Étude de la mécanodétection de l’intestin grêle murin des particules luminales

Résumé

Pour étudier comment l’intestin grêle traite les particules de différentes tailles, nous avons modifié une méthode in vivo établie pour déterminer le transit de l’intestin grêle.

Résumé

La motilité gastro-intestinale (GI) est essentielle à une digestion et une absorption normales. Dans l’intestin grêle, qui absorbe les nutriments, la motilité optimise la digestion et l’absorption. Pour cette raison, certains des modèles de motilité dans l’intestin grêle comprennent la segmentation pour le mélange du contenu luminal et le péristaltisme pour leur propulsion. Les propriétés physiques du contenu luminal modulent les modèles de motilité de l’intestin grêle. La stimulation mécanique des circuits mécanosensoriels gastro-intestinaux par le transit du contenu luminal et la motilité intestinale sous-jacente initie et module des schémas moteurs gastro-intestinaux complexes. Pourtant, les mécanismes mécanosensoriels qui conduisent ce processus restent mal compris. Cela est principalement dû à un manque d’outils pour disséquer la façon dont l’intestin grêle manipule des matériaux de différentes propriétés physiques. Pour étudier comment l’intestin grêle traite les particules de différentes tailles, nous avons modifié une méthode in vivo établie pour déterminer le transit de l’intestin grêle. Nous gavage des souris vivantes avec un liquide fluorescent ou de minuscules billes fluorescentes. Après 30 minutes, nous disséquons les intestins pour imager la distribution du contenu fluorescent sur l’ensemble du tractus gastro-intestinal. En plus des mesures à haute résolution du centre géométrique, nous utilisons le regroupement de taille variable et l’analyse spectrale pour déterminer comment différents matériaux affectent le transit de l’intestin grêle. Nous avons exploré comment un mécanisme de « toucher intestinal » récemment découvert affecte la motilité de l’intestin grêle en utilisant cette approche.

Introduction

Le tractus gastro-intestinal (GI) humain est un système organique de plusieurs pieds de long, approximatif comme un tube de dimensions et de propriétés physiques^{variables 1}. Au fur et à mesure que le contenu se déplace sur toute sa longueur, la fonction principale du tractus gastro-intestinal est d’absorber les substances essentielles à la vie. L’intestin grêle est spécifiquement responsable de l’absorption des nutriments. Le transit de l’intestin grêle est étroitement régulé pour correspondre aux fonctions de digestion et d’absorption, ce qui entraîne divers modèles de motilité. Bayliss et Starling ont décrit la « loi de l’intestin »² en 1899, montrant le programme de propulsion contractile dans l’intestin connu aujourd’hui sous le nom de réflexe péristaltique; Le segment proximal au bol alimentaire se contracte pour le propulser vers l’avant, et le segment distal se détend pour le recevoir. En théorie, ce modèle seul pourrait suffire à transporter le matériau par voie aborale, mais plus d’un siècle de recherche a brossé un tableau plus complexe de l’activité contractile dans le tractus gastro-intestinal. Trois périodes de motilité de l’intestin grêle sont reconnues chez l’homme : le complexe moteur migrant (MMC), la période de jeûne et la période postprandiale³. Les mêmes tendances ont été rapportées chez les souris ^4,5. La MMC est un moteur cyclique conservé chez la plupart des mammifères ^6,7. La MMC a un schéma caractéristique en quatre phases qui sert de marqueur clinique utile dans les troubles gastro-intestinaux fonctionnels⁷. Les quatre phases, par ordre d’occurrence, sont (I) la quiescence, (II) les contractions irrégulières de faible amplitude, (III) les contractions régulières de haute amplitude, et (IV) la période de ralentissement de l’activité^{déclinante 7}. Le MMC marque le schéma moteur majeur de la période de jeûne³. Les MMC de la période de jeûne éclaircissent le contenu de l’intestin grêle en préparation du prochain repas.

