JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מתארים מערכת הדמיה ניתנת לשחזור, אוטומטית ובלתי משוחדת לאפיון תפקוד צומת נוירומוסקולרי באמצעות רקמת שרירי שלד מהונדסת אנושית ומוטונורונים אופטוגנטיים. מערכת זו מאפשרת כימות תפקודי של קישוריות עצבית-שרירית לאורך זמן ומזהה ירידה בתפקוד העצבי-שרירי הנגרמת על ידי נוירוטוקסינים וסרום המטופלים myasthenia gravis.

Abstract

מחלות נוירומוסקולריות רבות, כגון myasthenia gravis (MG), קשורות לתפקוד לקוי של הצומת הנוירומוסקולרי (NMJ), שקשה לאפיין אותו במודלים של בעלי חיים בשל הבדלים פיזיולוגיים בין בעלי חיים לבני אדם. הנדסת רקמות מציעה הזדמנויות לספק מודלים במבחנה של NMJs אנושיים פונקציונליים שניתן להשתמש בהם כדי לאבחן ולחקור פתולוגיות NMJ ולבדוק טיפולים פוטנציאליים. על-ידי שילוב חלבונים אופטוגנטיים בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), יצרנו נוירונים שיכולים להיות מגורה עם אורכי גל ספציפיים של אור. אם ה- NMJ בריא ומתפקד, אות נוירוכימי מהמוטונורון גורם להתכווצות שרירים. באמצעות שילוב של אופטוגנטיקה ומיקרו-פבריקציה עם הנדסת רקמות, הקמנו מתודולוגיה בלתי משוחדת ואוטומטית לאפיון תפקודי NMJ באמצעות ניתוח וידאו. פותח פרוטוקול סטנדרטי להיווצרות NMJ, גירוי אופטי עם הקלטת וידאו סימולטנית, וניתוח וידאו של התכווצות רקמות. גירוי של מוטונים אופטוגנטיים על ידי אור כדי לגרום להתכווצויות שרירי השלד משחזר את הפיזיולוגיה האנושית של NMJ ומאפשר מדידות תפקודיות חוזרות ונשנות של NMJ לאורך זמן ובתגובה לקלטים שונים. אנו מדגימים את יכולתה של פלטפורמה זו להראות שיפורים תפקודיים בקישוריות הנוירומוסקולרית לאורך זמן ולאפיין את ההשפעות המזיקות של נוגדני MG או טטוקסינים עצביים בחולים על תפקוד NMJ.

Introduction

הצומת הנוירומוסקולרי (NMJ) הוא הסינפסה הכימית בין מוטונרונים (MNs) לתאי שריר השלד (SkM) המאפשרת התכווצות שרירים. רעלנים, כגון נוירוטוקסין α-בונגארוטוקסין (BTX), או מחלות נוירומוסקולריות (NMD) כמו מיאסתניה גרביס (MG) יכולים להוביל לניוון של NMJ ולהפחתה בשליטה בשרירים1. מודלים של רקמות אנושיות מהונדסות ביולוגית משחזרים טוב יותר את המנגנונים התפקודיים והפיזיולוגיים של NMJs אנושיים ומציעים פוטנציאל תרגומי גדול יותר מאשר מודלים של בעלי חיים.

בעוד שמודלים של בעלי חיים קידמו את ההבנה של היווצרות ותפקוד ה- NMJ, ישנם הבדלים משמעותיים בין סינפסות של בני אדם ובעלי חיים המגבילים את תרגום התוצאות לבני אדם והופכים את אפיון in vivo של NMJ למאתגר 2,3,4. מחקרים הראו הבדלים פיזיולוגיים מובהקים בין NMJs של עכברים לבני אדם. לעכברים יש NMJs גדולים יותר וצפיפות אזורים פעילים קטנה יותר בהשוואה ל-NMJs4 אנושיים. בנוסף, מחקרים תרופתיים שנערכו במודלים של בעלי חיים לא תמיד משקפים את ההשפעות שנמצאו בניסויים קליניים בבני אדם. מודלים מהונדסים של רקמות אנושיות מספקים את ההזדמנות לחקור את ההתפתחות הבריאה של NMJ ואת הפתולוגיה של מחלות נוירומוסקולריות ולאפשר הקרנות תרופות. תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם (hiPSCs)5 יכולים להתמיין למגוון סוגי תאים, כולל תאי שריר השלד 6,7 ומוטונורונים 8,9. hiPSCs יכולים להיווצר בקלות מתאי המטופל, מה שמאפשר מודלים טובים יותר של מחלות10 ובדיקת תרופות11,12 באמצעות מודלים של רקמות ספציפיות לחולה.

