Estudio de la mecanodetección murina del intestino delgado de partículas luminales

Resumen

Para estudiar cómo el intestino delgado maneja partículas de diferentes tamaños, hemos modificado un método in vivo establecido para determinar el tránsito del intestino delgado.

Resumen

La motilidad gastrointestinal (GI) es crítica para la digestión y absorción normales. En el intestino delgado, que absorbe los nutrientes, la motilidad optimiza la digestión y la absorción. Por esta razón, algunos de los patrones de motilidad en el intestino delgado incluyen segmentación para la mezcla de contenidos luminales y peristaltismo para su propulsión. Las propiedades físicas de los contenidos luminales modulan los patrones de motilidad del intestino delgado. La estimulación mecánica de los circuitos mecanosensoriales gastrointestinales mediante el tránsito de contenidos luminales y la motilidad intestinal subyacente inicia y modula patrones motores gastrointestinales complejos. Sin embargo, los mecanismos mecanosensoriales que impulsan este proceso siguen siendo poco conocidos. Esto se debe principalmente a la falta de herramientas para diseccionar cómo el intestino delgado maneja materiales de diferentes propiedades físicas. Para estudiar cómo el intestino delgado maneja partículas de diferentes tamaños, hemos modificado un método in vivo establecido para determinar el tránsito del intestino delgado. Hacemos ratones vivos con líquido fluorescente o pequeñas perlas fluorescentes. Después de 30 minutos, diseccionamos los intestinos para obtener imágenes de la distribución de contenidos fluorescentes en todo el tracto gastrointestinal. Además de las mediciones de alta resolución del centro geométrico, utilizamos binning de tamaño variable y análisis espectral para determinar cómo los diferentes materiales afectan el tránsito del intestino delgado. Hemos explorado cómo un mecanismo de "toque intestinal" recientemente descubierto afecta la motilidad del intestino delgado utilizando este enfoque.

Introducción

El tracto gastrointestinal (GI) humano es un sistema de órganos de varios pies de largo, aproximadamente aproximado como un tubo de diferentes dimensiones y propiedades físicas¹. A medida que el contenido se mueve a través de su longitud, la función principal del tracto gastrointestinal es absorber sustancias críticas para la vida. El intestino delgado es específicamente responsable de la absorción de nutrientes. El tránsito del intestino delgado está estrechamente regulado para que coincida con las funciones de digestión y absorción, lo que resulta en varios patrones de motilidad. Bayliss y Starling describieron la "ley del intestino"² en 1899, mostrando el programa de propulsión contráctil en el intestino conocido hoy como el reflejo peristáltico; El segmento proximal al bolo alimentario se contrae para impulsarlo hacia adelante, y el segmento distal se relaja para recibirlo. En teoría, este patrón por sí solo podría ser suficiente para transportar material por vía oral, pero más de un siglo de investigación ha pintado una imagen más compleja de la actividad contráctil en el tracto gastrointestinal. En humanos se reconocen tres períodos de motilidad del intestino delgado: el complejo motor migratorio (MMC), el período de ayuno y el período postprandial³. Los mismos patrones han sido reportados en ratones ^4,5. El MMC es un patrón motor cíclico conservado en la mayoría de los mamíferos ^6,7. La MMC tiene un patrón característico de cuatro fases que sirve como un marcador clínico útil en los trastornos gastrointestinales funcionales⁷. Las cuatro fases, en orden de ocurrencia, son (I) inactividad, (II) contracciones irregulares de baja amplitud, (III) contracciones regulares de alta amplitud y (IV) período de reducción de la actividad decreciente⁷. La MMC marca el patrón motor principal del período de ayuno³. Las MMC del período de ayuno aclaran el contenido del intestino delgado en preparación para la próxima comida.

Los patrones motores del período postprandial están optimizados para las funciones digestivas y absorbentes³. Independientemente de la composición calórica, el tránsito inicial es rápido a lo largo del intestino delgado, el contenido se extiende a lo largo del intestino y el tránsito posteriormente se ralentiza⁸. La absorción se optimiza aumentando el área de superficie de contacto y ralentizándola para aumentar el tiempo de residencia. Una vez que los nutrientes están dentro de la luz, el patrón dominante consiste en contracciones cercanas (separadas por <2 cm) descoordinadas (contracciones de segmentación), con algunas contracciones superpuestas de gran amplitud que abarcan toda la longitud del intestino delgado (contracciones peristálticas)⁹. Las contracciones de segmentación mezclan el contenido intraluminal en su lugar. Las grandes contracciones peristálticas ocasionales impulsan el contenido hacia el colon.

