管腔微粒子のマウス小腸メカノセンシングの研究

要約

小腸がさまざまなサイズの微粒子をどのように処理するかを研究するために、私たちは確立された in vivo 法を修正して小腸通過を決定しました。

要約

胃腸(GI)の運動性は、正常な消化と吸収にとって重要です。栄養素を吸収する小腸では、運動性が消化と吸収を最適化します。このため、小腸の運動パターンには、管腔内容物を混合するためのセグメンテーションと、それらの推進のための蠕動運動が含まれます。管腔内容物の物理的性質は、小腸の運動性のパターンを調節する。管腔内容物とその根底にある腸の運動性をトランジットすることによるGI機械感覚回路の機械的刺激は、複雑なGI運動パターンを開始および調節します。しかし、このプロセスを推進する機械感覚メカニズムは、まだよくわかっていません。これは主に、小腸が異なる物理的特性の材料をどのように扱うかを解剖するためのツールが不足しているためです。小腸がさまざまなサイズの微粒子をどのように処理するかを研究するために、私たちは確立された in vivo 法を修正して小腸通過を決定しました。生きたマウスに蛍光液体または微小な蛍光ビーズを経管投与します。30分後、腸を解剖して、消化管全体にわたる蛍光成分の分布を画像化します。幾何学的中心の高分解能測定に加えて、可変サイズビニングとスペクトル分析を使用して、さまざまな材料が小腸輸送にどのように影響するかを判断します。最近発見された「腸のタッチ」メカニズムが、このアプローチを使用して小腸の運動性にどのように影響するかを調べました。

概要

ヒトの胃腸(GI)管は、長さ数フィートの臓器系であり、さまざまな寸法と物理的特性のチューブとして大まかに近似されます¹。内容物がその長さを移動するにつれて、消化管の主な機能は生命にとって重要な物質を吸収することです。小腸は特に栄養素の吸収に関与しています。小腸の通過は、消化および吸収機能に一致するように厳密に制御されており、さまざまな運動パターンをもたらします。ベイリスとスターリングは、1899年に「腸の法則」²について説明し、今日蠕動反射として知られている腸内の収縮推進プログラムを示しました。食物ボーラスの近位のセグメントはそれを前方に推進するために収縮し、遠位セグメントはそれを受け取るために弛緩します。理論的には、このパターンだけで材料をボラルに輸送するのに十分である可能性がありますが、1世紀以上の研究により、消化管の収縮活動のより複雑な絵が描かれてきました。ヒトでは、移動運動複合体(MMC)、絶食期、食後期間の3つの小腸^{運動期間が}認められています3。同じパターンがマウス^4,5でも報告されています。MMCは、ほとんどの哺乳類で保存されている周期的な運動パターンです^6,7。MMCは、機能性GI^障害7において有用な臨床マーカーとして機能する特徴的な4相パターンを有する。4つのフェーズは、発生順に、(I)静止、(II)不規則で低振幅の収縮、(III)規則的な高振幅の収縮、および(IV)活動の低下のランプダウン期間^です7。MMCは、断食期間³の主要な運動パターンを示します。絶食期のMMCは、次の食事に備えて小腸の内容物を片付けます。

食後の運動パターンは、消化機能と吸収機能に最適化されています³。カロリー組成に関係なく、最初の通過は小腸に沿って速く、内容物は腸の長さに沿って広がり、その後の通過は遅くなります⁸。吸収は、接触表面積を増やし、それを遅くして滞留時間を増やすことによって最適化されます。栄養素が内腔内に入ると、支配的なパターンは、緊密な(<2 cm離れた)協調性のない収縮(セグメント収縮)で構成され、小腸の全長にまたがるいくつかの重ねられた大振幅の収縮(蠕動収縮)⁹。セグメント化収縮は、管腔内内容物を所定の位置に混合する。時折の大きな蠕動収縮は、内容物を結腸に向かって推進します。