תרבויות חד-שכבתיות דו-ממדיות (2D) של SkMs ו-MNs חסרות את המורפולוגיה, הפנוטיפ, הארגון וההתנהגות התפקודית של NMJs פיזיולוגיים. NMJs נוצרים באופן אקראי בתרבית דו-ממדית, מה שמעכב את הבידוד של יחידות מוטוריות לניתוח, מגביל מדידות תפקודיות מדויקות ומונע את השימוש בהן לניסויים חוזרים ושיטתיים13 . מודלים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) של רקמות NMJs מתגברים על רבות מהמגבלות הללו, ומשחזרים את המאפיינים המורפולוגיים והתפקודיים של NMJs פיזיולוגיים 7,14,15,16,17. באמצעות מודל זה, שני סוגי הרקמות מפותחים בנפרד ולאחר מכן משולבים על ידי הכוונת הצמיחה האקסונלית, מה שמאפשר לפתח NMJs מאורגנים יותר בהשוואה למערכות תרביות דו-ממדיות.

המחקר הקודם שלנו הראה כי שילוב של אופטוגנטיקה עם הנדסת רקמות יכול לאפשר גירוי לא פולשני מדויק והערכה של תפקוד NMJ18,19. באמצעות הנדסה גנטית, חלבונים רגישים לאור יכולים להיות משולבים בגנום של hiPSCs. שילוב channelrhodopsin-2 (ChR2), תעלת יונים הנפתחת בתגובה לאור כחול, לתוך הממברנה של תאים נרגשים כגון נוירונים מאפשרת שליטה מרחבית-טמפורלית ללא מגע על הפעלת התא 20,21,22. hiPSCs הנושאים ChR2 ניתנים להבחנה למוטונורונים אופטוגנטיים הרגישים לאור כחול, ובכך מבטלים את הצורך באלקטרודות פולשניות טיפוסיות הממריצות נוירונים ונמנעים מגירוי לא רצוי של תאי השריר על ידי אלקטרודות23. מערכת זו משתמשת במוטונורונים אופטוגנטיים כדי לעורר התכווצויות בתאי שרירי שלד שאינם אופטוגנטיים. שילוב של רכישת וידאו ותאורת אור כחול מבוקרת מאפשר לעורר ולהקליט בו-זמנית את הרקמות שעברו תרבית משותפת לתפקוד NMJ.

MG נגרמת על ידי נוגדנים עצמיים המכוונים נגד קולטני אצטילכולין ניקוטיניים (AChR), מה שמביא לירידה בתפקוד NMJ ולחולשת שרירים24. הוא מאובחן על סמך הסימפטומים המוצגים, אלקטרודיאגנוזה וזיהוי נוגדנים עצמיים באמצעות בדיקות דם סרולוגיות. עם זאת, לא כל נוגדנים עצמיים המעורבים ב- MG זוהו, וחלק מהחולים הסרונגטיביים מאובחנים עם MG אך ללא נוגדנים מוכרים 25,26. המערכת שלנו מאפשרת הערכה תפקודית חוזרת ונשנית של ה- NMJ לפני ואחרי הוספת הסרום ממטופלי MG, ומספקת תובנה שלא תסולא בפז לגבי השינויים התפקודיים והביוכימיים הנגרמים על ידי נוגדני MG18. הפרוטוקול שלנו ממחיש כיצד לייצר מודלים תלת-ממדיים במבחנה של NMJ אנושי תפקודי שניתן להשתמש בהם כדי לאבחן ולחקור פתולוגיות של NMJ ולבדוק טיפולים פוטנציאליים. אנו מדגימים את הרבגוניות של המערכת בשתי פלטפורמות, התקן מיקרופלואידי ופלטפורמת ביו-ריאקטורים גדולה יותר עם באר פתוחה.

Protocol

כל קווי התאים לעבודה זו נוצרו ונעשה בהם שימוש בהתאם להנחיות המוסדיות של אוניברסיטת קולומביה, ניו יורק, ארה"ב.

