la transplantation laryngée. Alors qu’une transplantation laryngée humaine dans le cadre de lésions laryngées irréparables a été effectuée, l’allotransplantation du larynx est actuellement évitée chez ces patients en raison de la crainte d’une récidive tumorale, de la possibilité d’un rejet chronique et d’infections dérivées du donneur³. L’immunosuppression est la principale cause de ces préoccupations. La perte dramatique du premier patient transplanté laryngé partiel en raison d’une récidive tumorale après un traitement immunosuppresseur conventionnel est la preuve qu’un schéma immunosuppresseur approprié doit être conçu avant que d’autres tentatives de transplantation ne soient faites chez les patients atteints d’un cancer du larynx ^4,5.

Pour mieux comprendre la réponse immunitaire de l’hôte à un larynx transplanté, le premier modèle de greffe de larynx chez le rat a été développé en 1992 par Strome, et des améliorations ont été apportées à la technique chirurgicale en 2002 ^6,7. Bien que ce modèle soit efficace pour étudier la transplantation laryngée, le manque d’agents immunologiques spécifiques aux rats et le coût plus élevé associé aux modèles de rats ont conduit à la mise au point d’un nouveau modèle murin pour étudier la transplantation laryngée en 2009⁸.

La principale application de la technique décrite est d’étudier différents schémas thérapeutiques immunosuppresseurs dans la transplantation laryngée. L’amélioration des traitements immunosuppresseurs actuels pourrait élargir le bassin de candidats et conduire à une transplantation sûre chez les patients atteints de cancer. Les avantages de ce modèle murin sont sa rentabilité et la grande disponibilité des données immunologiques et des réactifs.

Les équipes travaillant sur des schémas thérapeutiques immunosuppresseurs pour la transplantation laryngée peuvent utiliser cette méthode pour recueillir un grand volume de données immunologiques, et différents schémas thérapeutiques peuvent être rapidement testés et comparés. D’autres modalités de traitement potentielles pouvant moduler la réponse immunitaire à la greffe, telles que les injections de cellules souches, peuvent également être testées à l’aide de ce modèle. Enfin, des expériences peuvent être conçues pour observer les effets systémiques à long terme de la transplantation laryngée en prolongeant la période de suivi.

La technique décrite ici utilise des anastomoses de bout en bout pour fournir un flux artériel et veineux à une greffe de larynx hétérotopique. Le greffon est un complexe laryngotrachéo-œsophagien (LTE) comprenant le larynx, les glandes thyroïdes, les glandes parathyroïdes, la trachée et l’œsophage du donneur, avec des artères carotides bilatérales et des pédicules intacts. Une artère carotide du donneur est anastomosée à l’artère carotide receveuse et fournit le flux sanguin artériel, tandis que l’autre artère carotide du donneur est anastomosée à la veine jugulaire externe du receveur et fournit le flux sanguin veineux (Figure 1).

Plusieurs modifications ont été apportées à la technique chirurgicale du modèle de rat pour assurer le succès du modèle murin. Par exemple, un agent anesthésique inhalé a été utilisé à la place d’un agent injectable pour augmenter le contrôle de la profondeur de l’anesthésie et réduire les complications. La suture continue est utilisée dans l’anastomose artério-artérielle chez le rat; Cependant, en raison de la plus petite taille des vaisseaux de souris, cela est techniquement difficile et peut provoquer un rétrécissement de la lumière du vaisseau⁷. En conséquence, des sutures interrompues sont utilisées dans le modèle murin et améliorent la perméabilité des vaisseaux. De plus, dans le modèle du rat, le pédicule supérieur de l’artère thyroïdienne (STA) est disséqué et visualisé. Étant donné la plus petite taille de la STA chez la souris, cette dissection pourrait entraîner des dommages et même une transsection du STA. Par conséquent, il n’est pas disséqué dans le modèle murin. Au lieu de cela, le fascia à proximité est préservé pour s’assurer que le STA est maintenu intact.

Les principaux pièges potentiels de cette technique comprennent l’endommagement des pédicules complexes LTE du donneur, la réalisation d’une artériotomie ou d’une veinotomie de taille incorrecte, l’occlusion des vaisseaux aux sites d’anastomose ou le fait de laisser des espaces aux sites de l’anastomose pouvant provoquer des saignements. Pour éviter ces faux pas, des précautions doivent être prises lors de l’obtention de la greffe de donneur en laissant une brassard de tissu autour du pédicule STA. L’artériotomie et la veinotomie doivent être assez grandes pour permettre la circulation sanguine, mais assez petites pour éviter les fuites. Un nombre approprié de sutures doit être utilisé pour les anastomoses afin de combler les lacunes, mais pas trop pour obstruer les vaisseaux.

