Studio del meccanorilevamento murino dell'intestino tenue del particolato luminale

Riepilogo

Per studiare come l'intestino tenue gestisce particelle di varie dimensioni, abbiamo modificato un metodo stabilito in vivo per determinare il transito dell'intestino tenue.

Abstract

La motilità gastrointestinale (GI) è fondamentale per la normale digestione e assorbimento. Nell'intestino tenue, che assorbe i nutrienti, la motilità ottimizza la digestione e l'assorbimento. Per questo motivo, alcuni dei modelli di motilità nell'intestino tenue includono la segmentazione per la miscelazione dei contenuti luminali e la peristalsi per la loro propulsione. Le proprietà fisiche dei contenuti luminali modulano i modelli di motilità dell'intestino tenue. La stimolazione meccanica dei circuiti meccanosensoriali GI mediante il transito dei contenuti luminali e della motilità intestinale sottostante avvia e modula complessi schemi motori GI. Tuttavia, i meccanismi meccanosensoriali che guidano questo processo rimangono poco conosciuti. Ciò è dovuto principalmente alla mancanza di strumenti per sezionare come l'intestino tenue gestisce materiali di diverse proprietà fisiche. Per studiare come l'intestino tenue gestisce particelle di varie dimensioni, abbiamo modificato un metodo stabilito in vivo per determinare il transito dell'intestino tenue. Gavage topi vivi con liquido fluorescente o minuscole perline fluorescenti. Dopo 30 minuti, sezioniamo le viscere per visualizzare la distribuzione del contenuto fluorescente su tutto il tratto gastrointestinale. Oltre alle misurazioni ad alta risoluzione del centro geometrico, utilizziamo il binning di dimensioni variabili e l'analisi spettrale per determinare in che modo i diversi materiali influenzano il transito dell'intestino tenue. Abbiamo esplorato come un meccanismo di "tocco intestinale" recentemente scoperto influisce sulla motilità dell'intestino tenue usando questo approccio.

Introduzione

Il tratto gastrointestinale umano (GI) è un sistema di organi lungo più piedi, approssimativamente approssimato come un tubo di varie dimensioni e proprietà fisiche¹. Mentre il contenuto si muove attraverso la sua lunghezza, la funzione primaria del tratto gastrointestinale è quella di assorbire sostanze critiche per la vita. L'intestino tenue è specificamente responsabile dell'assorbimento dei nutrienti. Il transito dell'intestino tenue è strettamente regolato per abbinare le funzioni di digestione e assorbimento, con conseguente vari modelli di motilità. Bayliss e Starling descrissero la "legge dell'intestino"² nel 1899, mostrando il programma di propulsione contrattile nell'intestino noto oggi come riflesso peristaltico; Il segmento prossimale al bolo alimentare si contrae per spingerlo in avanti e il segmento distale si rilassa per riceverlo. In teoria, questo modello da solo potrebbe essere sufficiente per trasportare materiale abortivamente, ma oltre un secolo di ricerca ha dipinto un quadro più complesso dell'attività contrattile nel tratto gastrointestinale. Nell'uomo sono riconosciuti tre periodi di motilità dell'intestino tenue: il complesso motorio migrante (MMC), il periodo di digiuno e il periodo postprandiale³. Gli stessi modelli sono stati riportati nei topi ^4,5. La MMC è un modello motorio ciclico conservato nella maggior parte dei mammiferi ^6,7. La MMC ha un caratteristico pattern a quattro fasi che funge da utile marcatore clinico nei disturbi gastrointestinali funzionali⁷. Le quattro fasi, in ordine di occorrenza, sono (I) quiescenza, (II) contrazioni irregolari a bassa ampiezza, (III) contrazioni regolari ad alta ampiezza e (IV) periodo di rampa dell'attività decrescente⁷. L'MMC segna il principale modello motorio del periodo di digiuno³. Le MMC del periodo di digiuno chiariscono il contenuto dell'intestino tenue in preparazione del pasto successivo.