1. הכנת ביוריאקטורים

  1. הכינו תבניות ביוריאקטורים
    1. הורד קובץ CAD של bioreactor מקובץ ה- CAD המשלים או צור עיצוב מותאם אישית.
    2. צור נתיב כלים CNC מהמודל התלת-ממדי באמצעות תוכנת CAM.
    3. תבניות אצטליות מכונה באמצעות מכונת כרסום CNC.
  2. ייצור ביוריאקטורים
    1. מערבבים תערובת של 10:1 לתערובת חומרי ריפוי של פולידימתילסילוקסן (PDMS, 77 גרם של תערובת לכל 4 פלטפורמות/תבניות).
    2. מכניסים את התערובת לתא ואקום, סוגרים את כל השסתומים, מפעילים את הוואקום ומבטלים את הגז של התערובת למשך 30 דקות לפחות עד שלא יישארו בועות אוויר. יוצקים את התערובת לתבניות ומוציאים גז מהתבניות בתא הוואקום למשך שעה אחת.
    3. סגור את התבניות עם החצי העליון של התבנית בכיוון הנכון. מניחים מוט משושה מפלדה מעל המרכז ומהדקים משני הצדדים.
    4. מלאו מחדש את החלק העליון ב-PDMS.
    5. יש לרפא את התבניות בתנור של 65 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות לפחות.
    6. הסר את הפלטפורמות מהתבניות לאחר הקירור לטמפרטורת החדר.
    7. נקו את המכשירים באמבטיה קולית באמצעות מחזור של שעה אחת של סבון כלים, 400 מ"ל של 100% איזופרופנול ומים מזוקקים.
    8. יבש לילה ב 65 °C (86 °F).
    9. השרו את כיסויי הזכוכית בפוליאול פעילי שטח לא-יוניים במשך 30 דקות, והקפידו שהכיסויים לא ייערמו כך שכולם יהיו מצופים כראוי.
    10. יש לשטוף היטב במים מזוקקים ולייבש למשך הלילה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס.
    11. השתמשו בחומר ניקוי פלזמה גבוה עם 6 ליטר/דקה של חמצן למשך דקה-2 דקות לכיסויי הזכוכית ולפלטפורמת PDMS לטיפול. לאחר הטיפול, קשרו את השניים זה לזה על ידי לחיצה על ה-PDMS כלפי מטה על הכיסוי למשך 30 שניות לפחות.
    12. יש להשתמש באופן אוטומטי במכשירים המחוברים לפני הוספת תאים.

2. בניית מערך גירוי אופטי

  1. באמצעות מערכת קוביות כלוב 30 מ"מ, חברו למרכז מראה דיכרואית של 573 ננומטר. הצמידו נורית LED אדומה של 627 ננומטר עם מסנן עירור ארוך של 594 ננומטר והצמידו אותו לצד העליון של הקובייה, כאשר ה-LED פונה למראה. לאחר מכן חברו נורית LED כחולה של 488 ננומטר עם מסנן עירור קצר-מעבר של 546 ננומטר לצד הסמוך של הקובייה, כאשר ה-LED פונה אל המראה כפי שמוצג בשרטוט באיור 3A.
  2. חברו דיאפרגמה של קשתית המופעלת בטבעת לתחתית קוביית הכלוב כדי לשלוט בגודל האזור המואר.
  3. הפעל כל נורית LED על ידי דרייבר T-Cube LED ובקרה באמצעות לוח Arduino Uno Rev3. חבר את הקלט הצדדי של מנהל ההתקן LED לתקע מקור חשמל, חבר את הפלט האמצעי ל- Arduino וחבר את יציאת הצד ישירות לנורות ה- LED.
  4. חבר את Arduino Uno למחשב על ידי כבל USB.
  5. הורד קבצים מקישור GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis).
  6. פתח את הקובץ "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" מתיקיית GitHub.
  7. הגדרת פרמטרים התחלתיים: שלבים = 30; startFrequency = 0.5; endFrequency = 3; pulseLength = 100.
  8. ודא שפלט פין 4 מוקצה למנהל ההתקן Blue LED ופלט פין 2 מוקצה למנהל ההתקן Red LED. בדוק שהחוטים האמצעיים של מנהל ההתקן LED מחוברים לקרקע וליציאת הפין המתאימה.
  9. הידור וטען את התוכנית "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" לארדוינו.
  10. חבר כל מנהל התקן LED לערוץ המתאים לו.