MMCへのこの移行のタイミングは、食物量とカロリー組成に依存します¹⁰。したがって、小腸は管腔の手がかりをサンプリングして、運動期間間の移行時期を調節します。管腔内容^物11の物理的性質、管腔容積、および壁張力などの機械的手がかりは、GI壁12、^{13、14、15、16}の機械受容器細胞を関与させる。実際、食事の固形成分を増やすと、小腸通過が増加します¹⁷。我々は、管腔内内容物の液体または固体状態などの物理的特性は、それらがGI壁¹⁸に生成する様々な力のために、異なる機械受容器と交戦しなければならないと推測する。

マウスと同様に、ヒトのin vivoGIトランジットを測定するためのゴールドスタンダードは、胃を出るとき、または結腸に沿って通過するときにシンチグラフィーによって測定された放射性トレーサーの使用です^19,20。哺乳類では、小腸は予測不可能な方法でループするため、小腸をin vivoで確実に画像化することは困難ですが、進歩^{が見られます21}。さらに、現在、小腸がさまざまな特性とサイズの微粒子をどのように処理するかを定量化するためのツールが不足しています。ここでの出発点は、小腸通過^22,23,24とバリア機能²²の研究を標準化するゴールドスタンダードの技術でした。これは、蛍光材料でマウスを経管し、GI運動性が物質を輸送するのを待ち、消化管を切除し、胃から結腸までのいくつかのセクションに分割し、切片化し、蛍光定量のために管腔内内容物を均質化することで構成されます。2 つの改善を行いました。まず、小腸が物理的な粒子をどのように分布させるかを決定するために、経管栄養内容物の構成を変更して蛍光顕微鏡ビーズを含めました。次に、胃から結腸までの消化管全体をex vivoでイメージングすることで空間分解能を改善し、可変サイズビニングを使用して動物全体の分析を標準化しました。これにより、食後の段階における推進収縮とセグメント化収縮のバランスに関する新しい洞察が明らかになったと仮定します。

プロトコル

ここに記載されているすべての方法は、メイヨークリニックの施設動物管理使用委員会(IACUC)によって承認されています。

1. セットアップ

1. 8〜10週齢のマウスを4時間高速にします。マウスに水へのアクセスを提供します。
   注:ここに示されているすべての実験には野生型の雄C57BL / 6Jマウスを使用していますが、系統、性別、遺伝子型のマウスで実行できます。
2. 4°Cの冷蔵庫の50mLコニカルチューブで15mLの蒸留水を冷却します。
3. 磁気攪拌子付きのホットプレートを使用して、ビーカー内の別の15mLの蒸留水を約80〜90°Cに加熱します。
4. 0.5%メチルセルロースを合計30 mL(0.15 g)測定します。
5. メチルセルロースを15mLのお湯にそっと加え、固まらないようにします。このプロセスの間、メチルセルロース溶液は白濁します。
6. 溶解したら、ビーカーをホットプレートから取り出し、15mLの冷水をホットビーカーに加えます。
7. 溶液が透明になるまで、約15〜20分間、4°Cの冷蔵庫に入れます。
8. 透明になったら、0.5%メチルセルロース溶液5 mLあたり3 mgのローダミンイソチオシアネート(RITC)-デキストランを量り、混ぜ合わせて混ぜ合わせます。これは、 代表結果 セクションの液体条件です。
   1. あるいは、25 mgの蛍光ポリエチレンミクロスフェアを秤量し、200 μLのメチルセルロース溶液とよく混入するまで混合します。ミクロスフェアの徹底的な取り込みは、経管栄養前の渦によって保証されます。実験者は、混合物中の浮遊ミクロスフェアの均一な分布を視覚化 しなければならない 。
   2. RITC-デキストラン溶液は光に敏感であるため、溶液を冷蔵します。RITCデキストラン溶液とマイクロシュペール混合物を事前に準備し、2ヶ月以内に使用してください。使用前にマイクロスフェア混合物を再懸濁してください。
      注:さまざまなサイズのミクロスフェアを使用して、さまざまな材料の胃腸の取り扱いを研究します。 代表的な結果の セクションでは、小さい(直径:75-90 μm)と大きい(直径:180-212 μm)ミクロスフェアを使用した結果を示します。

