Um modelo heterotópico de camundongo para estudar o transplante laríngeo

Resumo

O objetivo deste manuscrito é descrever as etapas microcirúrgicas necessárias para a realização de um transplante laríngeo heterotópico em camundongos. As vantagens deste modelo de camundongo em comparação com outros modelos animais de transplante laríngeo são seu custo-efetividade e a disponibilidade de ensaios e dados imunológicos.

Resumo

O transplante heterotópico laríngeo, embora seja um procedimento tecnicamente desafiador, oferece mais análises científicas e benefícios de custo em comparação com outros modelos animais. Embora descrita pela primeira vez por Shipchandler et al. em 2009, essa técnica não é amplamente utilizada, possivelmente devido às dificuldades em aprender a técnica microcirúrgica e ao tempo necessário para dominá-la. Este artigo descreve detalhadamente as etapas cirúrgicas, bem como possíveis armadilhas a serem evitadas, a fim de incentivar o uso efetivo dessa técnica.

Neste modelo, as artérias carótidas bilaterais da laringe doadora são anastomosadas à artéria carótida receptora e à veia jugular externa, permitindo o fluxo sanguíneo através do enxerto. O fluxo sanguíneo pode ser confirmado no intraoperatório pela visualização do enchimento sanguíneo nas artérias carótidas bilaterais do enxerto, vermelhidão das glândulas tireoidianas do enxerto e sangramento dos microvasos do enxerto. Os elementos cruciais para o sucesso incluem a preservação delicada dos vasos do enxerto, a realização do tamanho correto da arteriotomia e venotomia e o uso do número adequado de suturas nas anastomoses arterial-arterial e arterial-venosa para fixar os vasos sem vazamento e prevenir a oclusão.

Qualquer pessoa pode se tornar proficiente nesse modelo com treinamento suficiente e realizar o procedimento em aproximadamente 3 h. Se realizado com sucesso, esse modelo permite que os estudos imunológicos sejam realizados com facilidade e baixo custo.

Introdução

Para pacientes que sofrem de dano laríngeo irreparável ou câncer de laringe, a laringectomia total é muitas vezes a única opção¹. A laringectomia total deixa o paciente sem a capacidade de respirar e falar por conta própria, além de vivenciar sofrimento social e psicológico². Pacientes com câncer de laringe que necessitam de laringectomia total são excelentes potenciais candidatos para o transplante laríngeo. Embora o transplante laríngeo humano no contexto de dano laríngeo irreparável tenha sido realizado, o alotransplante da laringe é atualmente evitado nesses pacientes devido ao medo de recorrência tumoral, à possibilidade de rejeição crônica e às infecções derivadas de doadores³. A imunossupressão é a principal causa dessas preocupações. A dramática perda do primeiro paciente transplantado laríngeo parcial devido à recidiva tumoral após o tratamento imunossupressor convencional é evidência de que um regime imunossupressor apropriado deve ser planejado antes que novas tentativas sejam feitas para transplante em pacientes com câncer de laringe ^4,5.

Para melhor compreensão da resposta imune do hospedeiro a uma laringe transplantada, o primeiro modelo de transplante laríngeo em ratos foi desenvolvido em 1992 por Strome, e melhorias na técnica cirúrgica foram realizadas em 2002 ^6,7. Embora esse modelo seja eficaz para o estudo do transplante laríngeo, a falta de agentes imunológicos específicos para ratos e o maior custo associado aos modelos de ratos levaram ao desenvolvimento de um novo modelo de camundongo para o estudo do transplante laríngeo em 2009⁸.

A principal aplicação da técnica descrita é estudar diferentes regimes de drogas imunossupressoras no transplante laríngeo. Melhorar as terapias imunossupressoras atuais pode ampliar o pool de candidatos e levar a um transplante seguro em pacientes com câncer. Os benefícios deste modelo de rato são a sua relação custo-eficácia e a ampla disponibilidade de dados imunológicos e reagentes.

