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摘要

我们描述了一种可重复的，自动化的，无偏倚的成像系统，用于使用人类工程骨骼肌组织和光遗传学运动神经元来表征神经肌肉连接功能。该系统允许随着时间的推移对神经肌肉连接进行功能定量，并检测由神经毒素和重症肌无力患者血清引起的神经肌肉功能减弱。

摘要

许多神经肌肉疾病，如重症肌无力（MG），与神经肌肉接头（NMJ）功能障碍有关，由于动物和人类之间的生理差异，这在动物模型中很难表征。组织工程提供了提供功能性人NMJ体 外 模型的机会，可用于诊断和研究NMJ病理学并测试潜在的治疗方法。通过将光遗传学蛋白结合到诱导多能干细胞（iPSCs）中，我们产生了可以用特定波长的光刺激的神经元。如果 NMJ 是健康和功能性的，则来自运动神经元的神经化学信号会导致肌肉收缩。通过将光遗传学和微细加工与组织工程的集成，我们建立了一种无偏倚的自动化方法，用于使用视频分析表征NMJ功能。开发了用于NMJ形成，同时进行视频记录的光学刺激和组织收缩力的视频分析的标准化方案。光刺激光遗传运动神经元以诱导骨骼肌收缩，概括了人 NMJ 生理学，并允许随着时间的推移和响应各种输入对 NMJ 进行重复的功能测量。我们证明了该平台能够随着时间的推移显示神经肌肉连接的功能改进，并表征患者MG抗体或神经毒素对NMJ功能的破坏性影响。

引言

神经肌肉接头（NMJ）是运动神经元（MNs）和骨骼肌细胞（SkM）之间的化学突触，允许肌肉收缩。毒素，如神经毒素α-蹦极毒素（BTX），或神经肌肉疾病（NMD），如重症肌无力（MG），可导致NMJ变性和肌肉控制减少1。生物工程人体组织模型更好地概括了人类NJ的功能和生理机制，并提供比动物模型更大的转化潜力。

虽然动物模型已经推进了对NMJ的形成和功能的理解，但人类和动物突触之间存在显着差异，这限制了结果对人类的翻译，并使NMJ的体内表征具有挑战性2，3，4。研究表明小鼠和人类NJ之间存在明显的生理差异，与人类NJ相比，小鼠具有更大的NJ和更小的活性区密度4。此外，在动物模型中进行的药物研究并不总是反映人体临床试验中发现的效果。工程化的人体组织模型提供了研究NMJ的健康发展和神经肌肉疾病病理学的机会，并允许进行药物筛查。人诱导的多能干细胞（hiPSCs）5可以分化成多种细胞类型，包括骨骼肌细胞6，7和运动神经元8，9。hiPSCs可以很容易地从患者细胞中生成，从而可以通过患者特异性组织模型更好地进行疾病建模10和药物筛选11，12。

SkMs和MNs的二维（2D）单层共培养缺乏生理NJ的形态，表型，组织和功能行为，NMJ在2D培养中随机形成，这抑制了用于分析的运动单元的分离，限制了准确的功能测量，并阻止了它们用于重复的系统实验13.NMJ的三维（3D）组织模型克服了许多这些限制，概括了生理NJ的形态学和功能特征7，14，15，16，17。使用该模型，将两种组织类型分开开发，然后通过引导轴突生长进行整合，与2D培养系统相比，允许更有组织的NMJ发展。

我们之前的研究表明，将光遗传学与组织工程相结合可以实现准确的非侵入性刺激和NMJ功能的评估18，19。通过基因工程，光敏蛋白可以整合到hiPSC的基因组中。将通道视紫红质-2（ChR2）整合到可兴奋细胞（如神经元）的膜中，可以对细胞活化20，21，22进行非接触式时空控制。携带ChR2的hiPSC可以分化成对蓝光敏感的光遗传学运动神经元，消除了对刺激神经元的典型侵入性电极的需求，并避免了电极23对肌肉细胞的不必要的刺激。该系统使用光遗传学运动神经元来刺激非光遗传学骨骼肌细胞中的收缩。结合视频采集和受控蓝光照明，可以同时刺激和记录共培养的组织以实现NMJ功能。