Si vous vous familiarisez avec les techniques microchirurgicales, cette procédure peut être effectuée en environ 3 heures. Ce modèle de transplantation laryngée peut être réalisé de manière fiable chez la souris et utilisé pour étudier la réponse immunitaire de l’hôte après une allotransplantation composite vascularisée.

Protocole

Cette recherche a été réalisée en conformité avec le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de la Mayo Clinic. Des souris BalbC (âgées de 10 à 12 semaines) ont été utilisées comme donneuses et des souris C57/BL6 (âgées de 10 à 12 semaines) ont été utilisées comme receveuses parce que leurs principaux complexes d’histocompatibilité, H-2Db et H-2Kb, respectivement, sont immunologiquement incompatibles, et donc la réponse immunitaire à la greffe peut être étudiée plus avant. Tous les instruments utilisés pendant la chirurgie ont été stérilisés (voir la figure supplémentaire S1 et la figure supplémentaire S2), et le champ chirurgical a été maintenu stérile tout au long du protocole conformément aux instructions de l’IACUC.

1. Chirurgie du donneur et obtention d’une greffe

1. Injectez au donneur de la buprénorphine à libération prolongée (3,25 mg/kg de poids corporel par voie sous-cutanée) 30 minutes avant de commencer la procédure. Placez la souris dans la boîte d’anesthésie des rongeurs pour l’induction de l’anesthésie à 3% d’isoflurane délivré avec un débit de 1 L / min O₂ . Une fois l’animal complètement anesthésié, transférer la souris dans la zone de rasage et administrer 1,5% d’isoflurane avec un débit de 1 L/min O₂ pour le maintien de l’anesthésie. Confirmez la profondeur de l’anesthésie avec un pincement d’orteil.
2. Rasez la poitrine et le cou de la souris jusqu’à la mâchoire et appliquez une crème dépilatoire. Après 30 s, essuyez la crème avec un tampon de gaze stérile mouillé avec de l’eau et transférez la souris dans la zone chirurgicale.
3. Appliquez du lubrifiant pour les yeux sur les yeux de la souris. Placez la souris sur un coussin chauffant supplémentaire drapé pour assurer une température corporelle appropriée.
4. Immobiliser la souris, préparer la zone chirurgicale trois fois avec de la povidone iodée et de l’alcool, puis draper la souris.
   REMARQUE: Vérifiez la profondeur de l’anesthésie par un pincement d’orteil et maintenez l’anesthésie à 1,5% d’isoflurane et 1 L / min O₂ débit via un masque facial tout au long de la procédure.
5. Faites une petite incision horizontale juste supérieure à l’encoche suprasternale. À l’aide de ciseaux fins, élever la peau bilatéralement à travers cette incision jusqu’à la mandibule. Extraire un segment de peau en forme de trapèze entraînant une exposition des glandes salivaires bilatérales, des muscles sternomastoïdiens, des muscles digastriques et de l’aspect supérieur du sternum (figure 2A).
6. Extrayez les glandes salivaires bilatérales en utilisant la cautérisation à la partie supérieure où une petite veine traversant la glande est visualisée (Figure 2A).
   REMARQUE: Si l’on ne prend pas soin de cautériser le vaisseau avant de retirer la glande, des saignements importants peuvent être rencontrés à cette étape.
7. Rétractez doucement les tissus lymphoïdes et adipeux latéralement pour exposer les muscles sternomastoïdiens et sangle. Disséquer les muscles sternomastoïdes bilatéraux des tissus environnants et les rétracter latéralement à l’aide de rétracteurs.
   REMARQUE: Cette manœuvre exposera complètement le complexe LTE avec les muscles de la sangle et fournira un espace de travail confortable pour la dissection des artères carotides (Figure 2B).