2.管腔内内容経管栄養

1. 18 Ga x 50 mmの栄養チューブを1 mLシリンジに取り付け、200 μLのRITC溶液またはマイクロスフェア溶液を吸引して、経管栄養を準備します。
2. 片手拘束技術²⁵を用いて絶食動物を手動で拘束する。適切なマウス拘束技術に関する機関の情報を参照してください。
3. 胃に入るまで、マウスの口と食道から栄養チューブをそっと挿入します。
   注:経管栄養ステップは、実験を成功させるために重要です。各マウスにほぼ同じ距離でチューブを一貫して挿入できる経験豊富な手が必要です。このステップは、プロトコルを実行する実験者によって標準化される必要があります。同じ実験者は、互いに比較されるすべてのマウスコホートを経管投与する必要があります。
4. シリンジの内容物をゆっくりと胃の中に排出し、マウスからチューブを慎重に取り外します。
5. 経管栄養の後、マウスをケージに戻します。
6. 経管チューブは廃棄してください。
7. 必要に応じて、希望する動物数に対してこのプロセスを繰り返します。

3.腸郭清

1. 解剖を開始する前に、 in vivo イメージング機器の電源を入れて、温度を上げてください。
2. 経管投与の30分後にマウスを犠牲にする。二酸化炭素吸入を使用してマウスを犠牲にし、続いて頸部脱臼を使用して安楽死を確実にします。
3. 安楽死が成功したことを確認したら、マウスを解剖ステージで仰臥位に置き、その4つの付属肢をステージに固定して腹部にアクセスできるようにします。腹部の表面を70%エタノールで濡らして、腹部の毛を濡らします。
4. 微小解剖鉗子を使用して皮膚を引っ張り、鋭利な外科用ハサミを取得して、肛門の1cm上に横切開を行います。腹腔を露出させるには、胸郭まで腹部を垂直に切開し続けます。
5. 微小解離鉗子で盲腸をゆっくりと左に動かし、遠位結腸を露出させます。
6. 直腸のすぐ近位にある微小解剖ハサミで遠位結腸を切断します。
7. 結腸、盲腸、小腸を反対方向にゆっくりと引っ張って緩やかにほぐします。
   注:解剖された腸を1つの連続したセグメントに維持すると、研究者にとって最も簡単になります。セグメントに沿った裂け目や裂け目は、後続の手順をより困難にします。
8. 微小解剖はさみを使用して、胃の近位を切断します。
9. 鉗子を使用して、解剖した腸を測定シートに移します(図1)。胃を0 mmに置き、定規に沿って200 mmまで腸を配置します。マイクロ解剖ハサミを使用して200mmで切断します。腸の向きが混乱しないように確信しながら、定規に沿って腸を0 mmから200 mmに揃えるこのプロセスを繰り返します。
   1. 定規に合わせながら腸を伸ばさないように注意してください。
10. 組織が定規に配置されたら、組織と平行であるが直接接触しないように盲腸を配置します(その領域内に蛍光が見つかった場合は、盲腸と腸の明確な違いの区別が必要になります)。
11. 解剖した組織を含む測定シートを暗い領域に置いて、画像化する時間になるまで蛍光を保存できるようにします。

4. 生体外イメージング

1. 生体内イメージングソフトウェアを開き、ログインします。
2. イメージング機器を初期化して、画像取得の準備を整えます。
3. 「励起」フィールドと「放出」フィールドを、ビードまたはRITC経管に使用される対応する色に設定します。赤色(液体):励起535 nm/発光600 nm。緑色(ミクロスフェア):励起465 nm/発光520 nm。
4. 露出を「自動」に設定します。
5. 視野を選択します。
6. 測定シートを機器に入れる前に、輸送中に腸が移動していないことを確認してください。
7. 測定シートを視野内の機器に配置します。
8. 機器のドアをしっかりと閉め、[ スナップショット ]を選択して視野を撮影します。
9. 収集した画像を分析のためにフラッシュドライブに保存します。蛍光画像と写真画像の個々のキャプチャを保存します。写真と蛍光のオーバーレイは、消化管内の蛍光物質の位置を示します(図1)。
   注: ダウンストリーム処理のために、タグ イメージ ファイル (.tif) 形式でファイルを保存することをお勧めします。