MG是由靶向烟碱乙酰胆碱受体（AChR）的自身抗体引起的，这导致NMJ功能下降和肌肉无力24。根据症状、电诊断和通过血清学血液检查检测自身抗体进行诊断。然而，并非所有参与MG的自身抗体都被鉴定出来，一些血清阴性患者被诊断为MG，但没有公认的抗体25，26。我们的系统允许在添加MG患者血清之前和之后对NMJ进行重复的功能评估，从而为MG抗体18引起的功能和生化变化提供宝贵的见解。我们的协议说明了如何生成功能性人 NMJ 的 3D 体外 模型，该模型可用于诊断和研究 NMJ 病理学并测试潜在的治疗方法。我们在两个平台中展示了该系统的多功能性，一个是微流体装置，另一个是更大的开孔生物反应器平台。

研究方案

这项工作的所有细胞系都是根据美国纽约州哥伦比亚大学的机构指南创建和使用的。

1. 生物反应器制备

  1. 制作生物反应器模具
    1. 从补充 CAD 文件下载生物反应器 CAD 文件 或创建自定义自己的设计。
    2. 使用 CAM 软件从 3D 模型生成 CNC 刀具路径。
    3. 使用CNC铣床加工乙缩醛模具。
  2. 生物反应器的制造
    1. 将10:1的碱混合到聚二甲基硅氧烷（PDMS，每4个平台/模具77克混合物）的固化剂混合物中。
    2. 将混合物放入真空室中，关闭所有阀门，打开真空，并将混合物除气至少30分钟，直到没有气泡残留。将混合物倒入模具中，并在真空室中对模具进行除气1小时。
    3. 将模具的上半部分以正确的方向关闭模具。将钢制六角形杆放在中心上，并在两侧夹紧。
    4. 用 PDMS 重新填充顶部。
    5. 将模具在65°C的烤箱中固化至少4小时。
    6. 冷却至室温后，从模具中取出平台。
    7. 使用1小时周期的洗洁精，400 mL 100%异丙醇和蒸馏水在超声波浴中清洁设备。
    8. 在65°C下干燥过夜。
    9. 将玻璃盖玻片浸泡在1%非离子表面活性剂多元醇中30分钟，并确保盖玻片不会堆叠，以便它们都得到适当的涂层。
    10. 用蒸馏水冲洗干净，并在65°C下干燥过夜。
    11. 使用等离子清洗剂在高处与6 L / min氧气1-2分钟到处理玻璃盖玻片和PDMS平台。处理后，通过将PDMS压在盖玻片上至少30秒，将两者粘合在一起。
    12. 在添加电池之前高压灭菌粘合的设备。

2. 构建光学刺激装置

  1. 使用30毫米笼式立方体系统，在中心安装一个573nm的二向色镜。将红色 627 nm LED 与 594 nm 长通激励滤光片耦合，并将其连接到立方体的顶部，使 LED 面向镜子。然后将带有546 nm短通激励滤波器的蓝色488 nm LED连接到立方体的相邻侧，LED面向镜子，如图 3A中的原理图所示。
  2. 将环形致动虹膜膜片连接到笼子立方体的底部，以控制照明区域的大小。
  3. 通过 T 立方体 LED 驱动器为每个 LED 供电，并通过 Arduino Uno Rev3 板进行控制。将 LED 驱动器的侧输入连接到电源插头，将中间输出连接到 Arduino，并将侧输出直接连接到 LED。
  4. 通过USB电缆将Arduino Uno连接到PC。
  5. 从 GitHub 下载文件链接（https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis）。
  6. 从 GitHub 文件夹中打开"Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino"文件。
  7. 设置起始参数:步数= 30;启动频率 = 0.5;结束频率 = 3;脉冲长度 = 100。
  8. 确保将引脚输出 4 分配给蓝色 LED 驱动器，并将引脚输出 2 分配给红色 LED 驱动器。检查LED驱动器的中间线是否连接到地和相应的引脚输出。
  9. 编译"Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino"程序并将其加载到Arduino。
  10. 将每个 LED 驱动器连接到其相应的通道。