El momento de esta transición de regreso a las MMC depende del volumen de alimentos y la composición calórica¹⁰. Por lo tanto, el intestino delgado toma muestras de señales luminales para regular cuándo hacer la transición entre los períodos de motilidad. Las señales mecánicas, como las propiedades físicas del contenido luminal¹¹, el volumen luminal y la tensión de la pared, activan las células mecanorreceptoras en la pared GI 12,13,14,15,16. De hecho, el aumento del componente sólido de una comida conduce a un aumento en el tránsito del intestino delgado¹⁷. Especulamos que las propiedades físicas, como el estado líquido o sólido del contenido intraluminal, deben involucrar diferentes mecanorreceptores debido a las diversas fuerzas que generan en la pared GI¹⁸.

El estándar de oro para medir el tránsito GI in vivo en humanos, como en ratones, es el uso de trazadores radiactivos medidos por gammagrafía cuando salen del estómago o transitan a lo largo del colon^19,20. En los mamíferos, las bucles del intestino delgado de manera impredecible, lo que dificulta la obtención de imágenes in vivo de manera confiable, pero se están logrando avances²¹. Además, actualmente hay una falta de herramientas para cuantificar cómo el intestino delgado maneja partículas de diferentes propiedades y tamaños. El punto de partida aquí fue una técnica estándar de oro que estandariza el estudio del tránsito del intestino delgado 22,23,24 y la función de barrera ²². Consiste en gavagar ratones con un material fluorescente, esperando que la motilidad GI transporte el material, extirpando el tracto gastrointestinal, segmentándolo en varias secciones desde el estómago hasta el colon, seccionando y homogeneizando los contenidos intraluminales para la cuantificación de fluorescencia. Hicimos dos mejoras. Primero, alteramos la composición del contenido gavagado para incluir perlas microscópicas fluorescentes para determinar cómo el intestino delgado distribuye las partículas físicas. En segundo lugar, mejoramos la resolución espacial al obtener imágenes de todo el tracto gastrointestinal desde el estómago hasta el colon ex vivo y utilizamos binning de tamaño variable para estandarizar nuestro análisis en animales. Postulamos que esto revela nuevos conocimientos sobre el equilibrio de las contracciones propulsivas versus segmentadas durante la fase postprandial.

Protocolo

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus siglas en inglés) de Mayo Clinic.

1. Configuración

1. Ratones rápidos de 8 a 10 semanas de edad durante 4 h. Proporcionar a los ratones acceso al agua.
   NOTA: Utilizamos ratones machos C57BL / 6J de tipo salvaje para todos los experimentos presentados aquí, pero se pueden realizar en ratones de cualquier cepa, género y genotipo.
2. Enfriar 15 ml de agua destilada en un tubo cónico de 50 ml en un refrigerador a 4 °C.
3. Caliente otros 15 ml de agua destilada en un vaso de precipitados usando una placa caliente con una barra agitadora magnética a aproximadamente 80-90 ° C.
4. Medir 0,5% de metilcelulosa para un total de 30 ml (0,15 g).
5. Agregue suavemente metilcelulosa a 15 ml de agua caliente para que no se aglutine. La solución de metilcelulosa estará turbia durante este proceso.
6. Una vez disuelto, retire el vaso de precipitados de la placa caliente y agregue los 15 ml de agua fría al vaso de precipitados caliente.
7. Colocar en nevera a 4 °C hasta que la solución esté clara, aproximadamente 15-20 min.
8. Cuando esté claro, pesar 3 mg de isotiocianato de rodamina (RITC)-dextrano por 5 ml de solución de metilcelulosa al 0,5% y mezclar para combinar. Esta es la condición líquida en la sección Resultados representativos .
   1. Alternativamente, pesar 25 mg de microesferas de polietileno fluorescente y mezclar con 200 μL de la solución de metilcelulosa hasta que esté bien incorporada. La incorporación completa de microesferas está asegurada por vórtice antes de la sonda nasogástrica. El experimentador debe visualizar la distribución homogénea de microesferas suspendidas en la mezcla.
   2. Como la solución RITC-dextrano es sensible a la luz, refrigere la solución. Prepare la solución RITC-dextrano y la mezcla de microshpere por adelantado y úsela dentro de los 2 meses. Vuelva a suspender la mezcla de microesferas antes de usarla.
      NOTA: Las microesferas de diferentes tamaños se utilizan para estudiar el manejo gastrointestinal de diferentes materiales. En la sección Resultados representativos , demostramos los resultados del uso de microesferas pequeñas (diámetro: 75-90 μm) y más grandes (diámetro: 180-212 μm).

