Estudando o Mecananosense do Intestino Delgado Urinário de Partículas Luminais

Resumo

Para estudar como o intestino delgado lida com partículas de tamanhos variados, modificamos um método estabelecido in vivo para determinar o trânsito do intestino delgado.

Resumo

A motilidade gastrointestinal (GI) é fundamental para a digestão e absorção normais. No intestino delgado, que absorve nutrientes, a motilidade otimiza a digestão e a absorção. Por esta razão, alguns dos padrões de motilidade no intestino delgado incluem segmentação para mistura de conteúdo luminal e peristaltismo para sua propulsão. As propriedades físicas do conteúdo luminal modulam os padrões de motilidade do intestino delgado. A estimulação mecânica dos circuitos mecanossensoriais gastrointestinais pelo conteúdo luminal em trânsito e pela motilidade intestinal subjacente inicia e modula padrões motores GI complexos. No entanto, os mecanismos mecanossensoriais que impulsionam esse processo permanecem pouco compreendidos. Isto é principalmente devido à falta de ferramentas para dissecar como o intestino delgado lida com materiais de diferentes propriedades físicas. Para estudar como o intestino delgado lida com partículas de tamanhos variados, modificamos um método estabelecido in vivo para determinar o trânsito do intestino delgado. Nós gavagamos ratos vivos com líquido fluorescente ou minúsculas contas fluorescentes. Após 30 minutos, dissecamos os intestinos para obter imagens da distribuição do conteúdo fluorescente em toda a totalidade do trato gastrointestinal. Além das medições de alta resolução do centro geométrico, usamos binning de tamanho variável e análise espectral para determinar como diferentes materiais afetam o trânsito do intestino delgado. Exploramos como um mecanismo de "toque intestinal" recentemente descoberto afeta a motilidade do intestino delgado usando essa abordagem.

Introdução

O trato gastrointestinal (GI) humano é um sistema de órgãos de vários metros de comprimento, aproximadamente aproximado como um tubo de diferentes dimensões e propriedades físicas¹. À medida que o conteúdo se move através de seu comprimento, a principal função do trato gastrointestinal é absorver substâncias críticas para a vida. O intestino delgado é especificamente responsável pela absorção de nutrientes. O trânsito do intestino delgado é rigidamente regulado para combinar com as funções de digestão e absorção, resultando em vários padrões de motilidade. Bayliss e Starling descreveram a "lei do intestino"² em 1899, mostrando o programa de propulsão contrátil no intestino conhecido hoje como reflexo peristáltico; o segmento proximal ao bolo alimentar se contrai para impulsioná-lo para a frente, e o segmento distal relaxa para recebê-lo. Em teoria, esse padrão por si só poderia ser suficiente para transportar material aboricamente, mas mais de um século de pesquisa pintou um quadro mais complexo da atividade contrátil no trato gastrointestinal. Três períodos de motilidade do intestino delgado são reconhecidos em humanos: o complexo motor migratório (MMC), o período de jejum e o período pós-prandial³. Os mesmos padrões foram relatados em camundongos ^4,5. A MMC é um padrão motor cíclico conservado na maioria dos mamíferos ^6,7. A MMC tem um padrão característico de quatro fases que serve como um marcador clínico útil nos distúrbios gastrointestinais funcionais⁷. As quatro fases, em ordem de ocorrência, são (I) quiescência, (II) contrações irregulares e de baixa amplitude, (III) contrações regulares de alta amplitude e (IV) período de rampa para baixo de atividade declinante⁷. O MMC marca o principal padrão motor do período de jejum³. MMCs do período de jejum limpar o conteúdo do intestino delgado em preparação para a próxima refeição.

Os padrões motores do período pós-prandial são otimizados para as funções digestiva e absortiva³. Independentemente da composição calórica, o trânsito inicial é rápido ao longo do intestino delgado, o conteúdo é espalhado ao longo do comprimento do intestino e, posteriormente, o trânsito diminui⁸. A absorção é otimizada aumentando a área de superfície de contato e retardando-a para aumentar o tempo de residência. Uma vez que os nutrientes estão dentro do lúmen, o padrão dominante consiste em contrações descoordenadas próximas (<2 cm de distância) (contrações segmentadoras), com algumas contrações sobrepostas de grande amplitude abrangendo toda a extensão do intestino delgado (contrações peristálticas)⁹. As contrações segmentantes misturam o conteúdo intraluminal no lugar. As grandes contrações peristálticas ocasionais impulsionam o conteúdo em direção ao cólon.