3. 细胞培养设置（第-21-0天）

  1. 原发性骨骼肌细胞
    1. 解冻和扩张初级骨骼肌成形细胞（从库克肌苷石获得），最多使用肌强直生长培养基（+补充剂）进行六次传代。将细胞保持在培养箱中，设置为37°C和5%CO2。
    2. 每 2 天更换一次介质。
    3. 一旦细胞汇合约60%，使用0.05%胰蛋白酶-EDTA（1x，在37°C下5分钟）传代它们。收集解离的细胞并加入新鲜培养基以中和胰蛋白酶。
    4. 以300× g 离心细胞，并在细胞沉淀上方吸出上清液。
    5. 用MGM重悬细胞，并用每个三层烧瓶60mL接种1:3。
  2. 第二代高螺旋体
    注:这项工作的所有细胞系都是根据美国纽约州哥伦比亚大学的机构指南创建和使用的。在该协议中，使用先前描述的方法18通过CRISPR-Cas9基因组编辑产生表达ChR2的高PSC，但任何稳定的光遗传学细胞系（慢病毒，piggyBac等）都可以以相同的方式使用。选择在iPSC和运动神经元中表达的本构启动子（CAG）。这些细胞被发现具有健康的核型，如之前的出版物18，19中所述。
    1. 用在DMEM / F12（1:80）中稀释的1mL /孔的溶解基底膜基质涂覆6孔板，并在室温下孵育板1小时。
    2. 在涂有2mL无饲养层细胞培养基（iPSC培养基）的6孔板上接种iPSC，每隔一天交换2mL培养基，每5-7天传代一次。将细胞保持在设定为37°C和5%CO2的培养箱中。
    3. 传代
      1. 用1 mL无酶干细胞释放试剂孵育4分钟，并用宽吸头P1000移液管机械剪切，使干细胞解离。
      2. 在iPSC培养基中以1:24或1:48的比例将2μM的Y-27632二盐酸盐以2mL /孔的比例接种到涂覆的6孔板上。

4. 骨骼肌组织播种（第-3天）

  1. 使用自动细胞计数器分离并计数30 x 106 个肌母细胞。
  2. 将成肌细胞重悬于3mg / mL胶原I和溶解基底膜基质的4:1混合物中（800μL胶原混合物+ 200μL基底膜基质以达到1 mL的最终体积）。对于胶原蛋白成分，加入随附的中和剂（胶原蛋白与中和剂的9:1混合物）并用1x PBS稀释混合物，以达到800μL的体积。
  3. 向生物反应器的每个肌肉室中加入15μL细胞 - 胶原蛋白悬浮液，确保使用移液器吸头将悬浮液分散在两个支柱上（图2）。
  4. 让细胞 - 凝胶混合物在37°C下聚合30分钟，然后用450μL肌强直生长培养基填充每个生物反应器井。
  5. 3天后（一旦凝胶压实），开始肌管分化。

5. 肌管分化（第0-14天）

  1. 通过将组织切换到450μL融合诱导培养基（FS， 表1）7天开始肌管输注，每隔一天更换一次培养基。
    注意:尝试在从hiPSCs中开始动子神经元分化的同一天开始肌管分化，以便在两种细胞类型的分化时间表结束时播种动神经元。
  2. 在第7天将培养基改为450μL成熟培养基Ia（MMIa， 表1）。
  3. 在第9天，换成450μL成熟培养基Ib（MMIb， 表1）。
  4. 在第11天，将培养基改为450μL NbActiv4。每2天更换一次培养基，直到运动神经元播种（步骤7）。