Les schémas moteurs de la période postprandiale sont optimisés pour les fonctions digestives et absorbantes³. Quelle que soit la composition calorique, le transit initial est rapide le long de l’intestin grêle, le contenu est réparti le long de l’intestin et le transit ralentit ensuite⁸. L’absorption est optimisée en augmentant la surface de contact et en la ralentissant pour augmenter le temps de séjour. Une fois que les nutriments sont à l’intérieur de la lumière, le schéma dominant consiste en des contractions étroites (<2 cm espacées) non coordonnées (contractions de segmentation), avec quelques contractions superposées de grande amplitude couvrant toute la longueur de l’intestin grêle (contractions péristaltiques)⁹. Les contractions de segmentation mélangent les contenus intraluminaux en place. Les grandes contractions péristaltiques occasionnelles propulsent le contenu vers le côlon.

Le moment de cette transition vers les CMM dépend du volume alimentaire et de la composition calorique¹⁰. Ainsi, l’intestin grêle échantillonne des indices luminaux pour réguler le moment de la transition entre les périodes de motilité. Des indices mécaniques, tels que les propriétés physiques du contenu luminal¹¹, le volume luminal et la tension de la paroi, engagent les cellules mécanoréceptrices dans la paroi gastro-intestinale 12,13,14,15,16. En effet, l’augmentation de la composante solide d’un repas entraîne une augmentation du transit intestinal grêle¹⁷. Nous supposons que les propriétés physiques, telles que l’état liquide ou solide du contenu intraluminal, doivent engager différents mécanorécepteurs en raison des diverses forces qu’ils génèrent sur la paroi gastro-intestinale¹⁸.

L’étalon-or pour mesurer le transit gastro-intestinal in vivo chez l’homme, comme chez la souris, est l’utilisation de traceurs radioactifs mesurés par scintigraphie lorsqu’ils sortent de l’estomac ou transitent le long du côlon^19,20. Chez les mammifères, l’intestin grêle boucle de manière imprévisible, ce qui rend l’intestin grêle difficile à imager in vivo de manière fiable, mais des progrès sont réalisés²¹. De plus, il y a actuellement un manque d’outils pour quantifier la façon dont l’intestin grêle traite les particules de propriétés et de tailles variables. Le point de départ ici était une technique de référence qui standardise l’étude du transit de l’intestin grêle 22,23,24 et de la fonction barrière ²². Il consiste à gaver des souris avec un matériau fluorescent, à attendre que la motilité gastro-intestinale transporte le matériau, à exciser le tractus gastro-intestinal, à le segmenter en plusieurs sections de l’estomac au côlon, à sectionner et à homogénéiser le contenu intraluminal pour la quantification de la fluorescence. Nous avons apporté deux améliorations. Tout d’abord, nous avons modifié la composition du contenu gavé pour inclure des billes microscopiques fluorescentes afin de déterminer comment l’intestin grêle distribue les particules physiques. Deuxièmement, nous avons amélioré la résolution spatiale en imageant l’ensemble du tractus gastro-intestinal de l’estomac au côlon ex vivo et en utilisant un regroupement de taille variable pour normaliser notre analyse chez les animaux. Nous postulons que cela révèle de nouvelles perspectives sur l’équilibre des contractions propulsives et segmentées pendant la phase postprandiale.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de la Mayo Clinic.