Equipes que trabalham em regimes de tratamento imunossupressor para transplante laríngeo podem usar esse método para coletar um grande volume de dados imunológicos, e diferentes regimes de drogas podem ser rapidamente testados e comparados. Outras modalidades de tratamento potenciais que podem modular a resposta imune ao transplante, como injeções de células-tronco, também podem ser testadas usando esse modelo. Finalmente, experimentos podem ser desenvolvidos para observar os efeitos sistêmicos a longo prazo do transplante laríngeo, estendendo o período de acompanhamento.

A técnica aqui descrita utiliza anastomoses extremo-a-lado para fornecer fluxo arterial e venoso a um enxerto de laringe heterotópico. O enxerto é um complexo laringotraqueoesofágico (LTE) que compreende a laringe, as glândulas tireoides, as glândulas paratireoides, a traqueia e o esôfago do doador, com artérias carótidas bilaterais e pedículos intactos. Uma artéria carótida doadora é anastomosada à artéria carótida receptora e fornece fluxo sanguíneo arterial, enquanto a outra artéria carótida doadora é anastomosada à veia jugular externa receptora e fornece fluxo sanguíneo venoso (Figura 1).

Várias modificações foram feitas na técnica cirúrgica do modelo de rato para garantir o sucesso no modelo de camundongo. Por exemplo, um agente anestésico inalado foi usado em vez de um agente injetável para aumentar o controle sobre a profundidade da anestesia e reduzir as complicações. A sutura contínua é utilizada na anastomose artério-arterial em ratos; no entanto, devido ao menor tamanho dos vasos do rato, isso é tecnicamente difícil e pode causar estreitamento do lúmen do vaso⁷. Como resultado, suturas interrompidas são usadas no modelo de camundongo e resultam em melhor patência do vaso. Além disso, no modelo de rato, o pedículo da artéria tireoidiana superior (IST) é dissecado e visualizado. Dado o menor tamanho do STA em camundongos, essa dissecção pode resultar em danos e até mesmo transecção do STA. Como resultado, ele não é dissecado no modelo do mouse. Em vez disso, a fáscia próxima é preservada para garantir que o STA seja mantido intacto.

As principais armadilhas potenciais desta técnica incluem danificar os pedículos do complexo LTE do doador, fazer uma arteriotomia ou venotomia de tamanho incorreto, oclusão de vasos nos locais de anastomose ou deixar lacunas nos locais de anastomose que podem causar sangramento. Para evitar esses erros, deve-se tomar cuidado ao adquirir o enxerto doador, deixando um manguito de tecido ao redor do pedículo do STA. A arteriotomia e a venotomia devem ser grandes o suficiente para permitir o fluxo sanguíneo, mas pequenas o suficiente para evitar vazamentos. Um número apropriado de suturas deve ser usado para que as anastomoses fechem quaisquer lacunas, mas não muitas para ocluir os vasos.

Se a familiaridade com as técnicas microcirúrgicas for obtida, este procedimento pode ser realizado em aproximadamente 3 h. Este modelo de transplante laríngeo pode ser realizado de forma confiável em camundongos e usado para estudar a resposta imune do hospedeiro após alotransplante composto vascularizado.

Protocolo

Esta pesquisa foi realizada em conformidade com o Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Camundongos BalbC (10-12 semanas de idade) foram usados como doadores e camundongos C57/BL6 (10-12 semanas de idade) foram usados como receptores porque seus principais complexos de histocompatibilidade, H-2Db e H-2Kb, respectivamente, são imunologicamente incompatíveis e, portanto, a resposta imune ao enxerto pode ser mais estudada. Todos os instrumentos utilizados durante a cirurgia foram esterilizados (ver Figura Suplementar S1 e Figura Suplementar S2), e o campo cirúrgico foi mantido estéril durante todo o protocolo de acordo com as instruções da IACUC.