5. 分析

1. 蛍光灯と写真の画像ファイルを画像編集ソフトウェアで開きます。
2. 両方の画像のピクセルサイズを調整して、まったく同じサイズにします(私たちの慣習では、両方の画像を1280ピクセルx 850ピクセル[高さx幅]に設定していました)。
3. 写真ファイルを閉じます。以下のステップは蛍光画像のみを含む。
4. 消しゴムツールを使用して背景を削除し、透明にします。残りの背景のパッチを削除するには、消しゴムが必要になる場合があります。
5. 新しいレイヤーを作成します。蛍光シグナルの背景を完全に黒にします。これは、レイヤーに黒の塗りつぶしを選択し、レイヤーをドラッグして蛍光画像のあるレイヤーの下に置くことで実現できます。
6. 黒い背景に蛍光シグナルのみを含む新しい蛍光画像を新しい.tifファイルとして保存します。
7. ImageJで新しい蛍光画像と写真画像を開きます。
8. [ イメージ>の種類] > [32 ビット] を選択して、各イメージを 32 ビット イメージに変換します。
9. 両方の結合画像を作成するには 、「画像>カラー」>「チャンネルを結合」を選択します。開いたダイアログボックスで、グレーチャンネルの写真ファイルと、任意のカラーチャンネルの下の蛍光ファイルを選択します。
10. 結合された画像のスケールをオフにするには 、「分析>スケールを設定」>「クリックしてスケールを削除」を選択します。
11. ImageJの「長方形」ツールを選択します。
12. 小腸のセクションの周りに長方形を描きます。この関心領域 (ROI) の幅は、すべての ROI 間で一定に保たれる必要があるため、細心の注意を払ってください。公称値は必須ではなく、この画像に描かれたすべてのROIで一貫しているだけです[小腸が複数の行を引き継ぐため、個々のROIは小腸の各セクションに異なる行で描画されます(図1)]。 図 2 は、ImageJ ツール バーの幅の値の位置を示しています。
13. ROI を複製するには、[画像] > [複製] を選択します。色付きのチャンネルに対応するチャンネルのみを選択します。
14. 長方形ツールをもう一度使用して、新しい画像全体にROIを描画します。
15. 蛍光のプロファイルを取得するには 、分析>プロットプロファイルを選択します。結果のグラフは、ROIの長さに沿った各ピクセルの平均強度をy軸にプロットします。これは、ステップ5.12で、小腸の分析されたセクションの長さとして選択されました。
16. 値のリストを開き、スプレッドシートソフトウェアにコピーします。
17. 異なる定規列の小腸の各セクションに対して手順5.12〜5.16を繰り返します。同じスプレッドシートファイルの前の各値セットのすぐ下に値を貼り付けて、その列のすべての連続した行に小腸の全長の平均強度値が含まれるようにします。
18. スプレッドシートソフトウェアで、各平均強度値に、手順5.12で作成したROI長方形の一定の幅を掛けます。これにより、各ポイントの小腸に沿った実際の強度値が得られます。
    注:動物が異なれば、小腸の長さにわずかな違いがあります。長さの違いがダウンストリームデータ分析の結果に影響を与えないようにするには、強度値の文字列をすべての実験サンプルで一貫した数のビンにビン分割する必要があります(図3、図4、および図5は、3つのビンサイズの結果を示しています)。
19. 強度値の数を必要なビンの数で割ります。結果の商 S は、各ビンに含まれる強度値の数を決定します。
20. 切り上げ式を使用して、各生の強度値が配置されるビンを決定します。この手順では、各生の強度値をビンに配置します。各生の強度値は、整数 Nで時系列で索引付けされます。商 N / S は、各生の値に割り当てられたビン番号を決定します。切り上げ式は、この商を小数なしの整数に丸める必要があります。
21. 平均if式を使用して、各ビンの値を生成します。目的は、ステップ 5.20 で特定のビンに割り当てられた生の値を平均することです。したがって、式の引数は、(1)ステップ5.20で生成された割り当てられたビン、(2)ビン番号、(3)生の強度値である必要があります。
    注:ビン化されたデータに対して実行できる最初の分析は、小腸に沿って最も高い蛍光強度をどこまで観察するかを定量化する幾何学的中心分析です(図4)。
22. 各強度値を全蛍光強度で正規化します。つまり、各強度値をすべての強度の合計で割ります。
23. 正規化された各値にビン番号を掛けます。この製品は、各ビンの相対重量を反映し、総蛍光強度に寄与します。
24. ステップ5.23で生成されたすべての値を加算すると、蛍光シグナルの中心にあるビン番号が得られます。ビンの数で割って、幾何学的中心を蛍光中心が移動した小腸の割合として表します。
    注:信号の空間分布を反映するために、次のステップは、ビン分割された強度データセットのパワースペクトルを生成することです(図5)。
25. 表計算ソフトウェアで高速フーリエ変換(FFT)ウィザードを開きます。入力をビン分割されたデータ・セットとして選択し、出力をビンと同じ行数の空のセットとして選択します。
26. FFTの実数値成分を抽出します。
27. FFTの各実数値を2乗に上げます。これにより、パワースペクトルのデータセットが得られます。
28. パワースペクトルデータセットの前半を選択し、後半より下になるように移動します。これは、次のステップでプロットするときに、パワースペクトルを中心周波数を中心にセンタリングする効果があります。
29. x軸の値が-1 x(ビン数/2)から(ビン数/2)-1の範囲であるx-yグラフのy軸にパワースペクトルをプロットします。1000 個のビンの場合、軸の値の範囲は -500 から 499 になります。
30. 各動物のパワースペクトルは、非ゼロピークの広がりとこれらの非ゼロピークの高さに基づいて比較する必要があります。