1. Configuration

1. Souris rapides de 8 à 10 semaines pendant 4 h. Fournir aux souris un accès à l’eau.
   REMARQUE: Nous utilisons des souris mâles C57BL / 6J de type sauvage pour toutes les expériences présentées ici, mais elles peuvent être effectuées sur des souris de n’importe quelle souche, sexe et génotype.
2. Refroidir 15 ml d’eau distillée dans un tube conique de 50 ml dans un réfrigérateur à 4 °C.
3. Chauffer 15 mL supplémentaires d’eau distillée dans un bécher à l’aide d’une plaque chauffante munie d’une barre d’agitation magnétique à environ 80-90 °C.
4. Mesurer 0,5 % de méthylcellulose pour un total de 30 mL (0,15 g).
5. Ajouter délicatement la méthylcellulose à 15 mL d’eau chaude pour qu’elle ne s’agglutine pas. La solution de méthylcellulose sera trouble au cours de ce processus.
6. Une fois dissous, retirez le bécher de la plaque chauffante et ajoutez les 15 ml d’eau glacée dans le bécher chaud.
7. Placer dans un réfrigérateur à 4 °C jusqu’à ce que la solution soit claire, environ 15-20 min.
8. Lorsqu’il est clair, peser 3 mg d’isothiocyanate de rhodamine (RITC)-dextrane par 5 mL de solution de méthylcellulose à 0,5 % et mélanger pour combiner. Il s’agit de l’état liquide dans la section Résultats représentatifs .
   1. Sinon, peser 25 mg de microsphères fluorescentes en polyéthylène et mélanger avec 200 μL de la solution de méthylcellulose jusqu’à ce qu’elle soit bien incorporée. L’incorporation complète des microsphères est assurée par vortex avant le gavage. L’expérimentateur doit visualiser la distribution homogène des microsphères en suspension dans le mélange.
   2. Comme la solution de DRÉTANE RITC est sensible à la lumière, réfrigérez la solution. Préparer la solution RITC-dextran et le mélange microshpere à l’avance et utiliser dans les 2 mois. Remettez en suspension le mélange de microsphères avant utilisation.
      NOTE: Des microsphères de différentes tailles sont utilisées pour étudier la manipulation gastro-intestinale de différents matériaux. Dans la section Résultats représentatifs , nous démontrons les résultats de l’utilisation de microsphères de petite taille (diamètre : 75-90 μm) et de plus grande (diamètre : 180-212 μm).

2. Gavage de contenu intraluminal

1. Préparer le gavage en fixant une sonde d’alimentation de 18 Ga x 50 mm à une seringue de 1 mL et en prélevant 200 μL de solution de RITC ou de solution de microsphère.
2. Retenir manuellement l’animal à jeun à l’aide de la technique de contention à une main²⁵. Consultez les renseignements de l’établissement sur les techniques appropriées de contention murine.
3. Insérez doucement la sonde d’alimentation dans la bouche et l’œsophage de la souris jusqu’à ce qu’elle pénètre dans l’estomac.
   REMARQUE: L’étape du gavage est essentielle à la réussite de l’expérience. Il nécessite des mains expérimentées qui peuvent constamment insérer le tube à peu près à la même distance dans chaque souris. Cette étape doit être normalisée par les expérimentateurs qui mettent en œuvre le protocole. Le même expérimentateur devrait gavage de toutes les cohortes de souris qui seront comparées les unes aux autres.
4. Expulsez lentement le contenu de la seringue dans l’estomac et retirez délicatement le tube de la souris.
5. Après le gavage, remettez la souris dans la cage.
6. Jetez le tube de gavage.
7. Répétez le processus au besoin pour le nombre d’animaux souhaité.