3. הגדרת תרבית תאים (יום -21-0)

  1. תאי שריר השלד הראשוניים
    1. להפשיר ולהרחיב את המיובלסטים העיקריים של השלד (המתקבלים מ-Cook Myosite) במשך שישה מעברים לכל היותר באמצעות מדיום גדילה מיוטוני (+ תוספת). יש לשמור על תאים באינקובטור המוגדרים ל-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
    2. שנה את המדיה כל יומיים.
    3. ברגע שהתאים נפגשים בכ-60%, העבירו אותם באמצעות 0.05% טריפסין-EDTA (1x, למשך 5 דקות ב-37 מעלות צלזיוס). אספו את התאים המנותקים והוסיפו מדיה טרייה כדי לנטרל את הטריפסין.
    4. סובבו את התאים ב-300x g ושאפו לסופרנטנט שמעל לכדור התא.
    5. החייאת התאים עם MGM וזרע 1:3 עם 60 מ"ל לכל בקבוקון תלת שכבתי.
  2. ChR2-hiPSC
    הערה: כל קווי התאים של עבודה זו נוצרו ונעשה בהם שימוש בהתאם להנחיות המוסדיות של אוניברסיטת קולומביה, ניו יורק, ארה"ב. בפרוטוקול זה, hiPSCs המבטאים ChR2 נוצרו באמצעות עריכת גנום CRISPR-Cas9 באמצעות שיטותשתוארו קודם לכן 18, אך ניתן להשתמש בכל קווי התאים האופטוגנטיים היציבים (lentiviral, piggyBac וכו ') באותו אופן. נבחרו מקדמים מכוננים המתבטאים הן ב-iPSCs והן ב-motoneurons (CAG). התאים נמצאו כבעלי קריוטיפ בריא, כפי שצוין בפרסומים קודמים18,19.
    1. מצפים לוחות 6-באר עם 1 מ"ל / באר של מטריצת קרום מרתף solubilized מדולל DMEM / F12 (1:80) ודגירה את הצלחות בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת.
    2. iPSCs של זרעים על צלחות מצופים של 6 בארות עם 2 מ"ל של מדיום תרבית תאים ללא הזנה (iPSC media), מחליפים 2 מ"ל של מדיה כל יומיים וחולפים כל 5-7 ימים. שמור על תאים באינקובטור המוגדרים ל-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
    3. עובר אורח
      1. נתקו את תאי הגזע על ידי דגירה עם 1 מ"ל של תאי גזע נטולי אנזימים המשחררים ריאגנטים למשך 4 דקות וגזירה מכנית עם קצה רחב P1000 פיפטה.
      2. תאי זרע ביחס של 1:24 או 1:48 במדיית iPSC עם 2 μM של Y-27632 דיהידרוכלוריד ב-2 מ"ל/באר על צלחות מצופות של 6 בארות.

4. זריעת רקמת שריר השלד (יום -3)

  1. בודד וספור 30 x 106 מיובלסטים באמצעות מונה תאים אוטומטי.
  2. בצעו החייאה של המיובלסטים בתערובת של 4:1 של קולגן I במינון 3 מ"ג/מ"ל ומטריצת קרום מרתף מבודדת (800 μL של תערובת קולגן + 200 μL של מטריצת קרום מרתף כדי להגיע לנפח סופי של 1 מ"ל). עבור רכיב הקולגן, מוסיפים את החומר המנטרל הנלווה (תערובת 9:1 של קולגן לחומר מנטרל) ומדללים את התערובת עם 1x PBS כדי להשיג נפח של 800 μL.
  3. הוסיפו 15 μL של תרחיף קולגן-תאי לכל תא שריר של הביו-ריאקטור, והקפידו לפזר את המתלים על פני שני העמודים באמצעות קצה הפיפטה (איור 2).
  4. תנו לתערובת התאים-ג'ל להתפלמר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולאחר מכן מלאו כל ביו-ריאקטור היטב ב-450 μL של מדיית גדילה מיוטונית.
  5. לאחר 3 ימים (לאחר שהג'ל נדחס), התחילו בהבחנה במיוטוב.

5. בידול מיוטוב (ימים 0-14)

  1. התחל עירוי myotube על ידי החלפת רקמות ל 450 μL של מדיה גרימת היתוך (FS, טבלה 1) במשך 7 ימים, שינוי המדיה כל יומיים.
    הערה: נסו להתחיל בהבחנה של מיוטובייט באותו יום כמו התמיינות מוטונרון מ-hiPSCs על מנת לזרוע מוטונורונים בסוף לוחות הזמנים של התמיינות שני סוגי התאים.
  2. ביום 7 שנה את המדיה ל-450 μL של מדיית התבגרות Ia (MMIa, טבלה 1).
  3. ביום התשיעי, החליפו ל-450 μL של מדיית התבגרות Ib (MMIb, טבלה 1).
  4. ביום ה-11, שנו את המדיה ל-450 μL של NbActiv4. המשיכו לשנות את המדיה כל יומיים עד שהמוטונורונים יזרעו (שלב 7).