I modelli motori del periodo postprandiale sono ottimizzati per le funzioni digestive e assorbenti³. Indipendentemente dalla composizione calorica, il transito iniziale è rapido lungo l'intestino tenue, il contenuto viene distribuito lungo la lunghezza dell'intestino e il transito successivamente rallenta⁸. L'assorbimento è ottimizzato aumentando la superficie di contatto e rallentandola per aumentare il tempo di permanenza. Una volta che i nutrienti sono all'interno del lume, il modello dominante consiste in contrazioni ravvicinate (<2 cm di distanza) non coordinate (contrazioni segmentanti), con alcune contrazioni sovrapposte di grande ampiezza che coprono l'intera lunghezza dell'intestino tenue (contrazioni peristaltiche)⁹. Le contrazioni segmentanti mescolano i contenuti intraluminali in posizione. Le occasionali grandi contrazioni peristaltiche spingono il contenuto verso il colon.

La tempistica di questa transizione verso MMC dipende dal volume del cibo e dalla composizione calorica¹⁰. Pertanto, l'intestino tenue campiona segnali luminali per regolare quando passare tra i periodi di motilità. I segnali meccanici, come le proprietà fisiche del contenuto luminale¹¹, il volume luminale e la tensione della parete, impegnano le cellule meccanorecettrici nella parete GI 12,13,14,15,16. Infatti, aumentare la componente solida di un pasto porta ad un aumento del transito dell'intestino tenue¹⁷. Ipotizziamo che le proprietà fisiche, come lo stato liquido o solido dei contenuti intraluminali, debbano impegnare diversi meccanorecettori a causa delle varie forze che generano sulla parete GI¹⁸.

Il gold standard per misurare il transito GI in vivo nell'uomo, come nei topi, è l'uso di traccianti radioattivi misurati mediante scintigrafia mentre escono dallo stomaco o transitano lungo il colon^19,20. Nei mammiferi, l'intestino tenue si muove in modi imprevedibili rendendo l'intestino tenue difficile da visualizzare in vivo in modo affidabile, ma si stanno facendo progressi²¹. Inoltre, attualmente mancano strumenti per quantificare come l'intestino tenue gestisce particolati di varie proprietà e dimensioni. Il punto di partenza qui è stata una tecnica gold standard che standardizza lo studio del transito dell'intestino tenue 22,23,24 e della funzione barriera ²². Consiste nel gavagare topi con un materiale fluorescente, in attesa della motilità gastrointestinale per trasportare il materiale, asportando il tratto gastrointestinale, segmentandolo in diverse sezioni dallo stomaco al colon, sezionando e omogeneizzando il contenuto intraluminale per la quantificazione della fluorescenza. Abbiamo apportato due miglioramenti. In primo luogo, abbiamo modificato la composizione del contenuto gavaged per includere perline microscopiche fluorescenti per determinare come l'intestino tenue distribuisce il particolato fisico. In secondo luogo, abbiamo migliorato la risoluzione spaziale visualizzando l'intero tratto gastrointestinale dallo stomaco al colon ex vivo e abbiamo utilizzato il binning di dimensioni variabili per standardizzare la nostra analisi tra gli animali. Ipotizziamo che questo riveli nuove intuizioni sull'equilibrio delle contrazioni propulsive rispetto a quelle segmentanti durante la fase postprandiale.

Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Mayo Clinic.