1. Cirurgia do doador e obtenção do enxerto

1. Injetar o dador com buprenorfina de libertação prolongada (3,25 mg/kg de peso corporal por via subcutânea) 30 minutos antes de iniciar o procedimento. Coloque o rato na caixa de anestesia de roedores para indução anestésica a 3% de isoflurano administrado com fluxo de 1 L/min O₂ . Após o animal estar totalmente anestesiado, transfira o camundongo para a área de barbear e administre isoflurano a 1,5% com fluxo O₂ de 1 L/min para manutenção da anestesia. Confirme a profundidade da anestesia com uma pitada no dedo do pé.
2. Raspe o peito e o pescoço do rato até a linha da mandíbula e aplique creme depilatório. Após 30 s, limpe o creme com uma gaze estéril molhada com água e transfira o rato para a área cirúrgica.
3. Aplique lubrificante ocular nos olhos do rato. Coloque o rato numa almofada de aquecimento suplementar drapeada para garantir a temperatura corporal adequada.
4. Imobilize o rato, prepare a área cirúrgica três vezes com iodopovidona e álcool e, em seguida, cubra o rato.
   NOTA: Verifique a profundidade da anestesia por uma pitada de dedo do pé e mantenha a anestesia a 1,5% de isoflurano e 1 L/min de fluxo O₂ através de uma máscara facial durante todo o procedimento.
5. Faça uma pequena incisão horizontal logo superior ao entalhe supraesternal. Usando uma tesoura fina, eleve a pele bilateralmente através dessa incisão até a mandíbula. Excisar um segmento cutâneo em forma de trapézio, resultando em exposição das glândulas salivares bilaterais, músculos esternomastoideos, músculos digástricos e aspecto superior do esterno (Figura 2A).
6. Excisar as glândulas salivares bilaterais usando cauterização na parte superior, onde uma pequena veia que viaja através da glândula é visualizada (Figura 2A).
   NOTA: Se não for tomado cuidado para cauterizar o vaso antes de remover a glândula, sangramento significativo pode ser encontrado nesta etapa.
7. Retraia suavemente os tecidos linfoide e adiposo lateralmente para expor os músculos esternomastoides e da cinta. Dissecar os músculos esternomastoides bilaterais dos tecidos circundantes e retraí-los lateralmente usando afastadores.
   NOTA: Esta manobra irá expor totalmente o complexo LTE com músculos da cinta e proporcionar um espaço de trabalho confortável para a dissecção das artérias carótidas (Figura 2B).
8. Faça uma incisão na linha média entre os músculos da cinta e os extirpe bilateralmente, tomando cuidado para não danificar a glândula tireoide subjacente e deixando-a no complexo LTE.
   NOTA: Após essa etapa, as artérias carótidas bilaterais devem estar visíveis (Figura 2C).
9. Dissecar circunferencialmente as artérias carótidas comuns ao nível da clavícula inferiormente e ao nível da bifurcação carotídea superiormente. Dissecar o nervo vago e a veia jugular interna das artérias carótidas. Não os inclua no enxerto adquirido.
   NOTA: A artéria tireoidiana superior pode ser vista apenas superior à bifurcação que viaja medialmente. Deixe intacta a fáscia fina que envolve este vaso e não tente dissecá-la circunferencialmente. Este vaso fornece o fluxo sanguíneo para o complexo LTE e servirá como pedículo após o transplante. A preservação deste navio é de extrema importância.
10. Dissecar as artérias carótidas internas e externas o suficiente para poder ligar e dividir. Se houver dificuldade com a visualização dos vasos, use um afastador separado para retrair os músculos digástricos lateralmente.
    NOTA: Evite dissecar a artéria carótida externa mais perto da bifurcação para evitar qualquer dano à artéria tireoidiana superior. Nesta etapa, a artéria occipital, que se ramifica da carótida externa e segue paralelamente à artéria carótida interna, pode ser encontrada e não deve ser confundida com a artéria carótida interna, que é maior e encontrada mais profunda (Figura 2D).
11. Usando 8-0 suturas de nylon, ligam as artérias carótidas internas 2 a 3 mm superiores à bifurcação carotídea. Ligue as artérias carótidas externas pelo menos 3 mm superiores ao ponto de ramificação da artéria tireoidiana superior.
    NOTA: Após essas ligaduras, o complexo LTE será pediculado através das artérias tireoidianas superiores para as artérias carótidas bilaterais.
12. Ligue as artérias carótidas comuns ao nível do esterno e corte todos os vasos ligados bilateralmente. Mantenha os pedículos vasculares no topo do complexo LTE para evitar danos acidentais durante a dissecção adicional. Para evitar qualquer vazamento de gás ou perda inadvertida de anestesia, certifique-se de que o animal expirou antes de fazer qualquer corte nas vias aéreas.
13. Divida os músculos infra-hióides ao nível do hioide. Criar uma faringotomia anterior apenas inferior ao hioide. Leve a incisão até a fáscia pré-vertebral para liberar o complexo LTE superiormente.
14. Transecte a traqueia abaixo do quinto anel traqueal e leve a incisão através do esôfago até a fáscia pré-vertebral para liberar o complexo LTE inferiormente. Libere a traqueia e o esôfago da fáscia pré-vertebral subjacente de uma direção inferior a superior.
    NOTA: Mantenha os pedículos vasculares no topo do complexo LTE para evitar danos acidentais durante a dissecção adicional.
15. Criar uma faringotomia anterior apenas inferior ao hioide. Leve a incisão até a fáscia pré-vertebral para liberar o complexo LTE superiormente. Divida quaisquer anexos linfoides ou de tecido conjuntivo restantes entre o complexo LTE e o tecido circundante. Remova o enxerto.
    NOTA: O enxerto contém a laringe doadora, traqueia, glândulas tireoides, glândulas paratireoides, esôfago e músculos laríngeos como unidade composta (Figura 2E).