O momento dessa transição de volta aos MMCs depende do volume de alimentos e da composição calórica¹⁰. Assim, o intestino delgado amostras pistas luminais para regular quando a transição entre os períodos de motilidade. Pistas mecânicas, como propriedades físicas do conteúdo luminal¹¹, volume luminal e tensão da parede, envolvem células mecanorreceptoras na parede gastrointestinal 12,13,14,15,16. De fato, o aumento do componente sólido de uma refeição leva a um aumento no trânsito do intestino delgado¹⁷. Especulamos que propriedades físicas, como o estado líquido ou sólido dos conteúdos intraluminais, devem envolver diferentes mecanorreceptores devido às várias forças que geram na parede gastrointestinal¹⁸.

O padrão-ouro para medir o trânsito gastrointestinal in vivo em humanos, como em camundongos, é o uso de marcadores radioativos medidos por cintilografia à medida que saem do estômago ou transitam ao longo do cólon^19,20. Em mamíferos, o intestino delgado circula de maneiras imprevisíveis, tornando o intestino delgado difícil de visualizar in vivo de forma confiável, mas o progresso está sendo feito²¹. Além disso, atualmente há uma falta de ferramentas para quantificar como o intestino delgado lida com partículas de propriedades e tamanhos variados. O ponto de partida aqui foi uma técnica padrão-ouro que padroniza o estudo do trânsito do intestino delgado 22,23,24 e da função de barreira ²². Consiste em gavagar camundongos com material fluorescente, aguardar a motilidade gastrointestinal para transportar o material, excisar o trato gastrointestinal, segmentá-lo em várias seções do estômago ao cólon, seccionar e homogeneizar o conteúdo intraluminal para quantificação da fluorescência. Fizemos duas melhorias. Primeiro, alteramos a composição do conteúdo gavado para incluir contas microscópicas fluorescentes para determinar como o intestino delgado distribui partículas físicas. Em segundo lugar, melhoramos a resolução espacial ao visualizar todo o trato gastrointestinal, do estômago ao cólon, ex vivo e usamos binning de tamanho variável para padronizar nossa análise entre os animais. Postulamos que isso revela novos insights sobre o equilíbrio das contrações propulsivas versus segmentadoras durante a fase pós-prandial.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Mayo Clinic.

1. Configuração

1. Ratos rápidos de 8 a 10 semanas de idade por 4 h. Forneça aos ratos acesso à água.
   NOTA: Usamos camundongos machos C57BL/6J do tipo selvagem para todos os experimentos apresentados aqui, mas eles podem ser realizados em camundongos de qualquer cepa, gênero e genótipo.
2. Arrefecer 15 ml de água destilada num tubo cónico de 50 ml num frigorífico a 4 °C.
3. Aqueça mais 15 mL de água destilada em um copo usando uma placa quente com uma barra de agitação magnética a aproximadamente 80-90 °C.
4. Meça 0,5% de metilcelulose para um total de 30 mL (0,15 g).
5. Adicione suavemente a metilcelulose a 15 mL de água quente para que ela não se aglomer. A solução de metilcelulose ficará turva durante este processo.
6. Uma vez dissolvido, retire o copo da placa quente e adicione os 15 mL de água gelada ao copo quente.
7. Colocar num frigorífico a 4 °C até que a solução esteja límpida, aproximadamente 15-20 min.
8. Quando estiver límpido, pesar 3 mg de isotiocianato de rodamina (RITC)-dextrano por 5 ml de solução de metilcelulose a 0,5% e misturar para combinar. Esta é a condição líquida na seção Resultados Representativos .
   1. Em alternativa, pesar 25 mg de microesferas fluorescentes de polietileno e misturar com 200 μL da solução de metilcelulose até incorporar bem. A incorporação completa de microesferas é assegurada pelo vórtice antes da gavagem. O experimentador deve visualizar a distribuição homogênea das microesferas suspensas na mistura.
   2. Como a solução RITC-dextran é sensível à luz, refrigere a solução. Preparar a solução de RITC-dextran e a mistura de microshpere com antecedência e utilizar no prazo de 2 meses. Ressuspenda a mistura de microesferas antes de ser usada.
      NOTA: Microesferas de tamanhos variados são usadas para estudar o manuseio gastrointestinal de diferentes materiais. Na seção Resultados Representativos , demonstramos os resultados do uso de microesferas pequenas (diâmetro: 75-90 μm) e maiores (diâmetro: 180-212 μm).