3. Dissection intestinale

1. Avant de commencer les dissections, allumez l’instrument d’imagerie in vivo pour lui permettre d’atteindre la température.
2. Sacrifiez la souris 30 min après le gavage. Utilisez l’inhalation de dioxyde de carbone pour sacrifier la souris, suivie d’une luxation cervicale pour assurer une euthanasie réussie.
3. Après avoir confirmé la réussite de l’euthanasie, placez la souris en décubitus dorsal sur une étape de dissection et épinglez ses quatre appendices sur la scène pour avoir accès à l’abdomen. Mouillez la surface de l’abdomen avec de l’éthanol à 70% pour mouiller les poils abdominaux.
4. Utilisez des pinces à microdissection #1 pour tirer la peau et acquérir des ciseaux chirurgicaux tranchants pour faire une incision transversale à 1 cm au-dessus de l’anus. Pour exposer la cavité intrapéritonéale, continuez l’incision verticalement jusqu’à la cage thoracique.
5. Déplacez doucement le caecum vers la gauche avec la pince à micro-dissection pour exposer le côlon distal.
6. Coupez le côlon distal avec des ciseaux de micro-dissection juste à proximité du rectum.
7. Démêlez doucement le côlon, le caecum et l’intestin grêle en tirant lentement dans la direction opposée.
   REMARQUE: Le maintien des intestins disséqués dans un segment continu créera le plus de facilité pour l’investigateur. Les déchirures et les déchirures le long du segment rendront les étapes suivantes plus difficiles.
8. Utilisez des ciseaux de micro-dissection pour couper la proximale à l’estomac.
9. Utilisez une pince pour transférer les intestins disséqués sur la feuille de mesure (Figure 1). Placez l’estomac à 0 mm et disposez les intestins le long de la règle jusqu’à 200 mm. Utilisez des ciseaux à microdissection pour couper à 200 mm. Répétez ce processus d’alignement des intestins de 0 mm à 200 mm le long des règles tout en restant confiant que l’orientation des intestins ne se confond pas.
   1. Veillez à éviter d’étirer les intestins tout en vous alignant sur les règles.
10. Une fois que le tissu est disposé sur la règle, disposez le caecum de manière à ce qu’il soit parallèle au tissu mais pas en contact direct avec lui (si une fluorescence est trouvée dans cette région, une distinction claire entre le caecum et les intestins sera nécessaire).
11. Placez la feuille de mesure avec le tissu disséqué dans une zone sombre afin que la fluorescence puisse être préservée jusqu’à ce qu’il soit temps d’imager.

4. Imagerie ex vivo

1. Ouvrez le logiciel d’imagerie in vivo et connectez-vous.
2. Initialisez l’instrument d’imagerie afin qu’il soit prêt pour l’acquisition d’images.
3. Définissez les champs 'Excitation' et 'Émission' sur la couleur correspondante utilisée pour le gavage perle ou RITT. Rouge (liquide) : excitation 535 nm /émission 600 nm. Vert (microsphères) : excitation 465 nm /émission 520 nm.
4. Réglez l’exposition sur 'Auto'.
5. Sélectionnez le champ de vision.
6. Avant de placer la feuille de mesure dans l’instrument, assurez-vous que les intestins ne se sont pas déplacés pendant le transport.
7. Placez la feuille de mesure dans l’instrument dans le champ de vision.
8. Fermez solidement la porte de l’instrument et sélectionnez Instantané pour photographier le champ de vision.
9. Enregistrez les images collectées sur un lecteur flash pour analyse. Enregistrez les captures individuelles des images fluorescentes et photographiques. Une superposition de la photographie et de la fluorescence indique l’emplacement du matériau fluorescent dans le tractus gastro-intestinal (figure 1).
   REMARQUE : nous vous recommandons d’enregistrer les fichiers au format Tag Image File (.tif) pour le traitement en aval.