2. Sonda de contenido intraluminal

1. Prepare el sonda nasogástrica conectando una sonda de alimentación de 18 Ga x 50 mm a una jeringa de 1 ml y extrayendo 200 μL de solución RITC o solución de microesfera.
2. Sujetar manualmente al animal en ayunas utilizando la técnica de sujeción con una sola mano²⁵. Consulte la información de la institución sobre las técnicas adecuadas de restricción murina.
3. Inserte suavemente la sonda de alimentación a través de la boca y el esófago del ratón hasta que entre en el estómago.
   NOTA: El paso de sonda es crítico para un experimento exitoso. Requiere manos experimentadas que puedan insertar consistentemente el tubo aproximadamente a la misma distancia en cada ratón. Este paso debe ser estandarizado por los experimentadores que llevan a cabo el protocolo. El mismo experimentador debe hacer gavage todas las cohortes de ratones que se compararán entre sí.
4. Expulse lentamente el contenido de la jeringa hacia el estómago y retire con cuidado el tubo del ratón.
5. Siguiendo el gavage, devuelve el ratón a la jaula.
6. Deseche el tubo nasogásico.
7. Repita el proceso según sea necesario para el número deseado de animales.

3. Disección intestinal

1. Antes de comenzar las disecciones, encienda el instrumento de imágenes in vivo para permitir que alcance la temperatura.
2. Sacrifica el ratón 30 minutos después del sonda nasogástrica. Use la inhalación de dióxido de carbono para sacrificar al ratón, seguida de una dislocación cervical para garantizar una eutanasia exitosa.
3. Después de confirmar la eutanasia exitosa, coloque el ratón en posición supina en una etapa de disección y fije sus cuatro apéndices en el escenario para tener acceso al abdomen. Mojar la superficie del abdomen con etanol al 70% para mojar los pelos abdominales.
4. Use pinzas de microdisección (# 5) para tirar de la piel y adquirir tijeras quirúrgicas afiladas para hacer una incisión transversal a 1 cm por encima del ano. Para exponer la cavidad intraperitoneal, continúe la incisión verticalmente hacia arriba del abdomen hasta la caja torácica.
5. Mueva suavemente el ciego hacia la izquierda con las pinzas de microdisección para exponer el colon distal.
6. Cortar el colon distal con tijeras de microdisección justo proximal al recto.
7. Desenrede suavemente el colon, el ciego y el intestino delgado tirando lentamente en la dirección opuesta.
   NOTA: Mantener los intestinos disecados en un segmento continuo creará la mayor facilidad para el investigador. Las rasgaduras y desgarros a lo largo del segmento harán que los pasos posteriores sean más difíciles.
8. Use tijeras de microdisección para cortar proximal al estómago.
9. Use fórceps para transferir los intestinos disecados a la hoja de medición (Figura 1). Coloque el estómago a 0 mm y coloque los intestinos a lo largo de la regla hasta 200 mm. Use tijeras de microdisección para cortar a 200 mm. Repita este proceso de alineación de los intestinos de 0 mm a 200 mm a lo largo de las reglas mientras permanece seguro de que la orientación de los intestinos no se confunde.
   1. Tenga cuidado de evitar estirar los intestinos mientras se alinea con las reglas.
10. Una vez que el tejido esté dispuesto en la regla, coloque el ciego de modo que esté paralelo con el tejido pero no en contacto directo con él (si se encuentra fluorescencia dentro de esa región, entonces se necesitará una clara distinción de diferencia entre el ciego y los intestinos).
11. Coloque la hoja de medición con el tejido diseccionado en un área oscura para que la fluorescencia se pueda preservar hasta que sea hora de obtener imágenes.

4. Imágenes ex vivo

1. Abra el software de imágenes in vivo e inicie sesión.
2. Inicialice el instrumento de imagen para que esté listo para la adquisición de imágenes.
3. Establezca los campos 'Excitación' y 'Emisión' en el color correspondiente utilizado para el talón o el sonda RITC. Rojo (líquido): excitación 535 nm /emisión 600 nm. Verde (microesferas): excitación 465 nm /emisión 520 nm.
4. Establezca la exposición en 'Auto'.
5. Seleccione el campo de visión.
6. Antes de colocar la hoja de medición en el instrumento, asegúrese de que los intestinos no se hayan desplazado durante el transporte.
7. Coloque la hoja de medición en el instrumento dentro del campo de visión.
8. Cierre de forma segura la puerta del instrumento y seleccione Instantánea para fotografiar el campo de visión.
9. Guarde las imágenes recopiladas en una unidad flash para su análisis. Guarde capturas individuales de las imágenes fluorescentes y fotográficas. Una superposición de la fotografía y la fluorescencia indica la ubicación del material fluorescente en el tracto gastrointestinal (Figura 1).
   NOTA: Se recomienda guardar los archivos en el formato Archivo de imagen de etiqueta (.tif) para el procesamiento posterior.

5. Análisis

1. Abra los archivos de imagen fluorescente y fotográfica en un software de edición de imágenes.
2. Ajuste el tamaño de píxel de ambas imágenes para que tengan exactamente las mismas dimensiones (nuestra convención era establecer ambas imágenes en 1280 píxeles por 850 píxeles [altura x anchura]).
3. Cierre el archivo de fotografía. Los siguientes pasos implican solo la imagen fluorescente.
4. Utilice una herramienta de borrador para eliminar el fondo y hacerlo transparente. Es posible que se necesite un borrador para eliminar parches del fondo restante.
5. Cree una nueva capa. Conviértalo en un fondo completamente negro para la señal fluorescente. Esto se puede lograr eligiendo un relleno negro para la capa y arrastrando la capa para que quede debajo de la capa con la imagen fluorescente.
6. Guarde la nueva imagen fluorescente, que contiene solo la señal fluorescente sobre un fondo negro, como un nuevo archivo .tif.
7. Abra las nuevas imágenes fluorescentes y fotográficas en ImageJ.
8. Convierta cada imagen en una imagen de 32 bits eligiendo Imagen > Tipo > 32 bits.
9. Cree una imagen combinada de ambos seleccionando Imagen > Color > Combinar canales. En el cuadro de diálogo que se abre, seleccione el archivo de fotografía para el canal gris y el archivo fluorescente debajo de cualquier canal de color.
10. Desactive la escala de la imagen combinada seleccionando Analizar > Establecer escala > Haga clic para quitar escala.
11. Seleccione la herramienta "Rectángulo" en ImageJ.
12. Dibuje un rectángulo alrededor de una sección del intestino delgado. Preste mucha atención al ancho de esta región de interés (ROI), ya que debe permanecer constante entre todos los ROI. El valor nominal no es esencial, solo que se mantiene consistente en todos los ROI dibujados en esta imagen [dado que el intestino delgado se hace cargo de varias filas, los ROI individuales se dibujarán sobre cada sección del intestino delgado en una fila diferente (Figura 1)]. La figura 2 muestra la ubicación del valor de ancho en la barra de herramientas ImageJ.
13. Duplique el ROI seleccionando Imagen > Duplicar. Seleccione sólo el canal correspondiente al canal de color.
14. Utilice la herramienta rectangular de nuevo para dibujar un ROI sobre toda la nueva imagen.
15. Recupere un perfil de la fluorescencia seleccionando Analizar > perfil de trazado. El gráfico resultante traza en el eje y la intensidad promedio de cada píxel a lo largo de la longitud del ROI. Esto se seleccionó en el paso 5.12 para ser la longitud de la sección analizada del intestino delgado
16. Abra la lista de valores y cópielos en un software de hoja de cálculo.
17. Repita los pasos 5.12-5.16 para cada sección del intestino delgado en una fila de regla diferente. Siga pegando los valores en el mismo archivo de hoja de cálculo inmediatamente debajo de cada conjunto anterior de valores, de modo que todas las filas continuas de esa columna contengan el valor de intensidad promedio para toda la longitud del intestino delgado.
18. En el software de hoja de cálculo, multiplique cada valor de intensidad promedio por el ancho constante del rectángulo ROI creado en el paso 5.12. Esto producirá el valor de intensidad real a lo largo del intestino delgado en cada punto.
    NOTA: Diferentes animales tendrán ligeras variaciones en la longitud del intestino delgado. Para evitar que las diferencias de longitud afecten el resultado del análisis de datos posteriores, la cadena de valores de intensidad debe agruparse en un número constante de contenedores en todas las muestras experimentales (la Figura 3, la Figura 4 y la Figura 5 muestran los resultados para tres tamaños de contenedores).
19. Divida el número de valores de intensidad por el número de contenedores deseados. El cociente resultante S determina el número de valores de intensidad que se incluyen en cada contenedor.
20. Determine el contenedor donde irá cada valor de intensidad sin procesar utilizando una fórmula de resumen. Este paso coloca cada valor de intensidad sin procesar en un contenedor. Cada valor de intensidad sin procesar se indexa cronológicamente con el entero N. El cociente N/S determina el número de bin asignado a cada valor bruto. La fórmula de redondeo debe redondear este cociente a un número entero sin decimales.
21. Genere el valor de cada contenedor mediante una fórmula averageif. El objetivo es promediar los valores brutos asignados a un contenedor específico en el Paso 5.20. Por lo tanto, los argumentos en la fórmula deben ser: (1) contenedores asignados generados en el Paso 5.20, (2) número de bin, (3) valores de intensidad sin procesar.
    NOTA: El primer análisis que podemos realizar en los datos agrupados es un análisis del centro geométrico, que cuantifica hasta qué punto observamos la mayor intensidad fluorescente a lo largo del intestino delgado (Figura 4).
22. Normalice cada valor de intensidad sobre la intensidad fluorescente total. En otras palabras, divide cada valor de intensidad por la suma de todas las intensidades.
23. Multiplique cada valor normalizado por el número de bin. El producto refleja el peso relativo de cada contenedor, contribuyendo a la intensidad fluorescente total.
24. La suma de todos los valores generados en el Paso 5.23 produce el número de contenedor en el centro de la señal fluorescente. Divide por el número de contenedores para expresar el centro geométrico como la fracción del intestino delgado recorrida por el centro fluorescente.
    NOTA: Para reflejar la distribución espacial de la señal, el siguiente paso es generar el espectro de potencia del conjunto de datos de intensidad binned (Figura 5).
25. Abra un asistente de transformada rápida de Fourier (FFT) en el software de hoja de cálculo. Seleccione la entrada como el conjunto de datos agrupados y la salida como un conjunto vacío del mismo número de filas que las bandejas.
26. Extraiga el componente de valor real del FFT.
27. Eleva cada valor real de la FFT a la segunda potencia. Esto produce un conjunto de datos de espectros de potencia.
28. Seleccione la primera mitad del conjunto de datos de espectros de potencia y muévalo para que quede por debajo de la segunda mitad. Esto tiene el efecto de centrar los espectros de potencia alrededor de la frecuencia central cuando se traza en el siguiente paso.
29. Trazar los espectros de potencia en el eje y de un gráfico x-y donde los valores del eje x son el rango de -1 x (número de contenedores/2) a (número de contenedores/2) -1. En el caso de 1000 contenedores, los valores del eje oscilarían entre -500 y 499.
30. Los espectros de potencia para cada animal deben compararse sobre la base de la propagación de picos distintos de cero y las alturas de estos picos distintos de cero.

Resultados

Mostramos resultados representativos desde el Paso 3 en adelante. La Figura 1 muestra los intestinos explantados intactos, con mediciones fluorescentes superpuestas. El estómago (púrpura) se coloca a lo largo del mismo eje que el intestino delgado (naranja), pero preferimos mover el ciego (azul) hacia un lado para evitar la superposición con el intestino grueso (naranja). Como se evidencia en el panel izquierdo, esto no siempre es posible debido al tamaño del órgano. Cortamos el intesti...

Discusión

El tracto gastrointestinal, al igual que otros órganos tubulares, como los vasos sanguíneos, requiere sensores mecánicos y efectores para mantener la homeostasis^26,27,28. Sin embargo, el tracto gastrointestinal es único en el sentido de que las propiedades físicas de los materiales que lo atraviesan no son constantes a lo largo de las comidas. Los contenidos intraluminales de diversas propiedades físicas (sólido, líquido...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	664	other mice can be used with this protocol
Dissection tools	n/a	n/a
Excel software	Microsoft	n/a	used for spreadsheet analysis
Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 75-90um - 10g	Cospheric	UVPMS-BG-1.00 75-90um - 10g	"smaller beads" in the manuscript
Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 180-212um - 10g	Cospheric	UVPMS-BG-1.00 180-212um - 10g	"larger beads" in the manuscript
Gavage needles	Instech	FTP-18-50-50
ImageJ software	n/a	n/a	used to extract fluorescence profile
Laminated ruler paper (prepared in-house)	n/a	n/a
Methyl cellulose (viscosity: 400 cP)	Sigma	M0262
Photoshop software	Adobe	n/a	used for image processing
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran	Sigma	r8881-100mg	"liquid" condition in the manuscript
Xenogen IVIS 200	Perkin Elmer	124262	In vivo imaging system