8. Faites une incision médiane entre les muscles de la sangle et excès-les bilatéralement, en prenant soin de ne pas endommager la glande thyroïde sous-jacente et en la laissant sur le complexe LTE.
   REMARQUE : Après cette étape, les artères carotides bilatérales doivent être visibles (Figure 2C).
9. Disséquer circonférentiellement les artères carotides communes au niveau de la clavicule inférieur et au niveau de la bifurcation carotidienne supérieurement. Disséquer le nerf vague et la veine jugulaire interne des artères carotides. Ne les incluez pas dans la greffe obtenue.
   REMARQUE: L’artère thyroïdienne supérieure peut être vue juste supérieure à la bifurcation se déplaçant médialement. Laissez intact le mince fascia entourant ce vaisseau et n’essayez pas de le disséquer circonférentiellement. Ce vaisseau fournit le flux sanguin au complexe LTE et servira de pédicule après la transplantation. La préservation de ce navire est de la plus haute importance.
10. Disséquer les artères carotides internes et externes assez loin pour pouvoir ligaturer et diviser. S’il est difficile de visualiser les vaisseaux, utilisez un rétracteur séparé pour rétracter latéralement les muscles digastriques.
    REMARQUE: Évitez de disséquer l’artère carotide externe plus près de la bifurcation pour éviter tout dommage à l’artère thyroïdienne supérieure. À cette étape, l’artère occipitale, qui se ramifie à partir de la carotide externe et suit parallèlement à l’artère carotide interne, peut être rencontrée et ne doit pas être confondue avec l’artère carotide interne, qui est plus grande et se trouve plus profonde (Figure 2D).
11. Utilisation de 8-0 Les sutures en nylon, ligaturent les artères carotides internes de 2 à 3 mm supérieures à la bifurcation carotidienne. Litruer les artères carotides externes d’au moins 3 mm au-dessus du point ramifié de l’artère thyroïde supérieure.
    REMARQUE: Après ces ligatures, le complexe LTE sera pédiculé via les artères thyroïdiennes supérieures aux artères carotides bilatérales.
12. Libellez les artères carotides communes au niveau du sternum et coupez tous les vaisseaux ligaturés bilatéralement. Gardez les pédicules vasculaires au-dessus du complexe LTE pour éviter les dommages accidentels lors d’une dissection ultérieure. Pour éviter toute fuite de gaz ou perte accidentelle d’anesthésie, assurez-vous que l’animal a expiré avant de faire des coupures des voies respiratoires.
13. Répartir les muscles infrahyoïdes au niveau de l’hyoïde. Créez une pharyngotomie antérieure juste inférieure à la hyoïde. Porter l’incision jusqu’au fascia prévertébral pour libérer le complexe LTE de manière supérieure.
14. Transectez la trachée sous le cinquième anneau trachéal et portez l’incision à travers l’œsophage jusqu’au fascia prévertébral pour libérer le complexe LTE inférieurement. Libérer la trachée et l’œsophage du fascia prévertébral sous-jacent d’une direction inférieure à une direction supérieure.
    REMARQUE: Gardez les pédicules vasculaires au-dessus du complexe LTE pour éviter les dommages accidentels lors d’une dissection ultérieure.
15. Créez une pharyngotomie antérieure juste inférieure à la hyoïde. Porter l’incision jusqu’au fascia prévertébral pour libérer le complexe LTE de manière supérieure. Divisez toutes les attaches lymphoïdes ou de tissu conjonctif restantes entre le complexe LTE et le tissu environnant. Retirez la greffe.
    REMARQUE : La greffe contient le larynx, la trachée, les glandes thyroïdes, les glandes parathyroïdes, l’œsophage et les muscles laryngés du donneur en tant qu’unité composite (Figure 2E).