2. Gavagem do conteúdo intraluminal

1. Preparar a gavagem ligando um tubo de alimentação de 18 Ga x 50 mm a uma seringa de 1 ml e retirando 200 μL de solução RITC ou solução de microesfera.
2. Conservar manualmente o animal em jejum utilizando a técnica de contenção com uma mão²⁵. Consulte as informações da instituição sobre as técnicas adequadas de contenção murina.
3. Insira suavemente o tubo de alimentação através da boca e do esôfago do rato até que ele entre no estômago.
   NOTA: A etapa de gavagem é fundamental para um experimento bem-sucedido. Requer mãos experientes que possam inserir consistentemente o tubo aproximadamente à mesma distância em cada rato. Essa etapa precisa ser padronizada pelos experimentadores que realizam o protocolo. O mesmo experimentador deve gavagar todas as coortes de camundongos que serão comparadas entre si.
4. Expulse lentamente o conteúdo da seringa para o estômago e remova cuidadosamente o tubo do rato.
5. Após a gavagem, devolva o rato à gaiola.
6. Descarte o tubo de gavagem.
7. Repita o processo conforme necessário para o número desejado de animais.

3. Dissecção intestinal

1. Antes de iniciar as dissecções, ligue o instrumento de imagem in vivo para permitir que ele atinja a temperatura.
2. Sacrifique o rato 30 min após a gavagem. Use a inalação de dióxido de carbono para sacrificar o rato, seguida de luxação cervical para garantir uma eutanásia bem-sucedida.
3. Depois de confirmar a eutanásia bem-sucedida, coloque o rato em decúbito dorsal em um estágio de dissecção e fixe seus quatro apêndices no palco para ter acesso ao abdômen. Molhe a superfície do abdômen com etanol a 70% para molhar os pelos abdominais.
4. Use pinça de microdissecção 5 para puxar a pele e adquirir tesoura cirúrgica afiada para fazer uma incisão transversal 1 cm acima do ânus. Para expor a cavidade intraperitoneal, continue a incisão verticalmente até o abdômen até a caixa torácica.
5. Mova suavemente o ceco para a esquerda com a pinça de microdissecção para expor o cólon distal.
6. Corte o cólon distal com uma tesoura de microdissecação apenas proximal ao reto.
7. Desvende suavemente o cólon, o ceco e o intestino delgado, puxando lentamente na direção oposta.
   NOTA: Manter os intestinos dissecados em um segmento contínuo criará a maior facilidade para o investigador. Rasgos e rasgos ao longo do segmento farão com que as etapas subsequentes sejam mais difíceis.
8. Use uma tesoura de microdissecação para cortar a proximal do estômago.
9. Use fórceps para transferir os intestinos dissecados para a folha de medição (Figura 1). Coloque o estômago a 0 mm e disponha os intestinos ao longo da régua até 200 mm. Use uma tesoura de microdissecação para cortar a 200 mm. Repita este processo de alinhamento dos intestinos de 0 mm a 200 mm ao longo das réguas, mantendo-se confiante de que a orientação dos intestinos não se confunde.
   1. Tenha cuidado para evitar esticar as entranhas enquanto se alinha com as réguas.
10. Uma vez que o tecido esteja disposto na régua, organize o ceco de modo que ele seja paralelo ao tecido, mas não em contato direto com ele (se alguma fluorescência for encontrada dentro dessa região, será necessária uma distinção clara entre o ceco e os intestinos).
11. Coloque a folha de medição com o tecido dissecado em uma área escura para que a fluorescência possa ser preservada até a hora da imagem.

4. Imagem ex vivo

1. Abra o software de imagem in vivo e faça login.
2. Inicialize o instrumento de imagem para que ele esteja pronto para a aquisição de imagens.
3. Defina os campos 'Citação' e 'Emissão' para a cor correspondente usada para a gavagem de contas ou RITC. Vermelho (líquido): excitação 535 nm /emissão 600 nm. Verde (microesferas): excitação 465 nm /emissão 520 nm.
4. Defina a exposição como 'Auto'.
5. Selecione o campo de visão.
6. Antes de colocar a folha de medição no instrumento, certifique-se de que os intestinos não se deslocaram durante o transporte.
7. Coloque a folha de medição no instrumento dentro do campo de visão.
8. Feche com segurança a porta do instrumento e selecione Instantâneo para fotografar o campo de visão.
9. Salve as imagens coletadas em uma unidade flash para análise. Salve capturas individuais das imagens fluorescentes e fotográficas. Uma sobreposição da fotografia e fluorescência indica a localização do material fluorescente no trato gastrointestinal (Figura 1).
   Observação : recomendamos salvar os arquivos no formato de arquivo de imagem de marca (.tif) para processamento downstream.