6. בידול מוטונרון (ימים 0-14)

הערה: פרוטוקול ההבחנה של motoneuron שלנו הותאם מ- Maury et al8.

  1. ביום 0, העבירו 4 x 106 ChR2- hiPSCs לצלחת פטרי עם חיבור נמוך במיוחד עם 15 מ"ל של מדיום תרבית המתלים motoneuron (MSCM, טבלה 1). תוסף MSCM עם 3 μM CHIR99021, 0.2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 הידרט ו-5 μM Y-27632 דיהידרוכלוריד.
  2. ביום השני, לבודד את הנוירוספרות (NS) עם מסננת הפיכה של 37 μM ולחזור בתשובה ב-15 מ"ל של MSCM עם 3 μM CHIR99021, 0.2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 hydrate ו-0.1 μM חומצה רטינואית. NS צריך להיות גלוי בצלחת פטרי ללא שימוש במיקרוסקופ לאחר היום השני.
  3. ביום הרביעי, מעבירים את התאים והמדיה לצינור של 50 מ"ל ומאפשרים לנוירוספרות להתיישב לקרקעית (5 דקות). לשאוף את הסופרנטנט ולהחיות את התאים ב-15 מ"ל של MSCM בתוספת 0.5 μM SAG, 0.2 μM LDN193189, 40 μM SB431541 וחומצה רטינואית של 0.1 μM.
  4. ביום 7, חזור על שלב 6.3. אבל resuspened את התאים ב 15 מ"ל של MSCM בתוספת 0.5 μM SAG ו 0.1μM חומצה רטינואית.
  5. ביום התשיעי, חזור על שלב 6.3. אבל תאים resuspend ב 15 מ"ל של MSCM בתוספת 10 μM DAPT.
  6. ביום ה-11, חזור על שלב 6.3. אבל החייאת התאים ב-15 מ"ל של MSCM בתוספת 20 ננוגרם/מ"ל BDNF ו-10 ננוגרם/מ"ל GDNF.
  7. ביום ה-14, זרעו את המוטונאורונים לתוך הרציף.

7. זריעת אגרגטים של מוטונורונים בביוריאקטור (יום 14)

  1. מכינים תערובת ג'ל 4:1 של 2 מ"ג/מ"ל קולגן I ומטריגל (800 μL של תערובת קולגן + 200 μL של Matrigel כדי להגיע לנפח סופי של 1 מ"ל). עבור רכיב הקולגן, הוסיפו את החומר המנטרל הנלווה (תערובת של 9:1 של קולגן לחומר מנטרל) ודללו את התערובת עם 1x PBS כדי להשיג נפח סופי של 800 μL.
  2. השתמשו במסננת תאים של 400 ננומטר כדי לבחור נוירוספרות גדולות ולהחיות אותן בתערובת הג'ל.
  3. לשאוף מדיה מהמאגר ובזהירות מהנוירוספרה היטב (איור 2).
  4. מוסיפים 15 μL של תערובת ג'ל לתעלה הנוירוספרית.
  5. טען פיפטה של 10 μL עם 10 μL של ג'ל ולאחר מכן בחר נוירוספרה אחת.
  6. להפקיד את ה- NS בערוץ הנוירוספרה ולוודא שה- NS נמצא בתא. לאט לאט להרים את הפיפטה תוך שחרור הג'ל הנותר לאחר הפקדת ה- NS. אם אינך בטוח שה- NS הופקד כראוי, בדוק את מיקומו באמצעות מיקרוסקופ.
  7. אפשרו לג'ל להתפלמר במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  8. הוסיפו למאגרים 450 μL של NbActiv4 בתוספת 20 ננוגרם/מ"ל BDNF ו-10 ננוגרם/מ"ל GDNF.
  9. שנה את המדיה כל יומיים כדי לאפשר צמיחה אקסונאלית מ- NS לרקמת שריר.

