研究小鼠小肠对管腔颗粒的机械传感

摘要

为了研究小肠如何处理不同大小的颗粒，我们修改了一种既定的 体内 方法来确定小肠运输。

摘要

胃肠道 （GI） 蠕动对于正常的消化和吸收至关重要。在吸收营养的小肠中，运动性优化了消化和吸收。出于这个原因，小肠中的一些运动模式包括用于混合管腔内容物的分割和用于推进它们的蠕动。管腔内容物的物理性质调节小肠蠕动的模式。通过通过腔内容物和潜在的肠道蠕动对胃肠道机械感觉回路进行机械刺激，启动和调节复杂的胃肠道运动模式。然而，驱动这一过程的机械感觉机制仍然知之甚少。这主要是由于缺乏工具来剖析小肠如何处理不同物理性质的材料。为了研究小肠如何处理不同大小的颗粒，我们修改了一种既定的 体内 方法来确定小肠运输。我们用荧光液体或微小的荧光珠给活小鼠灌胃。30分钟后，我们解剖肠道，对荧光内容物在整个胃肠道中的分布进行成像。除了几何中心的高分辨率测量外，我们还使用可变尺寸的分档和光谱分析来确定不同材料如何影响小肠运输。我们已经探索了最近发现的"肠道接触"机制如何使用这种方法影响小肠蠕动。

引言

人类胃肠道（GI）是一个多英尺长的器官系统，大致近似为不同尺寸和物理性质的管^子1。当内容物在其长度上移动时，胃肠道的主要功能是吸收对生命至关重要的物质。小肠专门负责营养吸收。小肠的运输受到严格调节，以匹配消化和吸收功能，从而产生各种运动模式。贝利斯和斯塔林在1899年描述了"肠道定律"² ，展示了肠道中的收缩推进程序，今天称为蠕动反射;食物推注近端的节段收缩以推动其前进，远端节段放松以接收它。从理论上讲，仅这种模式就足以以流产方式运输材料，但一个多世纪的研究已经描绘了胃肠道收缩活动的更复杂的图景。人类认识到三个小肠运动期:迁移运动复合体 （MMC）、禁食期和餐后期³.在小鼠^4，5中也报道了相同的模式。MMC是一种在大多数哺乳动物中保守的循环运动模式^6，7。MMC 具有特征性的四相模式，可作为功能性胃肠道疾病的有用临床标志物⁷。这四个阶段按发生顺序依次是（I）静止，（II）不规则的低振幅收缩，（III）有规律的高振幅收缩，以及（IV）活动下降的斜坡下降期⁷。MMC标志着禁食期的主要运动模式³。禁食期的MMC清除小肠内容物，为下一餐做准备。

餐后运动模式针对消化和吸收功能进行了优化³.无论热量成分如何，最初的运输沿着小肠快速，内容物沿着肠道的长度传播，随后运输减慢^8。通过增加接触表面积并减慢其速度以增加停留时间来优化吸收。一旦营养物质进入管腔内，主导模式包括紧密（相距 <2 cm）的不协调收缩（分段收缩），以及一些叠加的大幅度收缩跨越整个小肠长度（蠕动收缩）⁹。分段收缩将腔内内容物混合到位。偶尔大的蠕动收缩将内容物推向结肠。

这种过渡回MMC的时间取决于食物量和热量成分¹⁰。因此，小肠样本管腔提示以调节何时在运动期之间过渡。机械线索，例如管腔内容物¹¹ 的物理性质、管腔体积和壁张力，与胃肠道壁 12、¹³、¹⁴、^15、16 中的机械感受器细胞接触。事实上，增加膳食的固体成分会导致小肠运输的增加¹⁷。我们推测物理性质，例如腔内内容物的液体或固态，必须与不同的机械感受器接触，因为它们在胃肠道壁上产生的各种力¹⁸。