5. Analyse

1. Ouvrez les fichiers d’images fluorescentes et photographiques dans un logiciel de retouche d’image.
2. Ajustez la taille en pixels des deux images de sorte qu’elles aient exactement les mêmes dimensions (notre convention était de définir les deux images sur 1280 pixels par 850 pixels [hauteur x largeur]).
3. Fermez le fichier de photographie. Les étapes suivantes impliquent uniquement l’image fluorescente.
4. Utilisez un outil de gomme pour supprimer l’arrière-plan et le rendre transparent. Une gomme peut être nécessaire pour supprimer les patchs de l’arrière-plan restant.
5. Créez un calque. Faites-en un fond entièrement noir au signal fluorescent. Cela peut être réalisé en choisissant un remplissage noir sur le calque et en faisant glisser le calque pour qu’il se trouve sous le calque avec l’image fluorescente.
6. Enregistrez la nouvelle image fluorescente, contenant uniquement le signal fluorescent sur fond noir, en tant que nouveau fichier .tif.
7. Ouvrez les nouvelles images fluorescentes et photographiques dans ImageJ.
8. Transformez chaque image en image 32 bits en choisissant Image > Type > 32 bits.
9. Créez une image fusionnée des deux en choisissant Image > Couleur > Fusionner les canaux. Dans la boîte de dialogue qui s’ouvre, sélectionnez le fichier photo pour la couche grise et le fichier fluorescent sous les couches colorées.
10. Désactivez l’échelle de l’image fusionnée en sélectionnant Analyser > Définir l’échelle > Cliquez pour supprimer l’échelle.
11. Sélectionnez l’outil « Rectangle » dans ImageJ.
12. Dessinez un rectangle autour d’une section de l’intestin grêle. Portez une attention particulière à la largeur de cette région d’intérêt (ROI), car elle doit rester constante entre tous les ROI. La valeur nominale n’est pas essentielle, mais elle est maintenue cohérente pour tous les ROI dessinés sur cette image [puisque l’intestin grêle occupe plusieurs rangées, les ROI individuels seront dessinés sur chaque section de l’intestin grêle dans une rangée différente (Figure 1)]. La figure 2 montre l’emplacement de la valeur de largeur dans la barre d’outils ImageJ.
13. Dupliquez le retour sur investissement en sélectionnant Image > Dupliquer. Sélectionnez uniquement le canal correspondant au canal coloré.
14. Utilisez à nouveau l’outil rectangle pour dessiner un retour sur investissement sur l’ensemble de la nouvelle image.
15. Récupérez un profil de fluorescence en sélectionnant Analyser > Profil de tracé. Le graphique résultant trace sur l’axe des y l’intensité moyenne pour chaque pixel le long de la longueur du retour sur investissement. Cette mesure a été choisie à l’étape 5.12 comme étant la longueur de la section analysée de l’intestin grêle.
16. Ouvrez la liste des valeurs et copiez-les dans un tableur.
17. Répétez les étapes 5.12 à 5.16 pour chaque section de l’intestin grêle sur une rangée de règle différente. Continuez à coller les valeurs sur le même fichier de feuille de calcul immédiatement sous chaque ensemble de valeurs précédent, de sorte que toutes les lignes continues de cette colonne contiennent la valeur d’intensité moyenne pour toute la longueur de l’intestin grêle.
18. Dans le tableur, multipliez chaque valeur d’intensité moyenne par la largeur constante du rectangle ROI créé à l’étape 5.12. Cela donnera la valeur d’intensité réelle le long de l’intestin grêle à chaque point.
    REMARQUE: Différents animaux auront de légères variations sur la longueur de l’intestin grêle. Pour éviter que les différences de longueur n’affectent les résultats de l’analyse des données en aval, la chaîne de valeurs d’intensité doit être regroupée dans un nombre constant de cellules dans tous les échantillons expérimentaux (la figure 3, la figure 4 et la figure 5 présentent les résultats pour trois tailles de cellules).
19. Divisez le nombre de valeurs d’intensité par le nombre de bacs souhaités. Le quotient S résultant détermine le nombre de valeurs d’intensité incluses dans chaque bac.
20. Déterminez le bac où chaque valeur d’intensité brute ira à l’aide d’une formule d’arrondi. Cette étape place chaque valeur d’intensité brute dans un bac. Chaque valeur d’intensité brute est indexée chronologiquement avec l’entier N. Le quotient N/S détermine le numéro de bac attribué à chaque valeur brute. La formule d’arrondi doit arrondir ce quotient à un nombre entier sans décimales.
21. Générez la valeur de chaque bac à l’aide d’une formule averageif. L’objectif est de faire la moyenne des valeurs brutes attribuées à un bac spécifique à l’étape 5.20. Par conséquent, les arguments de la formule doivent être : (1) les bacs assignés générés à l’étape 5.20, (2) le numéro de bac, (3) les valeurs d’intensité brutes.
    REMARQUE: La première analyse que nous pouvons effectuer sur les données regroupées est une analyse géométrique du centre, qui quantifie à quelle distance nous observons l’intensité fluorescente la plus élevée le long de l’intestin grêle (Figure 4).
22. Normaliser chaque valeur d’intensité sur l’intensité fluorescente totale. En d’autres termes, divisez chaque valeur d’intensité par la somme de toutes les intensités.
23. Multipliez chaque valeur normalisée par le numéro de la corbeille. Le produit reflète le poids relatif de chaque cellule, ce qui contribue à l’intensité fluorescente totale.
24. L’addition de toutes les valeurs générées à l’étape 5.23 donne le numéro de bac au centre du signal fluorescent. Divisez par le nombre de bacs pour exprimer le centre géométrique comme la fraction de l’intestin grêle parcourue par le centre fluorescent.
    REMARQUE : Pour refléter la distribution spatiale du signal, l’étape suivante consiste à générer le spectre de puissance de l’ensemble de données d’intensité groupées (Figure 5).
25. Ouvrez un assistant de transformation de Fourier rapide (FFT) dans le tableur. Sélectionnez l’entrée comme jeu de données groupé et la sortie comme un ensemble vide du même nombre de lignes que les bacs.
26. Extraire la composante valeur réelle de la FFT.
27. Élever chaque valeur réelle de la FFT à la deuxième puissance. Cela donne un ensemble de données de spectres de puissance.
28. Sélectionnez la première moitié de l’ensemble de données des spectres de puissance et déplacez-la de manière à ce qu’elle se trouve en dessous de la seconde moitié. Cela a pour effet de centrer les spectres de puissance autour de la fréquence centrale lorsqu’elle est tracée à l’étape suivante.
29. Tracez les spectres de puissance sur l’axe des y d’un graphique x-y où les valeurs de l’axe des x sont comprises entre -1 x (nombre de bacs/2) et (nombre de compartiments/2) -1. Dans le cas de 1000 bacs, les valeurs des axes seraient comprises entre -500 et 499.
30. Les spectres de puissance pour chaque animal doivent être comparés sur la base de l’étendue des pics non nuls et des hauteurs de ces pics non nuls.