1. Configurazione

1. Topi veloci da 8 a 10 settimane per 4 ore. Fornire ai topi l'accesso all'acqua.
   NOTA: Utilizziamo topi C57BL / 6J maschi wild-type per tutti gli esperimenti presentati qui, ma possono essere eseguiti su topi di qualsiasi ceppo, sesso e genotipo.
2. Raffreddare 15 mL di acqua distillata in un tubo conico da 50 mL in frigorifero a 4 °C.
3. Riscaldare altri 15 ml di acqua distillata in un becher utilizzando una piastra riscaldante con una barra di agitazione magnetica a circa 80-90 °C.
4. Misura 0,5% metilcellulosa per un totale di 30 ml (0,15 g).
5. Aggiungere delicatamente la metilcellulosa a 15 ml di acqua calda in modo che non si aggreghi. La soluzione di metilcellulosa sarà torbida durante questo processo.
6. Una volta sciolto, rimuovere il becher dalla piastra riscaldante e aggiungere i 15 ml di acqua refrigerata al becher caldo.
7. Mettere in frigorifero a 4 °C fino a quando la soluzione è limpida, circa 15-20 min.
8. Quando limpido, pesare 3 mg di isotiocianato di rodamina (RITC)-destrano per 5 ml di soluzione di metilcellulosa allo 0,5% e mescolare per combinare. Questa è la condizione liquida nella sezione Risultati rappresentativi .
   1. In alternativa, pesare 25 mg di microsfere fluorescenti di polietilene e mescolare con 200 μL della soluzione di metilcellulosa fino a quando non è ben incorporato. L'incorporazione completa delle microsfere è assicurata dal vortice prima del gavage. Lo sperimentatore deve visualizzare una distribuzione omogenea delle microsfere sospese nella miscela.
   2. Poiché la soluzione RITC-destrano è sensibile alla luce, refrigerare la soluzione. Preparare in anticipo la soluzione RITC-destrano e la miscela di microshpere e utilizzare entro 2 mesi. Risospendere la miscela di microsfere prima dell'uso.
      NOTA: Microsfere di varie dimensioni vengono utilizzate per studiare la manipolazione gastrointestinale di materiali diversi. Nella sezione Risultati rappresentativi , dimostriamo i risultati dell'utilizzo di microsfere piccole (diametro: 75-90 μm) e più grandi (diametro: 180-212 μm).

2. Gavage del contenuto intraluminale

1. Preparare la sonda gastrica collegando un tubo di alimentazione da 18 Ga x 50 mm a una siringa da 1 mL e aspirando 200 μL di soluzione RITC o soluzione di microsfere.
2. Trattenere manualmente l'animale a digiuno usando la tecnica di ritenuta con una sola mano²⁵. Fare riferimento alle informazioni dell'istituzione sulle corrette tecniche di contenzione murina.
3. Inserire delicatamente il tubo di alimentazione attraverso la bocca e l'esofago del topo fino a quando non entra nello stomaco.
   NOTA: il passaggio gavage è fondamentale per un esperimento di successo. Richiede mani esperte in grado di inserire costantemente il tubo all'incirca alla stessa distanza in ciascun mouse. Questo passaggio deve essere standardizzato dagli sperimentatori che eseguono il protocollo. Lo stesso sperimentatore dovrebbe sondare tutte le coorti di topi che saranno confrontate tra loro.
4. Espellere lentamente il contenuto della siringa nello stomaco e rimuovere con attenzione il tubo dal mouse.
5. Dopo il gavage, riportare il topo nella gabbia.
6. Smaltire il tubo di gavage.
7. Ripetere il processo secondo necessità per il numero desiderato di animali.