6. 运动神经元分化（第0-14天）

注意:我们的运动神经元微分方案改编自Mauri等人8。

  1. 在第0天，将4×106 ChR2-hiPSC转移到具有15mL动神经元悬浮培养基的超低附着培养皿中（MSCM， 表1）。用3微米CHIR99021，0.2微米LDN193189，40微米SB431542水合物和5微米Y-27632二盐酸盐补充MSCM。
  2. 在第2天，用37μM可逆过滤器分离神经球（NS），并用3μM CHIR99021，0.2μM LDN193189，40μM SB431542水合物和0.1μM视黄酸重新铺在15mLMSCM中。NS应该在培养皿中可见，而无需在第2天后使用显微镜。
  3. 在第4天，将细胞和培养基转移到50mL管中，并使神经球沉降到底部（5分钟）。吸出上清液并将细胞重悬于15mLMSCM中，其中补充有0.5μM SAG，0.2μM LDN193189，40μM SB431541和0.1μM视黄酸。
  4. 在第7天，重复步骤6.3。但将细胞重悬于15mL补充0.5μM SAG和0.1μM视黄酸的MSCM中。
  5. 在第 9 天，重复步骤 6.3。但将细胞重悬于15mL补充10μM DAPT的MSCM中。
  6. 在第 11 天，重复步骤 6.3。但将细胞重悬于15毫升补充有20纳克/毫升溴化因子和10纳克/毫升二甲基神经因子的MSCM中。
  7. 在第14天，将动车放入平台。

7. 在生物反应器中播种动神经元聚集体（第14天）

  1. 准备2mg / mL胶原蛋白I和基质胶的4:1凝胶混合物（800μL胶原蛋白混合物+ 200μL基质胶以达到1 mL的最终体积）。对于胶原蛋白成分，加入随附的中和剂（9:1胶原蛋白与中和剂的混合物）并用1x PBS稀释混合物，以达到800μL的最终体积。
  2. 使用400nm细胞过滤器选择大的神经球并将它们重悬于凝胶混合物中。
  3. 从储层中吸出培养基，并从神经球孔小心地吸出介质（图2）。
  4. 将15μL凝胶混合物加入神经球通道中。
  5. 将10 μL移液管与10 μL凝胶上样，然后选择一个神经球。
  6. 将 NS 沉积到神经球通道中，并确保 NS 位于腔室中。缓慢抬起移液器，同时释放剩余的凝胶，一旦NS沉积。如果不确定NS是否正确沉积，请使用显微镜检查其位置。
  7. 让凝胶在37°C下聚合30分钟。
  8. 向储液槽中加入 450 μL 补充 20 纳克/毫升溴化因子和 10 纳克/毫升 GDNF 的 NbActiv4。
  9. 每隔一天更换一次培养基，以允许轴突从NS生长到肌肉组织。

8. NMJ功能同步光学刺激和录像（第24天以上）

  1. 对于成像，使用带有科学互补金属氧化物半导体（sCMOS）相机的倒置荧光显微镜。
  2. 将相机软件合并设置为2x2，曝光设置为20 ms，卷帘快门打开，读出速率设置为540 MHz，动态范围:12位>增益1，传感器模式:重叠。
  3. 在显微镜上使用2x物镜对微孔残留物进行成像。
  4. 将活细胞室（37°C，5%CO2）连接到显微镜载物台。
  5. 选择包含受支配骨骼组织组织的感兴趣区域 （ROI），以最小化文件大小和处理时间。
  6. 在样品和成像物镜之间放置一个594 nm长通发射滤光片，以滤除来自相机的蓝光脉冲。
  7. 将包含4个生物反应器（24个组织）的矩形4孔板放入活细胞室中。
  8. 单击 实时视图。以所需的投资回报率对图像进行居中和对焦。
  9. 从 GitHub 文件夹（https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis）上传自定义宏代码，以控制舞台位置、Arduino 板和视频采集。
  10. 将输出影片设置为:day_tissue group_tissue name_experiment.nd2。
  11. 在舞台上设置所需的 X，Y 坐标运行宏代码，并以 50 帧/秒的速度获得 1700 帧的快速延时。
  12. 成像后更换培养基，并将样品放回培养箱。在图像采集会话之间至少等待24小时，以避免组织疲劳。