Résultats

Nous montrons des résultats représentatifs à partir de l’étape 3. La figure 1 montre les intestins explantés intacts, avec des mesures fluorescentes superposées. L’estomac (violet) est posé le long du même axe que l’intestin grêle (orange), mais nous préférons déplacer le caecum (bleu) sur le côté pour éviter le chevauchement avec le gros intestin (orange). Comme en témoigne le panneau de gauche, cela n’est pas toujours possible en raison de la taille de l’organe. N...

Discussion

Le tractus gastro-intestinal, comme d’autres organes tubulaires, tels que les vaisseaux sanguins, nécessite des capteurs et des effecteurs mécaniques pour maintenir l’homéostasie^26,27,28. Cependant, le tractus gastro-intestinal est unique en ce sens que les propriétés physiques des matériaux qui le traversent ne sont pas constantes d’un repas à l’autre. Les contenus intraluminaux de diverses propriétés physiques...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	664	other mice can be used with this protocol
Dissection tools	n/a	n/a
Excel software	Microsoft	n/a	used for spreadsheet analysis
Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 75-90um - 10g	Cospheric	UVPMS-BG-1.00 75-90um - 10g	"smaller beads" in the manuscript
Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 180-212um - 10g	Cospheric	UVPMS-BG-1.00 180-212um - 10g	"larger beads" in the manuscript
Gavage needles	Instech	FTP-18-50-50
ImageJ software	n/a	n/a	used to extract fluorescence profile
Laminated ruler paper (prepared in-house)	n/a	n/a
Methyl cellulose (viscosity: 400 cP)	Sigma	M0262
Photoshop software	Adobe	n/a	used for image processing
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran	Sigma	r8881-100mg	"liquid" condition in the manuscript
Xenogen IVIS 200	Perkin Elmer	124262	In vivo imaging system