2. Préparation du greffon

1. Placez le greffon obtenu dans une boîte de Petri stérile et lavez-la avec une solution saline normale pour éliminer les caillots sanguins. À l’aide de micro-pinces, traire doucement le sang et les caillots des artères carotides bilatérales. Dilater les artères carotides bilatérales à l’aide de microdilatateurs de 1 mm.
2. À l’aide d’une aiguille à bout émoussé de 30 g, injecter environ 2 mL de solution saline héparinée dans chaque artère carotide pour rincer le greffon.
   REMARQUE: On peut voir du sang et une solution saline s’écouler de l’artère carotide controlatérale et des petites extrémités des vaisseaux libres, ce qui confirme des artères thyroïdiennes supérieures intactes.
3. Extrayez l’adventice loin des extrémités artérielles afin qu’elles aient des bords propres pour l’anastomose.
   NOTE: Le greffon peut être laissé dans une solution saline héparinée et une courte pause peut être prise jusqu’à 3 h avant de la transplanter chez le receveur⁹.

3. Chirurgie receveuse et anastomose des vaisseaux

1. Préparez la souris receveuse de la même manière que celle décrite pour le donneur après les étapes d’induction de l’anesthésie, de rasage et de préparation chirurgicale. Injectez à la souris receveuse un analgésique à libération prolongée par voie sous-cutanée 30 minutes avant le début de la chirurgie.
2. À l’aide d’un scalpel, faites une incision médiane du cou s’étendant de la mâchoire au-dessus au sternum inférieur. Élevez la peau du côté gauche et rétractez-la latéralement.
3. Extrayez la glande salivaire gauche, cautérisant les vaisseaux supérieurs comme décrit précédemment. Uriner le tissu adipeux et lymphoïde en divisant tous les vaisseaux visibles présentant une cautérisation à basse température, en prenant soin de ne pas endommager la veine jugulaire externe sous-jacente (Figure 3A).
4. Disséquer la veine jugulaire externe circonférentiellement. Utilisez au moins 5 mm de longueur libre du vaisseau pour l’anastomose. Utilisez une cautérisation ou un ligaturage à basse température et divisez les veines relativement grosses qui se ramifient à partir de la veine jugulaire.
5. Disséquez le muscle sternomastoid et rétractez-le latéralement. Gardez la veine disséquée protégée derrière le muscle pour éviter tout contact direct avec l’écarteur.
6. Extrayez les muscles de la sangle gauche pour accéder à l’artère carotide receveuse. Disséquer circonférentiellement l’artère carotide commune de la clavicule inférieure jusqu’à la bifurcation carotidienne supérieure (Figure 3B).
7. Passez le matériau de fond sous la veine jugulaire externe et appliquez les pinces de vaisseau V3 à double approximation.
8. Placez une suture en nylon 10-0 à travers la paroi antérieure de la veine jugulaire externe à l’emplacement de la veinotomie souhaitée et utilisez cette suture pour tirer vers l’avant et tenter le vaisseau.
9. Couper à la suture avec des microciseaux juste assez profonds pour créer la veinotomie à fente unique de la bonne taille et s’assurer que la coupe est complètement à travers la paroi veineuse.
10. À l’aide d’une aiguille à bout émoussé de 30 g, rincer l’intérieur de la veine avec une solution saline héparinisée.
11. Placez le complexe LTE du donneur entre l’artère carotide gauche du receveur et la veine jugulaire externe gauche. Aligner l’extrémité libre de l’artère carotide gauche donneuse vers la veine jugulaire externe gauche du receveur et biseauter les extrémités des vaisseaux avec des ciseaux tranchants.
12. À l’aide de quatre sutures interrompues en nylon 10-0, anastomose l’artère carotide gauche du donneur et la veine jugulaire externe gauche du receveur de bout en bout.
13. Glissez le matériau de fond sous l’artère carotide commune receveuse et placez les pinces de vaisseau A3 à double approximation sur l’artère carotide commune réceptrice. Créez une artériotomie de la même manière que la veinotomie.
    REMARQUE: Assurez-vous que l’artériotomie est de la même taille que la lumière de l’artère carotide du donneur. S’il est trop volumineux, des saignements abondants se produiront après le retrait des pinces. S’il est trop petit, le flux sanguin vers la greffe sera obstrué.
14. Anastomose l’artère carotide droite du donneur à l’artère carotide gauche du receveur d’un bout à l’autre en utilisant six sutures interrompues en nylon 10-0.
    REMARQUE: Une technique microvasculaire correcte doit être respectée dans toute l’anastomose vasculaire du vaisseau. Le passage à travers la paroi arrière entraîne une réduction considérable du flux sanguin, mettant en danger la survie du greffon. En raison de la petite taille des vaisseaux, essayer de refaire les sutures est très difficile.
15. Retirez les pinces du côté veineux. En cas de saignement, appliquez une légère pression avec des pointes de coton.
16. Retirez les pinces sur l’artère et appliquez immédiatement une légère pression avec des pointes en coton.
    REMARQUE: Des saignements sont attendus à cette étape, qui s’arrête généralement après 1 min avec une légère pression.
17. Vérifiez l’intégrité du flux sanguin dans l’artère et la veine.
    REMARQUE: Avec un flux artériel intact, la pulsation de l’artère carotide donneuse est généralement observée et la glande thyroïde donneuse passe de sa couleur transparente rougie à sa couleur rougeâtre d’origine. Une coloration rouge des petits vaisseaux du complexe LTE peut également être observée.
18. Irriguer le champ chirurgical avec une solution saline héparinée et fermer l’incision cutanée avec une suture monofilament 5-0 en courant. Appliquez une pommade antibiotique ou un adhésif cutané sur l’incision.
19. Injectez 1 mL de solution saline chaude par voie sous-cutanée pour tenir compte de la perte de liquide pendant la chirurgie.
20. Arrêtez l’anesthésie et transférez la souris dans une cage de récupération. Observez la souris sur un coussin chauffant jusqu’à ce qu’elle soit complètement réveillée pour éviter l’hypothermie.