测量人类体内胃肠道运输的金标准，如小鼠，是使用闪烁扫描测量的放射性示踪剂，因为它们离开胃或沿着结肠运输^19，20。在哺乳动物中，小肠袢以不可预测的方式使小肠难以在体内可靠地成像，但正在取得进展²¹。此外，目前缺乏量化小肠如何处理不同特性和大小的颗粒的工具。这里的起点是一种黄金标准技术，该技术标准化了小肠运输22，^23，24和屏障功能²²的研究。它由用荧光材料管饲小鼠组成，等待胃肠道运动来运输材料，切除胃肠道，将其从胃到结肠分成几个部分，切片并匀浆腔内内容物以进行荧光定量。我们做了两项改进。首先，我们改变了管饲内容物的组成，包括荧光微珠，以确定小肠如何分布物理颗粒。其次，我们通过对从胃到结肠的整个胃肠道离体成像来提高空间分辨率，并使用可变大小的分箱来标准化我们对动物的分析。我们假设这揭示了对餐后阶段推进性收缩与分段性收缩平衡的新见解。

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研究方案

此处描述的所有方法均已获得妙佑医疗国际机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。

1. 设置

1. 快速8至10周龄小鼠4小时。为老鼠提供水。
   注意:我们使用野生型雄性C57BL / 6J小鼠进行此处介绍的所有实验，但它们可以在任何品系，性别和基因型的小鼠上进行。
2. 在4°C冰箱的50mL锥形管中冷却15mL蒸馏水。
3. 使用带有磁力搅拌棒的热板在烧杯中将另外15mL蒸馏水加热至约80-90°C。
4. 测量 0.5% 甲基纤维素，总共 30 mL （0.15 g）。
5. 将甲基纤维素轻轻加入 15 mL 热水中，使其不会结块。在此过程中，甲基纤维素溶液将是浑浊的。
6. 溶解后，从热板上取出烧杯，将 15 mL 冷冻水加入热烧杯中。
7. 放入4°C冰箱直至溶液澄清，约15-20分钟。
8. 澄清后，每 5 mL 0.5% 甲基纤维素溶液中称取 3 mg 异硫氰酸罗丹明 （RITC）-葡聚糖，混合混合。这是 代表性结果 部分中的液体状态。
   1. 或者，称取25mg荧光聚乙烯微球，并与200μL甲基纤维素溶液混合直至充分掺入。在管饲前通过涡旋确保微球的彻底掺入。实验者 必须 可视化混合物中悬浮微球的均匀分布。
   2. 由于 RITC-葡聚糖溶液对光敏感，因此请冷藏溶液。提前准备RITC-葡聚糖溶液和微什佩尔混合物，并在2个月内使用。使用前重悬微球混合物。
      注意:不同大小的微球用于研究不同材料的胃肠道处理。在 代表性结果 部分，我们展示了使用小（直径:75-90μm）和较大（直径:180-212μm）微球的结果。

2.腔内内容物管饲法

1. 通过将 18 Ga x 50 mm 进料管连接到 1 mL 注射器并吸取 200 μL RITC 溶液或微球溶液来制备管饲法。
2. 使用单手约束技术手动约束禁食的动物²⁵.请参阅该机构关于正确小鼠约束技术的信息。
3. 轻轻地将喂食管插入小鼠的口腔和食道，直到它进入胃。
   注意:管饲步骤对于成功的实验至关重要。它需要经验丰富的双手，能够始终如一地将管子插入每个鼠标大致相同的距离。此步骤需要由执行协议的实验人员进行标准化。同一个实验者应该给所有将相互比较的小鼠队列进行管饲。
4. 慢慢将注射器内容物排出胃中，并小心地从鼠标上取出管子。
5. 管饲后，将鼠标放回笼子。
6. 处理管饲管。
7. 根据需要对所需数量的动物重复该过程。