9. 批处理和分析（第 24 天以上）

  1. 电影处理
    1. 使用自定义 MATLAB 代码在批量分析中处理视频。可以从 GitHub 文件夹（https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis）下载这些文件。表 2 中列出并解释了这些函数。
      注意:代码与 .nd2 和 .czi 格式兼容。它需要在 MATLAB 中激活并行处理，并且需要生物格式包。
    2. 运行递归OS分析脚本，通过并行处理对影片进行分析。将所有获取的视频放在同一文件夹中，并在运行代码时选择该文件夹。
    3. 根据需要调整分析后参数。
      1. 如果在记录开始时拾取自发收缩，则更改 基线时间 （选项 1）。这将显示高于 0 的初始读数方式，并且需要移动帧以进行补偿。
      2. 如果未登记收缩，则更改 峰值阈值 （选项 2）。默认情况下，代码将检测高于最高峰 25% 的收缩，以便可以更改此值。
      3. 更改 最小显著度 和 最小敏宽 ，以在检测每个峰值的开始时调整灵敏度。
    4. 生成视频和图形输出。
      1. 运行递归OSMovie为每个组织生成一个视频文件及其各自的收缩性轨迹。

10. NMJ 函数的扰动（第 24 天+）

  1. 通过在补充有20纳克/毫升BDNF和10纳克/毫升GDNF的NbActiv4基础培养基中加入外部效应器来制备治疗培养基。
    1. 对于MG血清实验，在NBActiv4 + BDNF + GDNF中使用20%的MG患者血清。
    2. 对于BTX实验，在免疫活性4 + 生物密度纤维瘤病 + 二苯丁基甲基苯丙酮中使用5微克/毫升的乙二醇。
  2. 使用步骤3.2刺激/图像。以记录基线。
  3. 用处理培养基（450μL/组织）替换组织中的培养基。
  4. 孵育所需的时间（患者血清48小时，BTX为20分钟）。
  5. 使用步骤3.2再次刺激/图像。记录治疗后的功能。
  6. 取出治疗培养基，让组织静置所需的时间（去除血清后48小时）
    注意:刺激和成像之间至少间隔24小时，以避免组织疲劳

结果

通过共培养光遗传学hiPSC衍生的运动神经元与非光遗传学骨骼肌组织而产生神经肌肉接头。将人类原发性骨骼肌母细胞（SkM）播种到平台中，并使用2周方案分化成多核肌管。光遗传学动神经元单独分化，但与肌管分化平行，然后播种到平台中（图1）。MN播种后7-12天，组织开始在蓝光刺激下收缩，表明NMJs的成功发育和成熟。在动车神经元接种后，NMJ可以培养，刺激和成像长?...

讨论

该系统是一种工程3D人体组织模型，结合了光遗传学和视频处理，可实现NMJ功能的自动化和无偏倚评估。使用标准化方案，我们已经证明了在生理发育过程中测量NMJ功能变化的能力，并表征了神经毒素暴露和重症肌无力患者血清等病理的破坏性影响。

以前的研究已经报道了使用MG患者血清22在与骨骼肌管共培养中模拟MG与光遗传学hPSC衍生的动神经元的能力。?...