3. Dissezione intestinale

1. Prima di iniziare le dissecazioni, accendere lo strumento di imaging in vivo per consentirgli di raggiungere la temperatura.
2. Sacrificare il mouse 30 minuti dopo il gavage. Utilizzare l'inalazione di anidride carbonica per sacrificare il topo, seguita da dislocazione cervicale per garantire il successo dell'eutanasia.
3. Dopo aver confermato il successo dell'eutanasia, posiziona il topo in posizione supina su uno stadio di dissezione e appunta le sue quattro appendici sul palco per avere accesso all'addome. Bagnare la superficie dell'addome con etanolo al 70% per bagnare i peli addominali.
4. Utilizzare una pinza da micro-dissezione # 5 per tirare la pelle e acquisire forbici chirurgiche affilate per fare un'incisione trasversale 1 cm sopra l'ano. Per esporre la cavità intraperitoneale, continuare l'incisione verticalmente sull'addome fino alla gabbia toracica.
5. Spostare delicatamente il cieco a sinistra con la pinza da micro-dissezione per esporre il colon distale.
6. Tagliare il colon distale con le forbici da microdissezione appena prossimali al retto.
7. Sbrogliare delicatamente il colon, il cieco e l'intestino tenue tirando lentamente nella direzione opposta.
   NOTA: Mantenere le viscere sezionate in un segmento continuo creerà la massima facilità per lo sperimentatore. Strappe e strappi lungo il segmento renderanno più difficili i passaggi successivi.
8. Utilizzare forbici da microdissezione per tagliare prossimalmente allo stomaco.
9. Utilizzare una pinza per trasferire le viscere sezionate sul foglio di misurazione (Figura 1). Posizionare lo stomaco a 0 mm e disporre le viscere lungo il righello fino a 200 mm. Utilizzare forbici da microdissezione per tagliare a 200 mm. Ripeti questo processo di allineamento delle viscere da 0 mm a 200 mm lungo i righelli rimanendo sicuro che l'orientamento delle viscere non si confonda.
   1. Fai attenzione a evitare di allungare le viscere mentre ti allinei ai righelli.
10. Una volta che il tessuto è disposto sul righello, disporre il cieco in modo che sia parallelo al tessuto ma non in contatto diretto con esso (se si trova una fluorescenza all'interno di quella regione, allora sarà necessaria una chiara distinzione di differenza tra il cieco e l'intestino).
11. Posizionare il foglio di misurazione con il tessuto sezionato in un'area scura in modo che la fluorescenza possa essere conservata fino al momento dell'immagine.

4. Imaging ex vivo

1. Aprire il software di imaging in vivo e accedere.
2. Inizializzare lo strumento di imaging in modo che sia pronto per l'acquisizione delle immagini.
3. Impostare i campi 'Eccitazione' ed 'Emissione' sul colore corrispondente utilizzato per il tallone o il gavage RTC. Rosso (liquido): eccitazione 535 nm / emissione 600 nm. Verde (microsfere): eccitazione 465 nm / emissione 520 nm.
4. Imposta l'esposizione su "Auto".
5. Selezionare il campo visivo.
6. Prima di inserire il foglio di misurazione nello strumento, assicurarsi che l'intestino non si sia spostato durante il trasporto.
7. Posizionare il foglio di misura nello strumento all'interno del campo visivo.
8. Chiudere saldamente lo sportello dello strumento e selezionare Istantanea per fotografare il campo visivo.
9. Salva le immagini raccolte su un'unità flash per l'analisi. Salva le singole acquisizioni delle immagini fluorescenti e fotografiche. Una sovrapposizione della fotografia e della fluorescenza indica la posizione del materiale fluorescente nel tratto gastrointestinale (Figura 1).
   NOTA: si consiglia di salvare i file nel formato Tag Image File (.tif) per l'elaborazione a valle.