8. גירוי אופטי סימולטני והקלטת וידאו של פונקציית NMJ (יום 24+)

  1. להדמיה, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך עם מצלמת מתכת-תחמוצת-מוליך למחצה משלימה מדעית משלימה (sCMOS).
  2. הגדר את התאמת תוכנת המצלמה ל- 2x2, חשיפה ל- 20 אלפיות השנייה, הפעלת תריס מתגלגל, קצב קריאה ל- 540 MHz, טווח דינמי: 12 סיביות ורווח 1, ומצב חיישן: חפיפה.
  3. השתמש במטרת 2x על המיקרוסקופ כדי לדמות את המיקרוטיסים.
  4. חברו תא תא חי (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) לשלב המיקרוסקופ.
  5. בחר את אזור העניין (ROI) המכיל את רקמת רקמות השלד המופנמות כדי למזער את גודל הקובץ ואת זמן העיבוד.
  6. מקם מסנן פליטה ארוך של 594 ננומטר בין הדגימה לבין מטרת ההדמיה כדי לסנן את פעימות האור הכחול מהמצלמה.
  7. מניחים לוח מלבני בעל 4 בארות המכיל 4 ביוריאקטורים (24 רקמות) לתוך תא התא החי.
  8. לחץ על תצוגה חיה. מרכז וממקד את התמונה בהחזר ההשקעה הרצוי.
  9. העלה את קוד המאקרו המותאם אישית מתיקיית GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) כדי לשלוט במיקום הבמה, בלוח Arduino וברכישת הווידאו.
  10. הגדר סרט פלט כ: day_tissue group_tissue name_experiment.nd2.
  11. הפעל את קוד המאקרו עם קואורדינטות X,Y הרצויות על הבמה וקבל הפסקה מהירה בזמן עם 1700 פריימים ב- 50 פריימים לשנייה.
  12. החלף את המדיה לאחר ההדמיה והחזיר את הדגימות לחממה. אפשרו לפחות 24 שעות בין מפגשי רכישת תמונה כדי למנוע עייפות רקמות.

9. עיבוד וניתוח אצווה (יום 24+)

  1. עיבוד סרטים
    1. השתמש בקוד MATLAB המותאם אישית כדי לעבד את הסרטונים בניתוח אצווה. ניתן להוריד את הקבצים מהתיקיה GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis). הפונקציות מפורטות ומוסברות בטבלה 2.
      הערה: הקוד תואם לתבניות .nd2 ו- .czi. זה דורש עיבוד מקבילי כדי להיות מופעל ב MATLAB וצריך את חבילת bioformats.
    2. הפעל את הסקריפט הרקורסיביOSAnalysis כדי לנתח את הסרטים באמצעות עיבוד מקבילי. בקש את כל סרטוני הווידאו שנרכשו באותה תיקיה ובחר תיקיה זו בעת הפעלת הקוד.
    3. התאם את הפרמטרים שלאחר הניתוח לפי הצורך.
      1. שנה את baselineTime (אפשרות 1) אם הכיווץ הספונטני נקלט בתחילת ההקלטה. פעולה זו תציג קריאה ראשונית הרבה מעל 0 ותצטרך להזיז את המסגרת כדי לפצות על כך.
      2. שנה את peakThreshold (אפשרות 2) אם הצירים אינם רשומים. הקוד יזהה התכווצויות שהן מעל 25% מהשיא הגבוה ביותר כברירת מחדל, כך שניתן יהיה לשנות ערך זה.
      3. שנה את minMinProminence ואת minMinWidth כדי להתאים את הרגישות בעת זיהוי ההתחלה של כל שיא.
    4. צור פלט וידאו וגרף.
      1. הפעל את RECURSIVEOSMovie כדי ליצור קובץ וידאו עבור כל רקמה עם עקבות התכווצות המתאימים שלה.

10. הפרעה לפונקציית NMJ (יום 24+)

  1. הכן את מדיית הטיפול על ידי הוספת אפקטור חיצוני למדיה הבסיסית NbActiv4 בתוספת 20 ננוגרם/מ"ל BDNF ו-10 ננוגרם/מ"ל GDNF.
    1. לניסוי MG sera, השתמש ב-20% MG sera של מטופלים ב-NbActiv4 + BDNF + GDNF.
    2. לניסוי BTX, השתמש ב-5 מיקרוגרם/מ"ל BTX ב-NbActiv4 + BDNF + GDNF.
  2. מגרה/תמונה באמצעות שלב 3.2. כדי להקליט את קו הבסיס.
  3. החליפו את המדיה ברקמות במדיית טיפול (450 μL/רקמה).
  4. דגירה לזמן הרצוי (48 שעות עבור סרה החולה, 20 דקות עבור BTX).
  5. הגרה/תמונה שוב באמצעות שלב 3.2. כדי לתעד את התפקוד לאחר הטיפול.
  6. הסר את אמצעי הטיפול ואפשר לרקמות לנוח לזמן הרצוי (48 שעות לאחר הסרת סרה)
    הערה: אפשר לפחות 24 שעות בין גירוי להדמיה כדי למנוע עייפות רקמות

תוצאות

צמתים נוירומוסקולריים נוצרו על ידי גידול משותף של מוטונורונים שמקורם ב-hiPSC אופטוגנטיים עם רקמת שרירי שלד לא אופטוגנטית. מיובלסטים של שלדיים ראשוניים אנושיים (SkM) נזרעו לפלטפורמות והובחנו למיו-טיובים מרובי גרעינים באמצעות פרוטוקול של שבועיים. המוטונורונים האופטוגנטיים נבדלו בנפרד, אך במק...