5. Análise

1. Abra os arquivos de imagem fluorescentes e de fotografia em um software de edição de imagens.
2. Ajuste o tamanho do pixel de ambas as imagens de modo que elas tenham exatamente as mesmas dimensões (nossa convenção era definir ambas as imagens para 1280 pixels por 850 pixels [altura x largura]).
3. Feche o arquivo de fotografia. As etapas a seguir envolvem apenas a imagem fluorescente.
4. Use uma ferramenta de borracha para remover o plano de fundo e torná-lo transparente. Uma borracha pode ser necessária para remover manchas do plano de fundo restante.
5. Crie uma nova camada. Torne-o um fundo totalmente preto para o sinal fluorescente. Isso pode ser conseguido escolhendo um preenchimento preto para a camada e arrastando a camada para ficar abaixo da camada com a imagem fluorescente.
6. Salve a nova imagem fluorescente, contendo apenas o sinal fluorescente em um fundo preto, como um novo arquivo de .tif.
7. Abra as novas imagens fluorescentes e fotográficas no ImageJ.
8. Transforme cada imagem em uma imagem de 32 bits escolhendo Imagem > Tipo > 32 bits.
9. Crie uma imagem mesclada de ambos escolhendo Imagem > Cores > Mesclar canais. Na caixa de diálogo que é aberta, selecione o arquivo de fotografia para o canal cinza e o arquivo fluorescente em qualquer canal colorido.
10. Desative a escala da imagem mesclada selecionando Analisar > Definir escala > Clique para remover escala.
11. Selecione a ferramenta "Retângulo" no ImageJ.
12. Desenhe um retângulo em torno de uma seção do intestino delgado. Preste muita atenção à largura dessa região de interesse (ROI), pois ela deve permanecer constante entre todos os ROIs. O valor nominal não é essencial, apenas que é mantido consistente em todas as ROIs desenhadas nesta imagem [uma vez que o intestino delgado assume várias linhas, ROIs individuais serão desenhadas em cada seção do intestino delgado em uma linha diferente (Figura 1)]. A Figura 2 mostra o local do valor de largura na barra de ferramentas ImageJ.
13. Duplique o ROI selecionando Imagem > Duplicar. Selecione apenas o canal correspondente ao canal colorido.
14. Use a ferramenta retângulo novamente para desenhar um ROI sobre toda a nova imagem.
15. Recupere um perfil da fluorescência selecionando Analisar perfil de plotagem >. O gráfico resultante plota no eixo y a intensidade média de cada pixel ao longo do comprimento do ROI. Este foi selecionado na etapa 5.12 para ser o comprimento da seção analisada do intestino delgado
16. Abra a lista de valores e copie-os para um software de planilha.
17. Repita os passos 5.12-5.16 para cada seção do intestino delgado em uma linha de régua diferente. Continue colando os valores no mesmo arquivo de planilha imediatamente abaixo de cada conjunto anterior de valores, de modo que todas as linhas contínuas nessa coluna contenham o valor de intensidade média para todo o comprimento do intestino delgado.
18. No software de planilha, multiplique cada valor de intensidade média pela largura constante do retângulo de ROI criado na etapa 5.12. Isso produzirá o valor real da intensidade ao longo do intestino delgado em cada ponto.
    NOTA: Diferentes animais terão pequenas variações no comprimento do intestino delgado. Para evitar que as diferenças de comprimento afetem o resultado da análise de dados a jusante, a cadeia de valores de intensidade precisa ser agrupada em um número consistente de compartimentos em todas as amostras experimentais (a Figura 3, a Figura 4 e a Figura 5 exibem os resultados para três tamanhos de compartimentos).
19. Divida o número de valores de intensidade pelo número de compartimentos desejados. O quociente resultante S determina o número de valores de intensidade que estão sendo incluídos em cada compartimento.
20. Determine o compartimento para onde cada valor de intensidade bruta irá usando uma fórmula de arredondamento. Esta etapa coloca cada valor de intensidade bruta em uma caixa. Cada valor de intensidade bruta é indexado cronologicamente com o inteiro N. O quociente N/S determina o número de compartimentos atribuído a cada valor bruto. A fórmula de arredondamento deve arredondar esse quociente para um número inteiro sem decimais.
21. Gere o valor para cada compartimento usando uma fórmula averageif. O objetivo é calcular a média dos valores brutos atribuídos a um compartimento específico na Etapa 5.20. Assim, os argumentos na fórmula devem ser: (1) compartimentos atribuídos gerados na Etapa 5.20, (2) número do compartimento, (3) valores de intensidade bruta.
    NOTA: A primeira análise que podemos realizar nos dados binados é uma análise de centro geométrico, que quantifica até que ponto observamos a maior intensidade fluorescente ao longo do intestino delgado (Figura 4).
22. Normalize cada valor de intensidade sobre a intensidade fluorescente total. Em outras palavras, divida cada valor de intensidade pela soma de todas as intensidades.
23. Multiplique cada valor normalizado pelo número do compartimento. O produto reflete o peso relativo de cada caixa, contribuindo para a intensidade fluorescente total.
24. A soma de todos os valores gerados na Etapa 5.23 produz o número do compartimento no centro do sinal fluorescente. Divida pelo número de caixas para expressar o centro geométrico como a fração do intestino delgado percorrida pelo centro fluorescente.
    NOTA: Para refletir a distribuição espacial do sinal, a próxima etapa é gerar o espectro de potência do conjunto de dados de intensidade binned (Figura 5).
25. Abra um assistente de Transformação Rápida de Fourier (FFT) no software de planilha. Selecione a entrada como o conjunto de dados binned e a saída como um conjunto vazio do mesmo número de linhas que bins.
26. Extraia o componente de valor real da FFT.
27. Eleve cada valor real da FFT para a segunda potência. Isso produz um conjunto de dados de espectros de potência.
28. Selecione a primeira metade do conjunto de dados de espectros de potência e mova-o para que fique abaixo da segunda metade. Isso tem o efeito de centralizar os espectros de potência em torno da frequência central quando ela é plotada na próxima etapa.
29. Plote os espectros de potência no eixo y de um gráfico x-y onde os valores do eixo x são o intervalo de -1 x (número de caixas/2) a (número de caixas/2) -1. No caso de 1000 caixas, os valores do eixo variariam de -500 a 499.
30. Os espectros de potência para cada animal devem ser comparados com base na propagação de picos diferentes de zero e nas alturas desses picos diferentes de zero.