5. Analisi

1. Aprire i file di immagine fluorescenti e fotografati in un software di modifica delle immagini.
2. Regola la dimensione in pixel di entrambe le immagini in modo che abbiano esattamente le stesse dimensioni (la nostra convenzione era di impostare entrambe le immagini su 1280 pixel per 850 pixel [altezza x larghezza]).
3. Chiudere il file della fotografia. I passaggi seguenti riguardano solo l'immagine fluorescente.
4. Utilizzare uno strumento gomma per rimuovere lo sfondo e renderlo trasparente. Potrebbe essere necessaria una gomma per rimuovere le patch dello sfondo rimanente.
5. Create un nuovo livello. Rendilo uno sfondo completamente nero per il segnale fluorescente. Ciò può essere ottenuto scegliendo un riempimento nero sul livello e trascinando il livello sotto il livello con l'immagine fluorescente.
6. Salvate la nuova immagine fluorescente, contenente solo il segnale fluorescente su sfondo nero, come nuovo file .tif.
7. Aprire le nuove immagini fluorescenti e fotografare in ImageJ.
8. Trasforma ogni immagine in un'immagine a 32 bit scegliendo Immagine > Digitare > 32 bit.
9. Create un'immagine unita di entrambi scegliendo Immagine > Colore > Unisci canali. Nella finestra di dialogo visualizzata, selezionate il file della fotografia per il canale grigio e il file fluorescente sotto i canali colorati.
10. Disattivate la scala dell'immagine unita selezionando Analizza > Imposta scala > Fare clic per rimuovere scala.
11. Selezionare lo strumento "Rettangolo" in ImageJ.
12. Disegna un rettangolo attorno a una sezione dell'intestino tenue. Presta molta attenzione all'ampiezza di questa regione di interesse (ROI), poiché dovrebbe rimanere costante tra tutti i ROI. Il valore nominale non è essenziale, solo che è mantenuto coerente tra tutti i ROI disegnati su questa immagine [poiché l'intestino tenue occupa diverse righe, i singoli ROI verranno disegnati su ciascuna sezione dell'intestino tenue in una riga diversa (Figura 1)]. Nella Figura 2 viene illustrata la posizione del valore della larghezza nella barra degli strumenti di ImageJ.
13. Duplica il ROI selezionando Immagine > Duplica. Selezionare solo il canale corrispondente al canale colorato.
14. Usa di nuovo lo strumento rettangolo per disegnare un ROI su tutta la nuova immagine.
15. Recuperare un profilo della fluorescenza selezionando Analizza > Profilo di tracciatura. Il grafico risultante traccia sull'asse y l'intensità media per ciascun pixel lungo la lunghezza del ROI. Questo è stato selezionato nel passaggio 5.12 per essere la lunghezza della sezione analizzata dell'intestino tenue
16. Apri l'elenco dei valori e copiali in un software per fogli di calcolo.
17. Ripetere i passaggi 5.12-5.16 per ogni sezione dell'intestino tenue su una riga di righello diversa. Continua a incollare i valori sullo stesso file di foglio di calcolo immediatamente sotto ogni set precedente di valori, in modo che tutte le righe continue in quella colonna contengano il valore di intensità media per l'intera lunghezza dell'intestino tenue.
18. Nel software del foglio di calcolo, moltiplicare ogni valore di intensità media per la larghezza costante del rettangolo ROI creato nel passaggio 5.12. Questo produrrà il valore di intensità reale lungo l'intestino tenue in ogni punto.
    NOTA: diversi animali avranno lievi variazioni sulla lunghezza dell'intestino tenue. Per evitare che le differenze di lunghezza influiscano sul risultato dell'analisi dei dati a valle, la stringa di valori di intensità deve essere collegata in un numero consistente di contenitori in tutti i campioni sperimentali (i risultati della Figura 3, della Figura 4 e della Figura 5 visualizzano i risultati per tre dimensioni dei contenitori).
19. Dividere il numero di valori di intensità per il numero di contenitori desiderati. Il quoziente S risultante determina il numero di valori di intensità inclusi in ciascun contenitore.
20. Determinare il contenitore in cui andrà ogni valore di intensità non elaborato utilizzando una formula di arrotondamento. Questo passaggio inserisce ogni valore di intensità non elaborato in un contenitore. Ogni valore di intensità grezzo è indicizzato cronologicamente con il numero intero N. Il quoziente N/S determina il numero di bin assegnato a ciascun valore non elaborato. La formula di arrotondamento deve arrotondare questo quoziente a un numero intero senza decimali.
21. Generare il valore per ogni raccoglitore utilizzando una formula averageif. L'obiettivo è fare la media dei valori grezzi assegnati a un contenitore specifico nel passaggio 5.20. Quindi, gli argomenti nella formula dovrebbero essere: (1) contenitori assegnati generati nel passaggio 5.20, (2) numero di bin, (3) valori di intensità grezzi.
    NOTA: La prima analisi che possiamo eseguire sui dati binned è un'analisi geometrica del centro, che quantifica fino a che punto osserviamo la massima intensità fluorescente lungo l'intestino tenue (Figura 4).
22. Normalizzare ogni valore di intensità sull'intensità fluorescente totale. In altre parole, dividere ogni valore di intensità per la somma di tutte le intensità.
23. Moltiplicare ogni valore normalizzato per il numero bin. Il prodotto riflette il peso relativo di ciascun contenitore, contribuendo all'intensità totale della fluorescenza.
24. Sommando tutti i valori generati nel passaggio 5.23 si ottiene il numero bin al centro del segnale fluorescente. Dividere per il numero di contenitori per esprimere il centro geometrico come la frazione di intestino tenue percorsa dal centro fluorescente.
    NOTA: Per riflettere la distribuzione spaziale del segnale, il passo successivo consiste nel generare lo spettro di potenza del set di dati sull'intensità binned (Figura 5).
25. Aprire una procedura guidata FFT (Fast Fourier Transform) nel software del foglio di calcolo. Selezionare l'input come set di dati associato e l'output come set vuoto dello stesso numero di righe dei raccoglitori.
26. Estrarre il componente del valore reale della FFT.
27. Aumentare ogni valore reale della FFT alla seconda potenza. Questo produce un set di dati di spettri di potenza.
28. Selezionare la prima metà del set di dati degli spettri di potenza e spostarlo in modo che si trovi al di sotto della seconda metà. Questo ha l'effetto di centrare gli spettri di potenza attorno alla frequenza centrale quando viene tracciata nel passo successivo.
29. Tracciare gli spettri di potenza sull'asse y di un grafico x-y dove i valori dell'asse x sono l'intervallo da -1 x (numero di bin/2) a (numero di bin/2) -1. Nel caso di 1000 contenitori, i valori degli assi sarebbero compresi tra -500 e 499.
30. Gli spettri di potenza per ciascun animale dovrebbero essere confrontati sulla base della diffusione di picchi diversi da zero e delle altezze di questi picchi diversi da zero.