2. Preparação do enxerto

1. Coloque o enxerto adquirido em uma placa de Petri estéril e lave-o com solução salina normal para se livrar de quaisquer coágulos sanguíneos. Usando micro pinça, leite suave o sangue e coágulos para fora das artérias carótidas bilaterais. Dilatar as artérias carótidas bilaterais usando microdilatadores de 1 mm.
2. Usando uma agulha de ponta romba de 30 G, injete aproximadamente 2 mL de solução salina heparinizada em cada artéria carótida para lavar o enxerto.
   NOTA: Sangue e solução salina podem ser vistos saindo da artéria carótida contralateral e pequenas extremidades de vasos livres, o que confirma artérias tireoidianas superiores intactas.
3. Exclua a adventícia para longe das extremidades arteriais para que elas tenham bordas limpas para anastomose.
   NOTA: O enxerto pode ser deixado em solução salina heparinizada e uma pequena pausa pode ser feita por até 3 h antes de transplantá-lo para o receptor⁹.

3. Cirurgia do receptor e anastomose dos vasos

1. Prepare o rato receptor da mesma forma descrita para o dador após as etapas de indução da anestesia, barbear e preparação cirúrgica. Injete o rato receptor com analgésico de libertação prolongada por via subcutânea 30 minutos antes do início da cirurgia.
2. Usando um bisturi, faça uma incisão no pescoço da linha média que se estende da linha da mandíbula superiormente ao esterno inferiormente. Eleve a pele do lado esquerdo e recrai-a lateralmente.
3. Excisar a glândula salivar esquerda, cauterizando os vasos superiores como descrito anteriormente. Extirpar o tecido adiposo e linfoide dividindo quaisquer vasos visíveis com cauterização a baixa temperatura, tomando cuidado para não danificar a veia jugular externa subjacente (Figura 3A).
4. Dissecar a veia jugular externa circunferencialmente. Use pelo menos 5 mm de comprimento claro do vaso para anastomose. Use cauterização ou ligadura de baixa temperatura e divida quaisquer veias relativamente grandes que se ramificam da veia jugular.
5. Dissecar o músculo esternomastóideo e retraí-lo lateralmente. Mantenha a veia dissecada protegida atrás do músculo para evitar o contato direto com o afastador.
6. Excise os músculos da alça esquerda para obter acesso à artéria carótida receptora. Dissecar circunferencialmente a artéria carótida comum da clavícula inferiormente até a bifurcação carotídea superiormente (Figura 3B).
7. Passe o material de fundo sob a veia jugular externa e aplique as braçadeiras de vaso V3 de aproximação dupla.
8. Coloque uma sutura de nylon 10-0 através da parede anterior da veia jugular externa no local da venotomia desejada e use essa sutura para puxar anteriormente e entenda o vaso.
9. Corte até a sutura com microtesouras profundas o suficiente para criar o tamanho adequado de venotomia de fenda única e garantir que o corte seja completamente através da parede venosa.
10. Usando uma agulha de ponta contundente de 30 G, lave o interior da veia com solução salina heparinizada.
