Изучение механозондирования просветных частиц мышей тонкой кишки

Резюме

Чтобы изучить, как тонкая кишка обрабатывает частицы различных размеров, мы модифицировали установленный метод in vivo для определения транзита тонкой кишки.

Аннотация

Моторика желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) имеет решающее значение для нормального пищеварения и всасывания. В тонкой кишке, которая усваивает питательные вещества, моторика оптимизирует пищеварение и всасывание. По этой причине некоторые из паттернов моторики в тонкой кишке включают сегментацию для смешивания просветного содержимого и перистальтику для их движения. Физические свойства просветного содержимого модулируют паттерны моторики тонкой кишки. Механическая стимуляция механосенсорных цепей ЖКТ путем транзита просветного содержимого и лежащей в основе подвижности кишечника инициирует и модулирует сложные двигательные паттерны ЖКТ. Тем не менее, механосенсорные механизмы, которые управляют этим процессом, остаются плохо изученными. В первую очередь это связано с отсутствием инструментов для вскрытия того, как тонкая кишка обрабатывает материалы различных физических свойств. Чтобы изучить, как тонкая кишка обрабатывает частицы различных размеров, мы модифицировали установленный метод in vivo для определения транзита тонкой кишки. Мы обоживаем живых мышей флуоресцентной жидкостью или крошечными флуоресцентными шариками. Через 30 минут мы рассекаем кишечник, чтобы изобразить распределение флуоресцентного содержимого по всему желудочно-кишечному тракту. В дополнение к измерениям геометрического центра с высоким разрешением мы используем биннинг переменного размера и спектральный анализ, чтобы определить, как различные материалы влияют на транзит тонкой кишки. Мы изучили, как недавно обнаруженный механизм «прикосновения к кишечнику» влияет на моторику тонкой кишки, используя этот подход.

Введение

Желудочно-кишечный тракт человека (ЖКТ) представляет собой систему органов длиной в несколько футов, примерно аппроксимированную как трубка различных размеров и физических свойств¹. По мере того, как содержимое движется по своей длине, основная функция желудочно-кишечного тракта заключается в поглощении веществ, критически важных для жизни. Тонкая кишка специально отвечает за всасывание питательных веществ. Транзит тонкой кишки жестко регулируется, чтобы соответствовать функциям пищеварения и всасывания, что приводит к различным моделям моторики. Бейлисс и Старлинг описали «закон кишечника»² в 1899 году, показав сократительную двигательную программу в кишечнике, известную сегодня как перистальтический рефлекс; сегмент, близкий к пищевому болюсу, сжимается, чтобы продвинуть его вперед, а дистальный сегмент расслабляется, чтобы получить его. Теоретически одной этой модели может быть достаточно для транспортировки материала аборально, но более века исследований нарисовали более сложную картину сократительной активности в желудочно-кишечном тракте. У человека выделяют три периода моторики тонкой кишки: мигрирующий двигательный комплекс (MMC), период голодания и постпрандиальный период³. Такие же закономерности были зарегистрированы у мышей ^4,5. MMC представляет собой циклическую моторную модель, сохраненную у большинства млекопитающих ^6,7. MMC имеет характерную четырехфазную картину, которая служит полезным клиническим маркером при функциональных расстройствах ЖКТ⁷. Четырьмя фазами, в порядке возникновения, являются (I) покое, (II) нерегулярные сокращения с низкой амплитудой, (III) регулярные сокращения с высокой амплитудой и (IV) период снижения активности⁷. MMC отмечает основную двигательную картину периода голодания³. ММК периода натощак очищают содержимое тонкой кишки при подготовке к следующему приему пищи.

Двигательные паттерны постпрандиального периода оптимизированы для пищеварительной и абсорбционной функций³. Независимо от калорийного состава, начальный транзит происходит быстро по тонкому кишечнику, содержимое распространяется по всей длине кишечника, а транзит впоследствии замедляется⁸. Абсорбция оптимизируется за счет увеличения площади контактной поверхности и ее замедления для увеличения времени пребывания. Как только питательные вещества находятся внутри просвета, доминирующий рисунок состоит из близких (<2 см друг от друга) нескоординированных сокращений (сегментирующих сокращений), с несколькими наложенными сокращениями с большой амплитудой, охватывающими всю длину тонкой кишки (перистальтические сокращения)⁹. Сегментирующие сокращения смешивают внутрипросветное содержимое на месте. Случайные большие перистальтические сокращения продвигают содержимое к толстой кишке.