Risultati

Mostriamo risultati rappresentativi dalla fase 3 in poi. La figura 1 mostra le viscere espiantate intatte, con misurazioni fluorescenti sovrapposte. Lo stomaco (viola) è disposto lungo lo stesso asse dell'intestino tenue (arancione), ma preferiamo spostare il cieco (blu) di lato per evitare sovrapposizioni con l'intestino crasso (arancione). Come evidenziato nel pannello di sinistra, questo non è sempre possibile a causa delle dimensioni dell'organo. Tagliamo l'intestino tenue a ~ 200 mm p...

Discussione

Il tratto gastrointestinale, come altri organi tubulari, come i vasi sanguigni, richiede sensori meccanici ed effettori per mantenere l'omeostasi^26,27,28. Tuttavia, il tratto gastrointestinale è unico in quanto le proprietà fisiche dei materiali che lo attraversano non sono costanti tra i pasti. Contenuti intraluminali di varie proprietà fisiche (solido, liquido e gas) transitano nell'intestino, generando diversi input meccan...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	664	other mice can be used with this protocol
Dissection tools	n/a	n/a
Excel software	Microsoft	n/a	used for spreadsheet analysis
Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 75-90um - 10g	Cospheric	UVPMS-BG-1.00 75-90um - 10g	"smaller beads" in the manuscript
Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 180-212um - 10g	Cospheric	UVPMS-BG-1.00 180-212um - 10g	"larger beads" in the manuscript
Gavage needles	Instech	FTP-18-50-50
ImageJ software	n/a	n/a	used to extract fluorescence profile
Laminated ruler paper (prepared in-house)	n/a	n/a
Methyl cellulose (viscosity: 400 cP)	Sigma	M0262
Photoshop software	Adobe	n/a	used for image processing
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran	Sigma	r8881-100mg	"liquid" condition in the manuscript
Xenogen IVIS 200	Perkin Elmer	124262	In vivo imaging system