11. Coloque o complexo LTE do doador entre a artéria carótida esquerda receptora e a veia jugular externa esquerda. Alinhar a extremidade livre da artéria carótida esquerda do doador em direção à veia jugular externa esquerda receptora e chanfrar as extremidades dos vasos com uma tesoura afiada.
12. Usando quatro suturas interrompidas de nylon 10-0, anastomose a artéria carótida esquerda do doador e a veia jugular externa esquerda receptora de forma end-to-side.
13. Deslize o material de fundo sob a artéria carótida comum receptora e coloque os grampos duplos aproximados do vaso A3 na artéria carótida comum receptora. Crie uma arteriotomia da mesma forma que a venotomia.
    NOTA: Certifique-se de que a arteriotomia é do mesmo tamanho que o lúmen da artéria carótida doadora. Se for muito grande, o sangramento profuso ocorrerá depois que os grampos forem removidos. Se for muito pequeno, o fluxo sanguíneo para o enxerto será obstruído.
14. Anastomose a artéria carótida direita doadora para a artéria carótida esquerda receptora de forma end-to-side usando seis suturas interrompidas de nylon 10-0.
    NOTA: A técnica microvascular correta deve ser respeitada em toda a anastomose do vaso. A passagem pela parede traseira resulta em um fluxo sanguíneo consideravelmente restrito, colocando em risco a sobrevivência do enxerto. Devido ao pequeno tamanho dos vasos, tentar refazer as suturas é muito difícil.
15. Remova os grampos no lado venoso. Se o sangramento for encontrado, aplique uma pressão suave com pontas de algodão.
16. Remova os grampos na artéria e aplique imediatamente uma pressão suave com as pontas de algodão.
    NOTA: Algum sangramento é esperado nesta etapa, que geralmente pára após 1 min com pressão suave.
17. Verifique a integridade do fluxo sanguíneo na artéria e na veia.
    NOTA: Com o fluxo arterial intacto, a pulsação da artéria carótida doadora é geralmente vista, e a glândula tireoide doadora muda de sua cor transparente corada de volta para sua cor avermelhada original. A coloração vermelha dos pequenos vasos no complexo LTE também pode ser observada.
18. Irrigar o campo cirúrgico com solução salina heparinizada e fechar a incisão da pele com uma sutura de monofilamento 5-0 de forma corrida. Aplique pomada antibiótica ou um adesivo de pele na incisão.
19. Injete 1 mL de solução salina quente por via subcutânea para explicar a perda de líquidos durante a cirurgia.
20. Pare a anestesia e transfira o rato para uma gaiola de recuperação. Observe o mouse em uma almofada de aquecimento até que esteja totalmente acordado para evitar a hipotermia.

Resultados

Confirmação do sucesso do transplante
Utilizando o protocolo descrito acima, é possível avaliar o fluxo sanguíneo para o complexo LTE observando a pulsação da artéria carótida doadora após a remoção dos grampos dos vasos. A pulsação é tipicamente visível, e a coloração vermelha imediata da artéria doadora confirma o fluxo sanguíneo ativo (Figura 4A). Se a anastomose não for eficaz, a artéria não terá pulsação, parecerá parcialmente colapsada e s...