Resultados

Mostramos resultados representativos a partir do Passo 3 em diante. A Figura 1 mostra os intestinos explantados intactos, com medidas fluorescentes sobrepostas. O estômago (roxo) é colocado ao longo do mesmo eixo que o intestino delgado (laranja), mas preferimos mover o ceco (azul) para o lado para evitar a sobreposição com o intestino grosso (laranja). Como evidenciado no painel esquerdo, isso nem sempre é possível devido ao tamanho do órgão. Cortamos o intestino delgado a ~200 mm p...

Discussão

O trato gastrointestinal, assim como outros órgãos tubulares, como os vasos sanguíneos, necessita de sensores mecânicos e efetores para manter a homeostase^26,27,28. No entanto, o trato gastrointestinal é único na medida em que as propriedades físicas dos materiais que o atravessam não são constantes entre as refeições. Conteúdos intraluminais de várias propriedades físicas (sólido, líquido e gasoso) transitam pel...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	664	other mice can be used with this protocol
Dissection tools	n/a	n/a
Excel software	Microsoft	n/a	used for spreadsheet analysis
Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 75-90um - 10g	Cospheric	UVPMS-BG-1.00 75-90um - 10g	"smaller beads" in the manuscript
Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 180-212um - 10g	Cospheric	UVPMS-BG-1.00 180-212um - 10g	"larger beads" in the manuscript
Gavage needles	Instech	FTP-18-50-50
ImageJ software	n/a	n/a	used to extract fluorescence profile
Laminated ruler paper (prepared in-house)	n/a	n/a
Methyl cellulose (viscosity: 400 cP)	Sigma	M0262
Photoshop software	Adobe	n/a	used for image processing
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran	Sigma	r8881-100mg	"liquid" condition in the manuscript
Xenogen IVIS 200	Perkin Elmer	124262	In vivo imaging system