Résultats

Confirmation de la réussite de la transplantation
En utilisant le protocole décrit ci-dessus, il est possible d’évaluer le flux sanguin vers le complexe LTE en observant la pulsation de l’artère carotide du donneur après avoir retiré les pinces vasculaires. La pulsation est généralement visible et la coloration rouge immédiate de l’artère donneuse confirme un flux sanguin actif (Figure 4A). Si l’anastomose n’est pas efficace, l’artère n’aura pas d...

Discussion

L’incidence et la prévalence du cancer du larynx ont augmenté respectivement de 12 % et 24 % au cours des trois dernières décennies, et bon nombre de ces patients subissent une laryngectomie pour le traitement¹⁰. Cette procédure aggrave considérablement la qualité de vie d’une personne et, par conséquent, un traitement alternatif est souhaité. L’allotransplantation composite vascularisée du larynx peut améliorer la capacité d’un patient à respirer et à parler; Cependant, des ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1 Paperclips	Staples	OP-7404	Clips are shaped manually to be used as retractors
1 cc Insulin Syringes	BD	329412	27 G 5/8
10-0 Ethilon Nylon Suture	Ethicon	2870G
25 G Precision Glide Needle	BD	305125	1 in
3 mL Luer-Lok Tip Syringe	BD	309657
30 G Sterile Standard Blunt Needles	Cellink	NZ5300505001
5-0 Monocryl Suture	Ethicon	Y822G
8-0 Ethilon Nylon Suture	Ethicon	2815G
Adson Forceps	Fine Science Tools	11027-12	Straight, 1 x 2 teeth
Adventitia scissors	S&T	SAS-10	19 mm, 10 cm, straight
Angled Forceps	Fine Science Tools	00109-11	45/11 cm
Artifical Tears Lubricant Opthalmic Ointment	Akorn Animal Health	59399-162-35
Bandaid Fabric Fingertip	Cardinal Healthcare	299399
Betadine Solution Swabsticks	Purdue Products	67618-153-01
Buprenex Injection	CIII	12495-0757-1	0.3 mg/mL
Clamp applying forceps without lock	Accurate Surgical & Scientific Instruments	ASSI.CAF5	14 cm
Cotton Swabs	Puritan	10806-001-PK
DeBakey forceps
Dermabond Mini	Cardinal Healthcare	315999
Dissecting Boards	Mopec	22-444-314
Falcon Sterile Disposable Petri Dish	Corning	25373-041	35 mm
Fine Scisssors	Fine Science Tools	14029-10	Curved Sharp-Blunt 10 cm
Golden A5 2-Speed Blade Clipper	Oster	008OST-78005-140	#10
Hair Remover Sensitive Formula	Nair	2260000033
Heparin	Meitheal Pharmaceuticals	71288-4O2-10	10,000 USP units per 10 mL
Isoflurane	Piramal Healthcare	66794-013-25
Low-Temp Micro Fine Tip Cautery	Bovie Medical	AA90
Mercian Visibility Background Material	Synovis Micro Companies	VB3	Green
Microvascular Approximator Clamp without Frame	Accurate Surgical & Scientific Instruments	ASSI.ABB11V	0.4-1 mm Vessel Diameter
Mouse face mask kit	Xenotec	XRK-S	Small
Needle holder	S&T	C-14 W	5.5", 8 mm, 0.4 mm
Press n' Seal	Glad	70441
Scalpel	Braun	BA210	10 blade
Single Mini Vessel Clamp	Accurate Surgical & Scientific Instruments	ASSI.ABB11M	.31 (8 mm), 3 x 1 mm Rnd. Bl., Black Pair
Stereomicroscope	Olympus	SZ61
Sterile Alcohol Prep Pads	Fisherbrand	06-669-62
Sterile Disposable Drape Sheets	Dynarex	DYN4410-CASE
Sterile Gauze Pads	Dukal	1212
Sterile Saline	Hospira	236173	NaCl 0.9%
Sterile Surgical Gloves	Gammex	851_A
Straight Forceps	Fine Science Tools	00108-11	11 cm
Tissue forceps	Accurate Surgical & Scientific Instruments	ASSI.JFLP3	13.5 cm, 8 mm, 0.3 mm
Vannas Pattern Scissors	Accurate Surgical & Scientific Instruments	ASSI.SDC15RV	15 cm, 8 mm, curved 7mm blade
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-10	3 mm cutting edge, curved
Vessel Dilator Tip	Fine Science Tools	00126-11	Diameter 0.1 mm/Angled 10/11 cm
Vessel Dilator, Classic line	S&T	D-5a.3 W	9 mm, 0.3 mm, angled 10