Discussão

A incidência e a prevalência de câncer de laringe aumentaram 12% e 24%, respectivamente, nas últimas três décadas, e muitos desses pacientes foram submetidos à laringectomia para tratamento¹⁰. Este procedimento piora significativamente a qualidade de vida de uma pessoa e, portanto, um tratamento alternativo é desejado. O alotransplante composto vascularizado da laringe pode melhorar a capacidade do paciente de respirar e falar; no entanto, a pesquisa ainda é necessária antes que essa té...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1 Paperclips	Staples	OP-7404	Clips are shaped manually to be used as retractors
1 cc Insulin Syringes	BD	329412	27 G 5/8
10-0 Ethilon Nylon Suture	Ethicon	2870G
25 G Precision Glide Needle	BD	305125	1 in
3 mL Luer-Lok Tip Syringe	BD	309657
30 G Sterile Standard Blunt Needles	Cellink	NZ5300505001
5-0 Monocryl Suture	Ethicon	Y822G
8-0 Ethilon Nylon Suture	Ethicon	2815G
Adson Forceps	Fine Science Tools	11027-12	Straight, 1 x 2 teeth
Adventitia scissors	S&T	SAS-10	19 mm, 10 cm, straight
Angled Forceps	Fine Science Tools	00109-11	45/11 cm
Artifical Tears Lubricant Opthalmic Ointment	Akorn Animal Health	59399-162-35
Bandaid Fabric Fingertip	Cardinal Healthcare	299399
Betadine Solution Swabsticks	Purdue Products	67618-153-01
Buprenex Injection	CIII	12495-0757-1	0.3 mg/mL
Clamp applying forceps without lock	Accurate Surgical & Scientific Instruments	ASSI.CAF5	14 cm
Cotton Swabs	Puritan	10806-001-PK
DeBakey forceps
Dermabond Mini	Cardinal Healthcare	315999
Dissecting Boards	Mopec	22-444-314
Falcon Sterile Disposable Petri Dish	Corning	25373-041	35 mm
Fine Scisssors	Fine Science Tools	14029-10	Curved Sharp-Blunt 10 cm
Golden A5 2-Speed Blade Clipper	Oster	008OST-78005-140	#10
Hair Remover Sensitive Formula	Nair	2260000033
Heparin	Meitheal Pharmaceuticals	71288-4O2-10	10,000 USP units per 10 mL
Isoflurane	Piramal Healthcare	66794-013-25
Low-Temp Micro Fine Tip Cautery	Bovie Medical	AA90
Mercian Visibility Background Material	Synovis Micro Companies	VB3	Green
Microvascular Approximator Clamp without Frame	Accurate Surgical & Scientific Instruments	ASSI.ABB11V	0.4-1 mm Vessel Diameter
Mouse face mask kit	Xenotec	XRK-S	Small
Needle holder	S&T	C-14 W	5.5", 8 mm, 0.4 mm
Press n' Seal	Glad	70441
Scalpel	Braun	BA210	10 blade
Single Mini Vessel Clamp	Accurate Surgical & Scientific Instruments	ASSI.ABB11M	.31 (8 mm), 3 x 1 mm Rnd. Bl., Black Pair
Stereomicroscope	Olympus	SZ61
Sterile Alcohol Prep Pads	Fisherbrand	06-669-62
Sterile Disposable Drape Sheets	Dynarex	DYN4410-CASE
Sterile Gauze Pads	Dukal	1212
Sterile Saline	Hospira	236173	NaCl 0.9%
Sterile Surgical Gloves	Gammex	851_A
Straight Forceps	Fine Science Tools	00108-11	11 cm
Tissue forceps	Accurate Surgical & Scientific Instruments	ASSI.JFLP3	13.5 cm, 8 mm, 0.3 mm
Vannas Pattern Scissors	Accurate Surgical & Scientific Instruments	ASSI.SDC15RV	15 cm, 8 mm, curved 7mm blade
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-10	3 mm cutting edge, curved
Vessel Dilator Tip	Fine Science Tools	00126-11	Diameter 0.1 mm/Angled 10/11 cm
Vessel Dilator, Classic line	S&T	D-5a.3 W	9 mm, 0.3 mm, angled 10