結果

ステップ3以降の代表的な成果を示す。 図1 は、無傷の外植腸を示し、蛍光測定値を重ね合わせた。胃(紫色)は小腸(オレンジ)と同じ軸に沿って置かれていますが、大腸(オレンジ)との重なりを防ぐために盲腸(青)を横に動かすことを好みます。左のパネルで証明されているように、これは臓器のサイズのために常に可能であるとは限りません。小腸を~200mmで切断し、連続?...

ディスカッション

消化管は、血管などの他の管状器官と同様に、恒常性を維持するために機械的センサーとエフェクターを必要とします^26、27、28。ただし、消化管は、消化管を横断する材料の物理的特性が食事全体で一定ではないという点で独特です。さまざまな物理的特性(固体、液体、気体)の管腔内内容物が腸を通過し、GI機械受容器?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	664	other mice can be used with this protocol
Dissection tools	n/a	n/a
Excel software	Microsoft	n/a	used for spreadsheet analysis
Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 75-90um - 10g	Cospheric	UVPMS-BG-1.00 75-90um - 10g	"smaller beads" in the manuscript
Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 180-212um - 10g	Cospheric	UVPMS-BG-1.00 180-212um - 10g	"larger beads" in the manuscript
Gavage needles	Instech	FTP-18-50-50
ImageJ software	n/a	n/a	used to extract fluorescence profile
Laminated ruler paper (prepared in-house)	n/a	n/a
Methyl cellulose (viscosity: 400 cP)	Sigma	M0262
Photoshop software	Adobe	n/a	used for image processing
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran	Sigma	r8881-100mg	"liquid" condition in the manuscript
Xenogen IVIS 200	Perkin Elmer	124262	In vivo imaging system