Сроки этого перехода обратно к ММК зависят от объема пищи и калорийности¹⁰. Таким образом, тонкая кишка пробует просветные сигналы, чтобы регулировать, когда переходить между периодами моторики. Механические сигналы, такие как физические свойства просветного содержимого¹¹, объем просвета и напряжение стенки, задействуют механорецепторные клетки в стенке ЖКТ 12,13,14,15,16. Действительно, увеличение твердого компонента пищи приводит к увеличению транзита тонкой кишки¹⁷. Мы предполагаем, что физические свойства, такие как жидкое или твердое состояние внутрипросветного содержимого, должны задействовать различные механорецепторы из-за различных сил, которые они генерируют на стенке ЖКТ¹⁸.

Золотым стандартом для измерения транзита IN vivo GI у людей, как и у мышей, является использование радиоактивных индикаторов, измеренных сцинтиграфией, когда они выходят из желудка или проходят по толстой кишке^19,20. У млекопитающих тонкая кишка петляет непредсказуемым образом, что затрудняет надежное изображение тонкой кишки in vivo, но прогресс достигается²¹. Кроме того, в настоящее время не хватает инструментов для количественной оценки того, как тонкая кишка обрабатывает частицы различных свойств и размеров. Отправной точкой здесь был метод золотого стандарта, который стандартизирует изучение транзита тонкой кишки ^22,23,24 и барьерной функции²². Он состоит из обжига мышей флуоресцентным материалом, ожидающих подвижности ЖКТ для транспортировки материала, иссечения желудочно-кишечного тракта, сегментации его на несколько секций от желудка до толстой кишки, секционирования и гомогенизации внутрипросветного содержимого для количественной оценки флуоресценции. Мы сделали два улучшения. Во-первых, мы изменили состав гаваированного содержимого, включив флуоресцентные микроскопические шарики, чтобы определить, как тонкая кишка распределяет физические частицы. Во-вторых, мы улучшили пространственное разрешение, визуализируя весь желудочно-кишечный тракт от желудка до толстой кишки ex vivo и использовали биннинг переменного размера для стандартизации нашего анализа на животных. Мы постулируем, что это раскрывает новое понимание баланса пропульсивных и сегментирующих сокращений во время постпрандиальной фазы.

протокол

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) клиники Майо.

1. Настройка

1. Быстрые 8-10-недельные мыши в течение 4 ч. Обеспечьте мышам доступ к воде.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для всех экспериментов, представленных здесь, мы используем самцов мышей C57BL/6J дикого типа, но они могут быть выполнены на мышах любого штамма, пола и генотипа.
2. Охладите 15 мл дистиллированной воды в конической трубке объемом 50 мл в холодильнике с температурой 4 °C.
3. Нагрейте еще 15 мл дистиллированной воды в стакане с помощью конфорки с магнитным перемешивателем примерно до 80-90 °C.
4. Измерьте 0,5% метилцеллюлозы в общей сложности 30 мл (0,15 г).
5. Аккуратно добавьте метилцеллюлозу в 15 мл горячей воды, чтобы она не слипалась. Раствор метилцеллюлозы будет мутным во время этого процесса.
6. После растворения извлеките стакан из конфорки и добавьте 15 мл охлажденной воды в горячий стакан.
7. Поместите в холодильник с температурой 4 °C до тех пор, пока раствор не станет прозрачным, примерно 15-20 мин.
8. При очистке взвесьте 3 мг изотиоцианата родамина (RITC)-декстрана на 5 мл 0,5% раствора метилцеллюлозы и перемешайте для объединения. Это жидкое состояние в разделе Репрезентативные результаты .
   1. Альтернативно, взвесьте 25 мг флуоресцентных полиэтиленовых микросфер и смешайте с 200 мкл раствора метилцеллюлозы до тех пор, пока они не будут хорошо включены. Тщательное включение микросфер обеспечивается вихрем перед гаважем. Экспериментатор должен визуализировать однородное распределение взвешенных микросфер в смеси.
   2. Поскольку раствор RITC-декстран является светочувствительным, охладите раствор. Заранее приготовьте раствор RITC-декстрана и смесь микрошпере и используйте в течение 2 месяцев. Перед использованием повторно суспендируйте смесь микросферы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Микросферы различных размеров используются для изучения желудочно-кишечного тракта различных материалов. В разделе Репрезентативные результаты мы демонстрируем результаты использования малых (диаметр: 75-90 мкм) и больших (диаметр: 180-212 мкм) микросфер.

2. Внутрипросветное содержание

1. Подготовьте стекло, прикрепив питательную трубку размером 18 Ga x 50 мм к шприцу объемом 1 мл и вытянув 200 мкл раствора RITC или раствора микросферы.
2. Вручную удерживать постящееся животное с помощью техники удержания одной рукой²⁵. Обратитесь к информации учреждения о надлежащих методах сдерживания мышей.
3. Осторожно вставьте питательную трубку через рот и пищевод мыши, пока она не попадет в желудок.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг гаважа имеет решающее значение для успешного эксперимента. Для этого требуются опытные руки, которые могут последовательно вставлять трубку примерно на одинаковое расстояние в каждую мышь. Этот шаг должен быть стандартизирован экспериментаторами, выполняющими протокол. Один и тот же экспериментатор должен оценить все когорты мышей, которые будут сравниваться друг с другом.
4. Медленно выталкивайте содержимое шприца в желудок и осторожно извлекайте трубку из мыши.
5. После гаважа верните мышь в клетку.
6. Утилизируйте трубку.
7. Повторите процесс по мере необходимости для нужного количества животных.

3. Рассечение кишечника

1. Перед началом рассечения включите инструмент визуализации in vivo , чтобы он достиг температуры.
2. Принесите мышь в жертву через 30 минут после захода. Используйте вдыхание углекислого газа, чтобы принести в жертву мышь, с последующим вывихом шейки матки, чтобы обеспечить успешную эвтаназию.
3. После подтверждения успешной эвтаназии поместите мышь в положение лежа на спине на стадии рассечения и закрепите ее четыре придатка на сцене, чтобы иметь доступ к брюшной полости. Смочите поверхность живота 70% этанолом, чтобы смочить волоски живота.
4. Используйте микродиссекционные щипцы (No 5), чтобы потянуть кожу и приобрести острые хирургические ножницы, чтобы сделать поперечный разрез на 1 см выше ануса. Чтобы обнажить внутрибрюшинную полость, продолжайте разрез вертикально вверх по брюшной полости до грудной клетки.
5. Осторожно переместите слепую кишку влево с помощью микродискционных щипцов, чтобы обнажить дистальную толстую кишку.
6. Вырежьте дистальную кишку с помощью микродисперсных ножниц только проксимально к прямой кишке.
7. Осторожно распутайте толстую кишку, слепую кишку и тонкую кишку, медленно потянув в противоположном направлении.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поддержание рассеченного кишечника в одном непрерывном сегменте создаст наибольшую легкость для исследователя. Разрывы и разрывы вдоль сегмента приведут к тому, что последующие шаги будут более сложными.
8. Используйте микродиссекционные ножницы, чтобы разрезать проксимально к желудку.
9. Используйте щипцы для переноса рассеченного кишечника на измерительный лист (рисунок 1). Поместите желудок на 0 мм и расположите кишечник вдоль линейки до 200 мм. Используйте микродиссекционные ножницы для резки на 200 мм. Повторите этот процесс выравнивания кишечника от 0 мм до 200 мм вдоль линеек, оставаясь уверенным в том, что ориентация кишечника не запутается.
   1. Будьте осторожны, чтобы избежать растяжения кишечника при выравнивании к линейкам.
10. Как только ткань расположена на линейке, расположите слепую кишку так, чтобы она была параллельна ткани, но не находилась в прямом контакте с ней (если в этой области обнаружена какая-либо флуоресценция, то потребуется четкое различие между слепой кишкой и кишечником).
11. Поместите измерительный лист с рассеченной тканью в темную область, чтобы флуоресценция могла сохраняться до тех пор, пока не придет время для изображения.