披露声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

我们非常感谢NIH[拨款编号EB025765和EB027062]，国防部[奖励编号W81XWH-18-1-0095]以及UCSF通过工程进行健康创新（HIVE奖学金）的资助支持。我们非常感谢哥伦比亚大学干细胞核心在细胞重编程方面的帮助和指导。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Cells
SkMDCCook MyositeP01059-14M
Media and Supplements
Advanced DMEM/F12ThermoFisher Scientific12634-020
Bovine Serum Albumin solutionMillipore SigmaA9576-50ML
G-5 Supplement (100X)ThermoFisher Scientific17503-012
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)ThermoFisher Scientific10131-035
Insulin, Recombinant HumanMillipore Sigma91077C-100MG
MatrigelCorning354277
mTeSR PlusStem Cell Technologies100-0276
MyoTonic Growth Media KitCook MyositeMK-4444
N-2 SupplementThermoFisher Scientific17502-048
NbActiv4 500 mLBrainBits LLCNb4-500
Neurobasal MediumThermoFisher Scientific21103-049
Neurobasal-A MediumThermoFisher ScientificA13710-01
Pluronic F-127Sigma AldrichP2443
ReLeSRStem Cell Technologies5872
Plasticware
30 mm cage cube systemThorLabsCM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4
37 µm Reversible Strainer, largeStem Cell Technologies27250
546 nm short-pass excitation filterSemrockFF01-546/SP-25
573 nm dichroic mirrorSemrockFF573-Di01–25x36
594 nm long- pass emission filterSemrockBLP01-594R-25
594 nm long-pass excitation filterSemrockBLP01-594R-25
Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mALuxeonStarLEDsSP-05-B4
Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic - Integrated LegsLuxeonStarLEDs10413
Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture DishCorning3261
Heat sinkLuxeonStarLEDsLPD-19-10B
Optics
pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterilePluriSelect43-50400-03
pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterilePluriSelect43-50500-03
Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mALuxeonStarLEDsSP-05-R5
ring-actuated iris diaphragmThorLabsSM1D12D
T-Cube LED driversThorLabsLEDD1B, KPS101
Molds
Female Threaded Hex Standoffs,  3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2"McMaster91920A046
Low-Profile C-ClampMcMaster1705A12
Growth Factors
Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphateMillipore SigmaA9501-1G
CHIR 99021, 10 mgTocris4423/10
DAPT 10 mgR&D Systems2634/10
Human CNTF, research grade, 5 µgMiltenyl Biotec130-096-336
Human Vitronectin Protein, CFR&D Systems2349-VN-100
Human Vitronectin Protein, CFR&D Systems2349-VN-100
IGF1 Recombinant Human ProteinThermoFisher ScientificPHG0078
Laminin mouse protein, naturalThermoFisher Scientific23017015
Recombinant Human Agrin ProteinR&D Systems6624-AG-050
Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ugR&D Systems212-GD-050/CF
Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ugCell SciencesCRN500D
Recombinant Human Neurotrophin-4Cell SciencesCRN501B
Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-TerminusR&D Systems1845-SH-100
Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ugPeprotech450-02
Retinoic Acid, 50 mgMillipore SigmaR2625-50
SAG Smoothened AgonistMillipore Sigma566660
SB431542 10 mgStem Cell Technologies72234
StemMACS LDN-193189Miltenyl Biotec130-103-925
Vitronectin from human plasmaMillipore SigmaV8379-50UG
Y-27632 dihydrochlorideTocris1254
Antibodies
α-actinin mAb (Mouse IgG1)Abcamab9465
Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat)MilliporeAB144P
Desmin mAb (Mouse IgG1)DakoM076029-2
Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b)DSHBMF20
Equipment
Arduino Uno R3ArduinoA000066
Automated stageApplied scientific instrumentationMS- 2000 XYZ
Expanded plasma cleanerHarrick PlasmaPDC-001 (115V)
Invitrogen Countess Automated Cell CounterMarshal ScientificI-CACC
IX-81 Inverted fluorescence microscopeOlympusIX-ILL100LH
Series Stage Top Incubator SystemTokai Hit STXTOKAI-HIT-STXG
Zyla 4.2 sCOMS CameraAndor TechnologyZYLA-4.2P-CL10
Software
Arduino Software (IDE)ArduinoIDE 1.8.19
MastercamMastercamMastercam for Solidworks
MatlabMatlabR2021b
NIS elementsNikonBasic Research
Solidworks 3D CADSolidworksSolidworks Standard

参考文献

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