3.肠道清扫术

1. 在开始解剖之前，打开 体内 成像仪器以使其达到温度。
2. 管饲后30分钟处死小鼠。使用吸入二氧化碳处死小鼠，然后颈椎脱位以确保安乐死成功。
3. 确认成功安乐死后，将鼠标仰卧放在解剖台上，并将其四个附属物固定在载物台上以进入腹部。用70%乙醇润湿腹部表面以润湿腹毛。
4. 使用显微解剖钳拉扯皮肤并获得锋利的手术剪刀，在肛门上方1厘米处做一个横向切口。要暴露腹膜腔，请继续垂直向上腹部切口，直到肋骨。
5. 用微夹钳轻轻地将盲肠向左移动，露出结肠远端。
6. 用直肠近端的微解剖剪刀切开远端结肠。
7. 向相反方向缓慢拉动，轻轻解开结肠、盲肠和小肠。
   注意:将解剖的肠保持在连续的节段中将为研究者创造最大的便利。沿段撕裂将导致后续步骤更加困难。
8. 使用显微解剖剪刀剪开胃的近端。
9. 使用镊子将解剖的肠转移到测量表上（图1）。将胃放在0毫米处，并沿着尺子排列肠子直到200毫米。使用微解剖剪刀切割 200 毫米。重复这个过程，沿着标尺将肠道从0毫米对齐到200毫米，同时确信肠道的方向不会混淆。
   1. 小心避免在对齐尺子时拉伸肠道。
10. 一旦组织排列在尺子上，排列盲肠使其与组织平行但不直接接触（如果在该区域内发现任何荧光，则需要盲肠和肠道之间的明显差异）。
11. 将带有解剖组织的测量片放在黑暗区域，以便可以保留荧光，直到成像为止。

4. 离体成像

1. 打开 体内 成像软件并登录。
2. 初始化成像仪器，使其准备好进行图像采集。
3. 将"激发"和"发射"字段设置为用于磁珠或RITC管饲法的相应颜色。红色（液体）:激发 535 nm/发射 600 nm。绿色（微球）:激发465纳米/发射520纳米。
4. 将曝光设置为"自动"。
5. 选择视野。
6. 在将测量表放入仪器之前，请确保肠道在运输过程中没有移动。
7. 将测量表放入视野内的仪器中。
8. 牢固地关闭仪器的门，然后选择 快照 以拍摄视野。
9. 将收集的照片保存到闪存驱动器进行分析。保存荧光和照片图像的单独捕获。照片和荧光的叠加表示荧光物质在胃肠道中的位置（图1）。
   注意:我们建议将文件保存为标记图像文件 （.tif） 格式以供下游处理。