4. Визуализация Ex vivo

1. Откройте программное обеспечение для создания образов in vivo и войдите в систему.
2. Инициализируйте инструмент обработки изображений, чтобы он был готов к получению изображения.
3. Установите поля «Возбуждение» и «Излучение» на соответствующий цвет, используемый для бусины или RITC gavage. Красный (жидкий): возбуждение 535 нм /излучение 600 нм. Зеленый (микросферы): возбуждение 465 нм /излучение 520 нм.
4. Установите экспозицию в положение «Авто».
5. Выберите поле зрения.
6. Перед помещением измерительного листа в прибор убедитесь, что кишечник не сместился во время транспортировки.
7. Поместите измерительный лист в прибор в поле зрения.
8. Надежно закройте дверцу прибора и выберите Снимок , чтобы сфотографировать поле зрения.
9. Сохраните собранные снимки на флешку для анализа. Сохраняйте индивидуальные снимки флуоресцентных и фотоизображений. Наложение фотографии и флуоресценция указывают на расположение флуоресцентного материала в желудочно-кишечном тракте (рисунок 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем сохранить файлы в формате Tag Image File (.tif) для последующей обработки.

5. Анализ

1. Откройте файлы флуоресцентных и фотоизображений в программном обеспечении для редактирования изображений.
2. Отрегулируйте размер пикселей обоих изображений таким образом, чтобы они имели одинаковые размеры (наше соглашение заключалось в том, чтобы установить для обоих изображений 1280 пикселей на 850 пикселей [высота х ширина]).
3. Закройте файл фотографии. Следующие шаги включают только флуоресцентное изображение.
4. Используйте инструмент ластика, чтобы удалить фон и сделать его прозрачным. Ластик может понадобиться для удаления пятен оставшегося фона.
5. Создайте новый слой. Сделайте его полностью черным фоном для флуоресцентного сигнала. Этого можно достичь, выбрав черную заливку слоя и перетащив слой, чтобы он лежал под слоем с флуоресцентным изображением.
6. Сохраните новое флуоресцентное изображение, содержащее только флуоресцентный сигнал на черном фоне, в качестве нового файла .tif.
7. Откройте новые флуоресцентные и фотоизображения в ImageJ.
8. Превратите каждое изображение в 32-разрядное, выбрав «Тип изображения > > 32-разрядный».
9. Создайте объединенное изображение обоих, выбрав «Цвет изображения > > «Объединить каналы». В открывшемся диалоговом окне выберите файл фотографии для серого канала и флуоресцентный файл под любыми цветными каналами.
10. Отключите масштаб объединенного изображения, выбрав Анализ > Задать масштаб > Щелкните, чтобы удалить масштаб.
11. Выберите инструмент «Прямоугольник» в ImageJ.
12. Нарисуйте прямоугольник вокруг участка тонкой кишки. Обратите пристальное внимание на ширину этой интересующей области (ROI), так как она должна оставаться постоянной между всеми ROI. Номинальное значение не является существенным, просто оно остается последовательным для всех ROI, нарисованных на этом изображении [поскольку тонкая кишка занимает несколько рядов, отдельные ROI будут нарисованы над каждым участком тонкой кишки в другом ряду (рисунок 1)]. На рисунке 2 показано расположение значения ширины на панели инструментов ImageJ.
13. Продублируйте рентабельность инвестиций, выбрав Изображение > Дублировать. Выберите только канал, соответствующий цветному каналу.
14. Снова используйте инструмент «Прямоугольник», чтобы нарисовать рентабельность инвестиций по всему новому изображению.
15. Извлеките профиль флуоресценции, выбрав Анализ > Профиль графика. Полученный график отображает на оси Y среднюю интенсивность для каждого пикселя по длине ROI. Это было выбрано на шаге 5.12 для длины анализируемого участка тонкой кишки.
16. Откройте список значений и скопируйте их в программное обеспечение для работы с электронными таблицами.
17. Повторите шаги 5.12-5.16 для каждого отдела тонкой кишки на отдельном ряду линейки. Продолжайте вставлять значения в один и тот же файл электронной таблицы непосредственно под каждым предыдущим набором значений, чтобы все непрерывные строки в этом столбце содержали среднее значение интенсивности для всей длины тонкой кишки.
18. В программном обеспечении для работы с электронными таблицами умножьте каждое среднее значение интенсивности на постоянную ширину прямоугольника ROI, созданного на шаге 5.12. Это даст реальное значение интенсивности вдоль тонкой кишки в каждой точке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разные животные будут иметь небольшие вариации по длине тонкой кишки. Чтобы различия в длине не влияли на результат последующего анализа данных, строка значений интенсивности должна быть объединена в согласованное число контейнеров во всех экспериментальных образцах (на рисунке 3, рисунке 4 и рисунке 5 отображаются результаты для трех размеров бункеров).
19. Разделите число значений интенсивности на желаемое количество контейнеров. Результирующее частное S определяет количество значений интенсивности, включенных в каждую корзину.
20. Определите корзину, в которую будет направляться каждое необработанное значение интенсивности, используя формулу округления. На этом шаге каждое необработанное значение интенсивности помещается в корзину. Каждое необработанное значение интенсивности в хронологическом порядке индексируется целым числом N. Коэффициент N/S определяет номер бункера, присвоенный каждому необработанному значению. Формула округления должна округлять это частное до целого числа без десятичных знаков.
21. Создайте значение для каждой корзины с помощью формулы усреднения. Цель состоит в том, чтобы усреднить необработанные значения, назначенные определенной корзине на шаге 5.20. Следовательно, аргументы в формуле должны быть следующими: (1) назначенные контейнеры, сгенерированные на шаге 5.20, (2) номер bin, (3) необработанные значения интенсивности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первый анализ, который мы можем выполнить на связанных данных, - это геометрический анализ центра, который количественно определяет, насколько мы наблюдаем самую высокую интенсивность флуоресцентной жидкости вдоль тонкой кишки (рисунок 4).
22. Нормализуйте каждое значение интенсивности по отношению к общей интенсивности флуоресцентности. Другими словами, разделите каждое значение интенсивности на сумму всех интенсивностей.
23. Умножьте каждое нормализованное значение на номер корзины. Продукт отражает относительный вес каждого бункера, способствуя общей интенсивности флуоресценции.
24. Сложение всех значений, сгенерированных на шаге 5.23, дает номер бункера в центре флуоресцентного сигнала. Разделите на количество бункеров, чтобы выразить геометрический центр как фракцию тонкой кишки, проходящей мимо флуоресцентного центра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для отражения пространственного распределения сигнала следующим шагом является генерация спектра мощности объединенного набора данных об интенсивности (рисунок 5).
25. Откройте мастер быстрого преобразования Фурье (FFT) в программном обеспечении для работы с электронными таблицами. Выберите входные данные в виде набора данных binned и выходные данные в виде пустого набора из того же количества строк, что и bins.
26. Извлеките компонент реальной стоимости БПФ.
27. Поднимите каждое реальное значение БПФ во вторую степень. Это дает набор данных спектров мощности.
28. Выберите первую половину набора данных спектров мощности и переместите ее так, чтобы она лежала ниже второй половины. Это приводит к центрированию спектров мощности вокруг центральной частоты, когда она строится на следующем шаге.
29. Постройте спектры мощности на оси Y графика x-y, где значения оси x представляют собой диапазон от -1 x (количество bins/2) до (количество bins/2) -1. В случае 1000 бункеров значения оси будут варьироваться от -500 до 499.
30. Спектры мощности для каждого животного следует сравнивать на основе распространения ненулевых пиков и высот этих ненулевых пиков.

Результаты

Мы показываем репрезентативные результаты, начиная с Шага 3. На рисунке 1 показаны неповрежденные эксплантированные кишечники с флуоресцентными измерениями. Желудок (фиолетовый) укладывается вдоль той же оси, что и тонкая кишка (оранжевый), но мы предпочитаем перемещать...

Обсуждение

Желудочно-кишечный тракт, как и другие трубчатые органы, такие как кровеносные сосуды, требует механических датчиков и эффекторов для поддержания гомеостаза 26,27,28. Тем не менее, желудочно-кишечный тракт уникален тем, что физические сво?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	664	other mice can be used with this protocol
Dissection tools	n/a	n/a
Excel software	Microsoft	n/a	used for spreadsheet analysis
Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 75-90um - 10g	Cospheric	UVPMS-BG-1.00 75-90um - 10g	"smaller beads" in the manuscript
Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 180-212um - 10g	Cospheric	UVPMS-BG-1.00 180-212um - 10g	"larger beads" in the manuscript
Gavage needles	Instech	FTP-18-50-50
ImageJ software	n/a	n/a	used to extract fluorescence profile
Laminated ruler paper (prepared in-house)	n/a	n/a
Methyl cellulose (viscosity: 400 cP)	Sigma	M0262
Photoshop software	Adobe	n/a	used for image processing
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran	Sigma	r8881-100mg	"liquid" condition in the manuscript
Xenogen IVIS 200	Perkin Elmer	124262	In vivo imaging system