Discussion

מערכת זו היא מודל רקמות אנושיות תלת-ממדי מהונדס המשלב אופטוגנטיקה ועיבוד וידאו כדי לאפשר הערכה אוטומטית ובלתי משוחדת של תפקוד NMJ. באמצעות פרוטוקול סטנדרטי, הדגמנו את היכולת למדוד שינויים בתפקוד NMJ במהלך ההתפתחות הפיזיולוגית ולאפיין את ההשפעות המזיקות של פתולוגיות כגון חשיפה לנוירוטוקסי?...

Disclosures

המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.

Acknowledgements

אנו אסירי תודה על תמיכת המימון על ידי ה- NIH [מספרי המענק EB025765 ו- EB027062], DOD [מספר הפרס W81XWH-18-18-1-0095], והחדשנות בבריאות של UCSF באמצעות הנדסה (מלגת HIVE). אנו מודים תודה לליבת תאי הגזע של אוניברסיטת קולומביה על עזרתם והדרכתם בתכנות מחדש של תאים.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Cells
SkMDCCook MyositeP01059-14M
Media and Supplements
Advanced DMEM/F12ThermoFisher Scientific12634-020
Bovine Serum Albumin solutionMillipore SigmaA9576-50ML
G-5 Supplement (100X)ThermoFisher Scientific17503-012
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)ThermoFisher Scientific10131-035
Insulin, Recombinant HumanMillipore Sigma91077C-100MG
MatrigelCorning354277
mTeSR PlusStem Cell Technologies100-0276
MyoTonic Growth Media KitCook MyositeMK-4444
N-2 SupplementThermoFisher Scientific17502-048
NbActiv4 500 mLBrainBits LLCNb4-500
Neurobasal MediumThermoFisher Scientific21103-049
Neurobasal-A MediumThermoFisher ScientificA13710-01
Pluronic F-127Sigma AldrichP2443
ReLeSRStem Cell Technologies5872
Plasticware
30 mm cage cube systemThorLabsCM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4
37 µm Reversible Strainer, largeStem Cell Technologies27250
546 nm short-pass excitation filterSemrockFF01-546/SP-25
573 nm dichroic mirrorSemrockFF573-Di01–25x36
594 nm long- pass emission filterSemrockBLP01-594R-25
594 nm long-pass excitation filterSemrockBLP01-594R-25
Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mALuxeonStarLEDsSP-05-B4
Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic - Integrated LegsLuxeonStarLEDs10413
Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture DishCorning3261
Heat sinkLuxeonStarLEDsLPD-19-10B
Optics
pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterilePluriSelect43-50400-03
pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterilePluriSelect43-50500-03
Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mALuxeonStarLEDsSP-05-R5
ring-actuated iris diaphragmThorLabsSM1D12D
T-Cube LED driversThorLabsLEDD1B, KPS101
Molds
Female Threaded Hex Standoffs,  3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2"McMaster91920A046
Low-Profile C-ClampMcMaster1705A12
Growth Factors
Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphateMillipore SigmaA9501-1G
CHIR 99021, 10 mgTocris4423/10
DAPT 10 mgR&D Systems2634/10
Human CNTF, research grade, 5 µgMiltenyl Biotec130-096-336
Human Vitronectin Protein, CFR&D Systems2349-VN-100
Human Vitronectin Protein, CFR&D Systems2349-VN-100
IGF1 Recombinant Human ProteinThermoFisher ScientificPHG0078
Laminin mouse protein, naturalThermoFisher Scientific23017015
Recombinant Human Agrin ProteinR&D Systems6624-AG-050
Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ugR&D Systems212-GD-050/CF
Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ugCell SciencesCRN500D
Recombinant Human Neurotrophin-4Cell SciencesCRN501B
Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-TerminusR&D Systems1845-SH-100
Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ugPeprotech450-02
Retinoic Acid, 50 mgMillipore SigmaR2625-50
SAG Smoothened AgonistMillipore Sigma566660
SB431542 10 mgStem Cell Technologies72234
StemMACS LDN-193189Miltenyl Biotec130-103-925
Vitronectin from human plasmaMillipore SigmaV8379-50UG
Y-27632 dihydrochlorideTocris1254
Antibodies
α-actinin mAb (Mouse IgG1)Abcamab9465
Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat)MilliporeAB144P
Desmin mAb (Mouse IgG1)DakoM076029-2
Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b)DSHBMF20
Equipment
Arduino Uno R3ArduinoA000066
Automated stageApplied scientific instrumentationMS- 2000 XYZ
Expanded plasma cleanerHarrick PlasmaPDC-001 (115V)
Invitrogen Countess Automated Cell CounterMarshal ScientificI-CACC
IX-81 Inverted fluorescence microscopeOlympusIX-ILL100LH
Series Stage Top Incubator SystemTokai Hit STXTOKAI-HIT-STXG
Zyla 4.2 sCOMS CameraAndor TechnologyZYLA-4.2P-CL10
Software
Arduino Software (IDE)ArduinoIDE 1.8.19
MastercamMastercamMastercam for Solidworks
MatlabMatlabR2021b
NIS elementsNikonBasic Research
Solidworks 3D CADSolidworksSolidworks Standard