5. 分析

1. 在图片编辑软件中打开荧光和照片图像文件。
2. 调整两个图像的像素大小，使它们具有完全相同的尺寸（我们的惯例是将两个图像设置为 1280 x 850 像素 [高 x 宽]）。
3. 关闭照片文件。以下步骤仅涉及荧光图像。
4. 使用橡皮擦工具去除背景并使其透明。可能需要橡皮擦来去除剩余背景的补丁。
5. 创建新图层。使其成为荧光信号的全黑背景。这可以通过选择黑色填充到图层并将图层拖动到带有荧光图像的图层下方来实现。
6. 将新的荧光图像（仅包含黑色背景上的荧光信号）另存为新的.tif文件。
7. 在 ImageJ 中打开新的荧光灯和照片图像。
8. 通过选择"图像 >类型"> 32 位，将每个图像转换为 32 位图像。
9. 通过选择"图像 >颜色">"合并通道"来创建两者的合并图像。在打开的对话框中，选择灰色通道的照片文件和任何彩色通道下的荧光文件。
10. 通过选择 "分析>设置比例">单击以删除比例来关闭合并图像的比例。
11. 在 ImageJ 中选择"矩形"工具。
12. 在小肠的一部分周围画一个矩形。密切注意此感兴趣区域 （ROI） 的宽度，因为它应在所有 ROI 之间保持不变。标称值不是必需的，只是在此图像上绘制的所有ROI中保持一致[由于小肠占据几行，因此将在不同行的小肠的每个部分上绘制单独的ROI（图1）]。 图 2 显示了宽度值在 ImageJ 工具栏中的位置。
13. 通过选择图像 >复制来复制投资回报率。仅选择与彩色通道对应的通道。
14. 再次使用矩形工具在整个新图像上绘制 ROI。
15. 通过选择 分析>图轮廓来检索荧光的轮廓。生成的图形在 y 轴上绘制沿 ROI 长度的每个像素的平均强度。在步骤5.12中选择这是分析的小肠切片的长度
16. 打开值列表并将其复制到电子表格软件。
17. 对不同标尺行上的小肠的每个部分重复步骤5.12-5.16。继续将值粘贴到同一电子表格文件中的每组前一组值的正下方，以便该列中的所有连续行都包含整个小肠长度的平均强度值。
18. 在电子表格软件中，将每个平均强度值乘以在步骤5.12中创建的ROI矩形的恒定宽度。这将在每个点产生沿小肠的实际强度值。
    注意:不同的动物在小肠长度上会略有不同。为了防止长度差异影响下游数据分析的结果，需要将强度值串分箱到所有实验样品中一致数量的箱中（图3、图4和图5显示了三种箱大小的结果）。
19. 将强度值的数量除以所需的箱数。生成的商 S 确定每个箱中包含的强度值的数量。
20. 使用综述公式确定每个原始强度值将去向的箱。此步骤将每个原始强度值放入箱中。每个原始强度值都按时间顺序使用整数 N 进行索引。商 N/S 确定分配给每个原始值的箱数。舍入公式应将此商四舍五入为没有小数的整数。
21. 使用 averageif 公式生成每个条柱的值。目标是平均步骤 5.20 中分配给特定箱的原始值。因此，公式中的参数应该是:（1） 在步骤 5.20 中生成的分配箱，（2） 箱数，（3） 原始强度值。
    注意:我们可以对分箱数据执行的第一个分析是几何中心分析，它量化了我们沿小肠观察到的最高荧光强度的程度（图4）。
22. 在总荧光强度上归一化每个强度值。换句话说，将每个强度值除以所有强度的总和。
23. 将每个规范化值乘以箱数。该产品反映了每个箱的相对重量，有助于总荧光强度。
24. 将步骤5.23中生成的所有值相加，得到荧光信号中心的箱数。除以箱数，将几何中心表示为荧光中心行进的小肠分数。
    注意:为了反映信号的空间分布，下一步是生成分档强度数据集的功率谱（图5）。
25. 在电子表格软件中打开快速傅立叶变换 （FFT） 向导。选择输入作为分箱数据集，选择输出作为与箱相同行数的空集。
26. 提取FFT的实际值分量。
27. 将FFT的每个实际值提高到二次方。这会产生功率谱数据集。
28. 选择功率谱数据集的前半部分并将其移动，使其位于后半部分下方。这具有在下一步绘制功率谱时将功率谱围绕中心频率中心的效果。
29. 在 x-y 图的 y 轴上绘制功率谱，其中 x 轴值是从 -1 x（箱数/2）到（箱数/2）-1 的范围。对于 1000 个箱，轴值的范围为 -500 到 499。
30. 应根据非零峰的扩散和这些非零峰的高度来比较每种动物的功率谱。

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结果

我们显示了从步骤3开始的代表性结果。 图1 显示了完整的外植肠道，荧光测量值叠加。胃（紫色）与小肠（橙色）沿同一轴放置，但我们更喜欢将盲肠（蓝色）移到一侧，以防止与大肠（橙色）重叠。如左图所示，由于器官大小的原因，这并不总是可能的。我们在~200毫米处切开小肠以最大限度地覆盖连续节段，但这并不总是可能的，因为肠系膜限制了展开肠道的能力，以?...

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讨论

胃肠道与其他管状器官（如血管）一样，需要机械传感器和效应器来维持稳态²⁶，^27，28。然而，胃肠道的独特之处在于，穿过它的材料的物理性质在膳食中不是恒定的。各种物理性质（固体、液体和气体）的腔内内容物通过肠道，对胃肠道机械感受器产生不同的机械输入。事实上，结肠中的不同机械刺激通过不同的途径感知和...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	664	other mice can be used with this protocol
Dissection tools	n/a	n/a
Excel software	Microsoft	n/a	used for spreadsheet analysis
Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 75-90um - 10g	Cospheric	UVPMS-BG-1.00 75-90um - 10g	"smaller beads" in the manuscript
Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 180-212um - 10g	Cospheric	UVPMS-BG-1.00 180-212um - 10g	"larger beads" in the manuscript
Gavage needles	Instech	FTP-18-50-50
ImageJ software	n/a	n/a	used to extract fluorescence profile
Laminated ruler paper (prepared in-house)	n/a	n/a
Methyl cellulose (viscosity: 400 cP)	Sigma	M0262
Photoshop software	Adobe	n/a	used for image processing
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran	Sigma	r8881-100mg	"liquid" condition in the manuscript
Xenogen IVIS 200	Perkin Elmer	124262	In vivo imaging system