References

  1. Al-bassam, W., et al. Characteristics, incidence, and outcome of patients admitted to the intensive care unit with myasthenia gravis. Journal of Critical Care. 45, 90-94 (2018).
  2. Vila, O. F., Qu, Y., Vunjak-Novakovic, G. In vitro models of neuromuscular junctions and their potential for novel drug discovery and development. Expert Opinion on Drug Discovery. 15 (3), 307-317 (2020).
  3. Webster, R. G. Animal models of the neuromuscular junction, vitally informative for understanding function and the molecular mechanisms of congenital myasthenic syndromes. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1326 (2018).
  4. Jones, R. A., et al. Cellular and molecular anatomy of the human neuromuscular junction. Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  6. Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), 126 (2018).
  7. Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 4, 04885 (2015).
  8. Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature Biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).
  9. Bianchi, F., et al. Rapid and efficient differentiation of functional motor neurons from human iPSC for neural injury modelling. Stem Cell Research. 32, 126-134 (2018).
  10. Turan, S., Farruggio, A. P., Srifa, W., Day, J. W., Calos, M. P. Precise correction of disease mutations in induced pluripotent stem cells derived from patients with limb girdle muscular dystrophy. Molecular Therapy. 24 (4), 685-696 (2016).
  11. Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  12. Lin, C. -. Y., et al. iPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases. JCI Insight. 4 (18), (2021).
  13. Centeno, E. G. Z., Cimarosti, H., Bithell, A. 2D versus 3D human induced pluripotent stem cell-derived cultures for neurodegenerative disease modelling. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 27 (2018).
  14. Okano, T., Matsuda, T. Tissue engineered skeletal muscle: preparation of highly dense, highly oriented hybrid muscular tissues. Cell Transplantation. 7 (1), 71-82 (1998).
  15. Powell, C. A., Smiley, B. L., Mills, J., Vandenburgh, H. H. Mechanical stimulation improves tissue-engineered human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (5), 1557-1565 (2002).
  16. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  17. Guo, X., et al. A human-based functional NMJ system for personalized ALS modeling and drug testing. Advanced Therapeutics. 3 (11), 2000133 (2020).
  18. Vila, O. F., et al. Bioengineered optogenetic model of human neuromuscular junction. Biomaterials. 276, 121033 (2021).
  19. Vila, O. F., et al. Quantification of human neuromuscular function through optogenetics. Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).
  20. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  21. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  22. Steinbeck, J. A., et al. Functional connectivity under optogenetic control allows modeling of human neuromuscular disease. Cell Stem Cell. 18 (1), 134-143 (2016).
  23. Santhanam, N., et al. Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose response evaluation of therapeutics. Biomaterials. 166, 64-78 (2018).
  24. Phillips Ii, L. H. The epidemiology of myasthenia gravis. Annals of the New York Academy of Sciences. 998 (1), 407-412 (2003).
  25. Sanders, D. B., et al. Does change in acetylcholine receptor antibody level correlate with clinical change in myasthenia gravis. Muscle & Nerve. 49 (4), 483-486 (2014).
  26. Vernino, S. Unraveling the enigma of seronegative myasthenia gravis. JAMA Neurology. 72 (6), 630-631 (2015).
  27. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. , (2018).
  28. Paredes-Redondo, A., et al. Optogenetic modeling of human neuromuscular circuits in Duchenne muscular dystrophy with CRISPR and pharmacological corrections. Science Advances. 7 (37), (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

182

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved