Engenharia e Caracterização de um Modelo Optogenético da Junção Neuromuscular Humana

Resumo

Descrevemos um sistema de imagem reprodutível, automatizado e imparcial para caracterizar a função de junção neuromuscular usando tecido muscular esquelético projetado por humanos e motoneurons optogenéticos. Este sistema permite a quantificação funcional da conectividade neuromuscular ao longo do tempo e detecta a função neuromuscular diminuída causada por neurotoxinas e soro do paciente myasthenia gravis.

Resumo

Muitas doenças neuromusculares, como a miasthenia gravis (MG), estão associadas à disfunção da junção neuromuscular (NMJ), difícil de caracterizar em modelos animais devido a diferenças fisiológicas entre animais e humanos. A engenharia de tecidos oferece oportunidades para fornecer modelos in vitro de NMJs humanos funcionais que podem ser usados para diagnosticar e investigar patologias do NMJ e testar potenciais terapêuticas. Ao incorporar proteínas optogenéticas em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), geramos neurônios que podem ser estimulados com comprimentos de onda específicos de luz. Se o NMJ estiver saudável e funcional, um sinal neuroquímico do motoneuron resulta em contração muscular. Através da integração da optogenética e microfabagem com a engenharia de tecidos, estabelecemos uma metodologia imparcial e automatizada para caracterização da função NMJ utilizando análise de vídeo. Foi desenvolvido um protocolo padronizado para formação de NMJ, estimulação óptica com gravação simultânea de vídeo e análise de vídeo da contratude tecidual. A estimulação de motoneurons optogenéticos pela luz para induzir contrações musculares esqueléticas recapitula a fisiologia do NMJ humano e permite medições funcionais repetidas de NMJ ao longo do tempo e em resposta a várias entradas. Demonstramos a capacidade desta plataforma de mostrar melhorias funcionais na conectividade neuromuscular ao longo do tempo e caracterizar os efeitos nocivos dos anticorpos do paciente MG ou neurotoxinas na função NMJ.

Introdução

A junção neuromuscular (NMJ) é a sinapse química entre motoneurons (MNs) e células musculares esqueléticas (TLM) que permite contração muscular. Toxinas, como neurotoxina α-bungarotoxina (BTX), ou doenças neuromusculares (DNM) como a miasthenia gravis (MG) podem levar à degeneração do NMJ e reduções no controle muscular¹. Modelos de tecido humano bioengenharia melhor recapituam melhor os mecanismos funcionais e fisiológicos dos NMJs humanos e oferecem maior potencial translacional do que os modelos animais.

Embora os modelos animais tenham avançado o entendimento da formação e função do NMJ, há diferenças significativas entre sinapses humanas e animais que limitam a tradução dos resultados para humanos e fazem com que a caracterização in vivo do NMJ desafie ^2,3,4. Estudos têm mostrado diferenças fisiológicas distintas entre NMJs de camundongos e humanos. Os ratos têm NMJs maiores e densidades de zonas ativas menores quando comparados aos NMJs^{humanos 4}. Além disso, estudos medicamentosos realizados em modelos animais nem sempre refletem os efeitos encontrados em ensaios clínicos em humanos. Modelos de tecido humano projetados proporcionam a oportunidade de estudar o desenvolvimento saudável do NMJ e a patologia das doenças neuromusculares e permitir a triagem de medicamentos. Células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSCs)⁵ podem ser diferenciadas em uma variedade de tipos de células, incluindo células musculares esqueléticas ^6,7 e motoneurons ^8,9. hiPSCs podem ser gerados facilmente a partir de células do paciente, permitindo uma melhor modelagem da doença¹⁰ e triagem de medicamentos^11,12 através de modelos de tecido específicos do paciente.

As co-culturas monocamadas bidimensionais (2D) de SkMs e MNs carecem da morfologia, fenótipo, organização e comportamento funcional de NMJs fisiológicos. Os NMJs formam aleatoriamente na cultura 2D, o que inibe o isolamento de unidades motoras para análise, limita medições funcionais precisas e impede seu uso para experimentos repetidos e sistemáticos¹³ . Modelos tridimensionais (3D) de tecidos de NMJs superam muitas dessas limitações, recapitulando as características morfológicas e funcionais dos NMJs fisiológicos 7,14,15,16,17. Usando este modelo, os dois tipos de tecidos são desenvolvidos separadamente e depois integrados direcionando o crescimento axonal, permitindo que NMJs mais organizados se desenvolvam em comparação com sistemas de cultura 2D.

Nosso estudo anterior demonstrou que a combinação da optogenética com a engenharia de tecidos pode permitir uma estimulação e avaliação precisas não invasivas da função NMJ^18,19. Através da engenharia genética, proteínas sensíveis à luz podem ser integradas ao genoma dos hiPSCs. A integração do canalrhodopsin-2 (ChR2), um canal de íons que se abre em resposta à luz azul, na membrana de células excitáveis, como neurônios, permite o controle espostetemporal não-contato sobre a ativação^celular 20,21,22. hiPSCs portadores de ChR2 podem ser diferenciados em motoneurons optogenéticos sensíveis à luz azul, removendo a necessidade de eletrodos invasivos típicos que estimulam neurônios e evitando estimulação indesejada das células musculares por eletrodos²³. Este sistema usa motoneurons optogenéticos para estimular contrações em células musculares esqueléticas não optogenéticas. A combinação de aquisição de vídeo e iluminação de luz azul controlada permite que os tecidos co-cultivados sejam simultaneamente estimulados e gravados para a função NMJ.

MG é causada por autoanticorpos direcionados aos receptores de acetilcolina nicotínica (AChR), o que resulta na diminuição da função NMJ e fraqueza muscular²⁴. É diagnosticado com base em sintomas apresentados, eletrodiagnósmo e detecção de autoanticorpos através de exames de sangue sorológicos. No entanto, nem todos os autoanticorpos envolvidos em MG foram identificados, e alguns pacientes seronegativos são diagnosticados com MG, mas sem anticorpos reconhecidos^25,26. Nosso sistema permite uma avaliação funcional repetida do NMJ antes e depois da adição de soro de pacientes de MG, fornecendo uma visão inestimável das alterações funcionais e bioquímicas causadas pelos anticorpos^{MG 18}. Nosso protocolo ilustra como produzir modelos in vitro 3D de NMJ humano funcional que podem ser usados para diagnosticar e investigar patologias do NMJ e testar potenciais terapêuticas. Demonstramos a versatilidade do sistema em duas plataformas, um dispositivo microfluido e uma plataforma bioreatorial de poço aberto maior.

Protocolo

Todas as linhas de celular para este trabalho foram criadas e utilizadas em conformidade com as diretrizes institucionais da Columbia University, NY, EUA.

1. Preparação do bioreator

1. Faça moldes bioreatores
   1. Baixe um arquivo CAD bioreator do Arquivo CAD Suplementar ou crie um design próprio personalizado.
   2. Gere um caminho de ferramentas CNC a partir do modelo 3D usando o software CAM.
   3. Moldes acetal da máquina usando uma máquina de fresagem CNC.
2. Fabricação de bioreatores
   1. Misture uma base de 10:1 para curar a mistura de agente de polidimtilsiloxano (PDMS, 77 g de mistura por 4 plataformas/moldes).
   2. Coloque a mistura em uma câmara de vácuo, feche todas as válvulas, ligue o vácuo e desaprova a mistura por pelo menos 30 minutos até que não permaneçam bolhas de ar. Despeje a mistura em moldes e desafose os moldes na câmara de vácuo por 1h.
   3. Feche os moldes com a metade superior do molde na orientação correta. Coloque uma haste hexagonal de aço sobre o centro e aperte em ambos os lados.
   4. Reabastecer a parte superior com PDMS.
   5. Cure os moldes em um forno de 65 °C por pelo menos 4 h.
   6. Remova as plataformas dos moldes depois de esfriar até a temperatura ambiente.
   7. Limpe os dispositivos em um banho ultrassônico usando ciclos de 1h de sabão de prato, 400 mL de isopropanol 100% isopropanol e água destilada.
   8. Seque durante a noite a 65 °C.
   9. Mergulhe as tampas de vidro em poliol surfactante noniônico de 1% por 30 minutos, e certifique-se de que as tampas não empilham para que todas estejam devidamente revestidas.
   10. Enxágüe bem com água destilada e seque durante a noite a 65 °C.
   11. Use um limpador de plasma no alto com 6 L/min de oxigênio durante 1-2 min para as tampas de vidro e plataforma PDMS. Uma vez tratado, unindo os dois pressionando o PDMS para baixo na tampa por pelo menos 30 s.
   12. Autoclave os dispositivos ligados antes de adicionar células.

2. Construindo uma configuração de estimulação óptica

1. Usando um sistema de cubos de gaiola de 30 mm, conecte um espelhodicróico de 573 nm no centro. Junte um LED vermelho de 627 nm com um filtro de excitação de passagem longa de 594 nm e conecte-o na parte superior do cubo, com o LED voltado para o espelho. Em seguida, conecte um LED azul de 488 nm com um filtro de excitação de passe curto de 546 nm ao lado adjacente do cubo, com o LED voltado para o espelho como mostrado no esquema na Figura 3A.
2. Conecte um diafragma de íris acionado a anel ao fundo do cubo da gaiola para controlar o tamanho da área iluminada.
3. Ligue cada LED por um driver LED T-Cube e controle através de uma placa Arduino Uno Rev3. Conecte a entrada lateral do driver LED a um plugue de fonte de alimentação, conecte a saída média ao Arduino e conecte a saída lateral diretamente aos LEDs.
4. Conecte o Arduino Uno a um PC por um cabo USB.
5. Baixe arquivos do link do GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis).
6. Abra o arquivo "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" da pasta GitHub.
7. Definir parâmetros de partida: Passos = 30; startFrequency = 0,5; endFrequency = 3; pulsoLength = 100.
8. Certifique-se de que a saída do pino 4 seja atribuída ao driver LED Azul e a saída do pino 2 seja atribuída ao driver LED vermelho. Verifique se os fios médios do driver LED estão conectados ao solo e à respectiva saída do pino.
9. Compilar e carregar o programa "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" para Arduino.
10. Conecte cada driver LED ao canal correspondente.

3. Configuração da cultura celular (dia -21-0)

1. Células musculares esqueléticas primárias
   1. Descongele e expanda os myoblasts esqueléticos primários (obtidos de Cook Myosite) para um máximo de seis passagens usando meio de crescimento miotônico (+ suplemento). Manter as células em uma incubadora definidas a 37 °C e 5% de CO₂.
   2. Mude a mídia a cada 2 dias.
   3. Uma vez que as células são cerca de 60% confluentes, passá-las usando 0,05% Trypsin-EDTA (1x, por 5 min a 37 °C). Colete as células dissociadas e adicione mídia fresca para neutralizar a trippsina.
   4. Gire as células a 300 x g e aspire o supernatante acima da pelota celular.
   5. Resuspenque as células com MGM e sementes 1:3 com 60 mL por frasco de camada tripla.
2. ChR2-hiPSC
   NOTA: Todas as linhas de celular para este trabalho foram criadas e utilizadas em conformidade com as diretrizes institucionais da Columbia University, NY, EUA. Neste protocolo, os hiPSCs expressos chr2 foram gerados através da edição do genoma CRISPR-Cas9 usando métodos descritos anteriormente¹⁸, mas quaisquer linhas celulares optogenéticas estáveis (lentiviral, piggyBac, etc.) podem ser usadas da mesma forma. Foram escolhidos promotores constitutivos expressos tanto em iPSCs quanto em motoneurons (CAG). Verificou-se que as células possuem karyótipo saudável, conforme observado em publicações anteriores^18,19.
   1. Cubra placas de 6 poços com 1 mL/poço de matriz de membrana de porão solubilizada diluída em DMEM/F12 (1:80) e incubar as placas em temperatura ambiente por 1h.
   2. IPSCs de sementes em placas revestidas de 6 poços com 2 mL de meio de cultura celular sem alimentador (mídia iPSC), trocando 2 mL de mídia a cada dois dias e passeando a cada 5-7 dias. Manter as células em uma incubadora definidas para 37^{°C e 5% de CO}₂.
   3. Passaging
      1. Dissociar as células-tronco incubando com 1 mL de células-tronco livres de enzimas liberando reagente por 4 min e cisalhamento mecanicamente com uma pipeta P1000 de ponta larga.
      2. Células de sementes em uma proporção de 1:24 ou 1:48 em mídia iPSC com 2 μM de dihidrocloide Y-27632 em 2 mL/bem em placas revestidas de 6 poços.

4. Semeadura do tecido muscular esquelético (dia -3)

1. Isole e conte 30 x 10⁶ myoblasts usando um contador automático de células.
2. Resuspenda os míbios em uma mistura de 4:1 de 3 mg/mL de colágeno I e matriz de membrana de porão solubilizada (800 μL de mistura de colágeno + 200 μL de matriz de membrana de porão para atingir um volume final de 1 mL). Para o componente de colágeno, adicione o agente neutralizador que acompanha (mistura 9:1 de colágeno para agente neutralizante) e diluir a mistura com 1x PBS para atingir um volume de 800 μL.
3. Adicione 15 μL de suspensão de colágeno celular a cada câmara muscular do bioreator, sendo certo que espalhará a suspensão em ambos os pilares usando a ponta pipeta (Figura 2).
4. Deixe a mistura de gel celular polimerizar a 37 °C por 30 min e depois encha bem cada bioreator com 450 μL de mídia de crescimento miotônico.
5. Depois de 3 dias (uma vez que o gel tenha compactado), comece a diferenciação do miotube.

5. Diferenciação do Myotube (dias 0-14)

1. Inicie a infusão do miotube mudando os tecidos para 450 μL de mídia indutora de fusão (FS, Tabela 1) por 7 dias, mudando a mídia a cada dois dias.
   NOTA: Tente iniciar a diferenciação do miotube no mesmo dia da diferenciação do motoneuron dos hiPSCs, a fim de seear motoneurons no final dos horários de diferenciação de ambos os tipos de células.
2. No dia 7, mude a mídia para 450 μL de mídia de maturação Ia (MMIa, Tabela 1).
3. No dia 9, mude para 450 μL de mídia de maturação Ib (MMIb, Tabela 1).
4. No dia 11, mude a mídia para 450 μL de NbActiv4. Continue mudando a mídia a cada 2 dias até que os motoneurons sejam semeados (Passo 7).

6. Diferenciação de Motoneuron (dias 0-14)

NOTA: Nosso protocolo de diferenciação de motoneuron foi adaptado de Maury et al⁸.

1. No dia 0, transfira 4 x 10⁶ ChR2- hiPSCs para uma placa Petri de ligação ultra-baixa com 15 mL de meio de cultura de suspensão de motoneuron (MSCM, Tabela 1). Suplemento MSCM com 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 hidratado e 5 μM Y-27632 dihidrocloide.
2. No dia 2, isole as neurosferas (NS) com um coador reversível de 37 μM e relate em 15 mL de MSCM com 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 hidratado e 0,1 μM ácido retinóico. NS deve ser visível na placa de Petri sem usar um microscópio após o dia 2.
3. No dia 4, transfira as células e a mídia para um tubo de 50 mL e permita que as neuroesferas se acomodem até o fundo (5 min). Aspire o supernasciente e resuspense as células em 15 mL de MSCM suplementado com 0,5 μM SAG, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431541 e ácido retinóico de 0,1 μM.
4. No dia 7, repita o passo 6.3. mas resuspensar as células em 15 mL de MSCM suplementadas com 0,5 μM SAG e ácido retinóico de 0,1μM.
5. No dia 9, repita o passo 6.3. mas células resuspend em 15 mL de MSCM suplementadas com 10 μM DAPT.
6. No dia 11, repita o passo 6.3. mas resuspensar as células em 15 mL de MSCM complementadas com 20 ng/mL BDNF e 10 ng/mL GDNF.
7. No dia 14, semeou os motoneurons na plataforma.

7. A semeadura de motoneurons agrega em bioreator (dia 14)

1. Prepare uma mistura de gel 4:1 de 2 mg/mL de colágeno I e Matrigel (800 μL de mistura de colágeno + 200 μL de Matrigel para atingir um volume final de 1 mL). Para o componente de colágeno, adicione o agente neutralizante que acompanha (9:1 mistura de colágeno para agente neutralizante) e dilua a mistura com 1x PBS para alcançar um volume final de 800 μL.
2. Use um coador de células de 400 nm para selecionar grandes neuroesferas e resuspensá-las na mistura de gel.
3. Aspirar a mídia do reservatório e cuidadosamente do poço neurosfera (Figura 2).
4. Adicione 15 μL de mistura de gel no canal da neurosfera.
5. Carregue uma pipeta de 10 μL com 10 μL de gel e, em seguida, escolha uma neurosfera.
6. Deposite o NS no canal da neurosfera e certifique-se de que o NS está na câmara. Levante lentamente a pipeta enquanto libera o gel restante assim que o NS for depositado. Se não tiver certeza de que o NS foi corretamente depositado, verifique sua localização usando um microscópio.
7. Deixe o gel polimerizar por 30 min a 37 °C.
8. Adicione 450 μL de NbActiv4 complementado com 20 ng/mL BDNF e 10 ng/mL GDNF aos reservatórios.
9. Mude a mídia dia sim, dia não para permitir o crescimento axonal da NS para o tecido muscular.

8. Estimulação óptica simultânea e gravação de vídeo da função NMJ (dia 24+)

1. Para imagem, use um microscópio fluorescente invertido com uma câmera científica complementar de metal-óxido-semicondutor (sCMOS).
2. Ajuste o software da câmera binning para 2x2, exposição a 20 ms, obturador de rolamento ON, taxa de leitura para 540 MHz, alcance dinâmico: 12 bits & gain 1, e modo sensor: sobreposição.
3. Use 2x objetivo no microscópio para imagem dos microtissues.
4. Conecte uma câmara de célula viva (37 °C, 5% CO₂) ao estágio do microscópio.
5. Selecione a região de interesse (ROI) que contém o tecido de tecidos esqueléticos inervados para minimizar o tamanho do arquivo e o tempo de processamento.
6. Coloque um filtro de emissão de passo longo de 594 nm entre a amostra e o objetivo de imagem para filtrar pulsos de luz azul da câmera.
7. Coloque uma placa retangular de 4 poços contendo 4 bioreatores (24 tecidos) na câmara de células vivas.
8. Clique em Live View. Centralizar e focar a imagem com o ROI desejado.
9. Carregue o código macro personalizado da pasta GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) para controlar a posição do palco, a placa Arduino e a aquisição de vídeo.
10. Definir filme de saída como: day_tissue group_tissue name_experiment.nd2.
11. Execute o código macro com as coordenadas X,Y desejadas definidas no palco e adquira um lapso de tempo rápido com 1700 quadros a 50 quadros/s.
12. Substitua a mídia após a imagem e devolva as amostras para a incubadora. Permita pelo menos 24 horas entre as sessões de aquisição de imagens para evitar a fadiga tecidual.

9. Processamento e análise em lote (dia 24+)

1. Processamento de filmes
   1. Use o código MATLAB personalizado para processar os vídeos em análise em lote. Os arquivos podem ser baixados da pasta GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis). As funções estão listadas e explicadas na Tabela 2.
      NOTA: O código é compatível com formatos .nd2 e .czi. Requer processamento paralelo para ser ativado no MATLAB e precisa do pacote bioformats.
   2. Execute o script REcursiveOSAnalysis para analisar os filmes através de processamento paralelo. Tenha todos os vídeos adquiridos na mesma pasta e selecione essa pasta ao executar o código.
   3. Ajuste os parâmetros pós-análise conforme necessário.
      1. Altere a linha de baseTime (opção 1) se a contração espontânea for captada no início da gravação. Isso mostrará uma leitura inicial muito acima de 0 e precisará que o quadro seja deslocado para compensar.
      2. Alterar picoStensão (opção 2) se as contrações não estiverem sendo registradas. O código detectará contrações acima de 25% do pico mais alto por padrão para que esse valor possa ser alterado.
      3. Altere minMinProminence e minMinWidth para ajustar a sensibilidade ao detectar o início de cada pico.
   4. Gerar saída de vídeo e gráfico.
      1. Execute o OSMOvie recursivo para gerar um arquivo de vídeo para cada tecido com seu respectivo traço de contralução.

10. Perturbação da função NMJ (dia 24+)

1. Prepare a mídia de tratamento adicionando efeito externo à mídia basal NbActiv4 complementada com 20 ng/mL BDNF e 10 ng/mL GDNF.
   1. Para o experimento de soro mg, utilize 20% mg paciente sera em NbActiv4 + BDNF + GDNF.
   2. Para o experimento BTX, use 5 μg/mL BTX em NbActiv4 + BDNF + GDNF.
2. Estimular/imagem usando o Passo 3.2. para gravar a linha de base.
3. Substitua a mídia em tecidos por mídia de tratamento (450 μL/tecido).
4. Incubar pelo tempo desejado (48 h para sera paciente, 20 min para BTX).
5. Estimule/imagem novamente usando o Passo 3.2. para registrar função após o tratamento.
6. Remova a mídia de tratamento e deixe os tecidos descansarem pelo tempo desejado (48 h após a remoção da soro)
   NOTA: Permitir pelo menos 24 h entre estimulação e imagem para evitar fadiga tecidual

Resultados

As junções neuromusculares foram geradas por motoneurons optogenéticos derivados do hiPSC com tecido muscular esquelético não optogenético. Myoblasts esqueléticos primários humanos (SkM) foram semeados nas plataformas e diferenciados em mosbos multinucleados usando o protocolo de 2 semanas. Os motoneurons optogenéticos foram diferenciados separadamente, mas em paralelo com a diferenciação do miotube, e depois semeados na plataforma (Figura 1). Os tecidos começaram a se contrair e...

Discussão

Este sistema é um modelo de tecido humano 3D projetado que combina optogenética e processamento de vídeo para permitir uma avaliação automatizada e imparcial da função NMJ. Utilizando um protocolo padronizado, demonstramos a capacidade de medir mudanças na função NMJ durante o desenvolvimento fisiológico e caracterizar os efeitos nocivos de patologias como exposição a neurotoxinas e myasthenia gravis paciente sera.

Estudos anteriores relataram a capacidade de modelar MG com motone...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells
SkMDC	Cook Myosite	P01059-14M
Media and Supplements
Advanced DMEM/F12	ThermoFisher Scientific	12634-020
Bovine Serum Albumin solution	Millipore Sigma	A9576-50ML
G-5 Supplement (100X)	ThermoFisher Scientific	17503-012
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	10131-035
Insulin, Recombinant Human	Millipore Sigma	91077C-100MG
Matrigel	Corning	354277
mTeSR Plus	Stem Cell Technologies	100-0276
MyoTonic Growth Media Kit	Cook Myosite	MK-4444
N-2 Supplement	ThermoFisher Scientific	17502-048
NbActiv4 500 mL	BrainBits LLC	Nb4-500
Neurobasal Medium	ThermoFisher Scientific	21103-049
Neurobasal-A Medium	ThermoFisher Scientific	A13710-01
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	P2443
ReLeSR	Stem Cell Technologies	5872
Plasticware
30 mm cage cube system	ThorLabs	CM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4
37 µm Reversible Strainer, large	Stem Cell Technologies	27250
546 nm short-pass excitation filter	Semrock	FF01-546/SP-25
573 nm dichroic mirror	Semrock	FF573-Di01–25x36
594 nm long- pass emission filter	Semrock	BLP01-594R-25
594 nm long-pass excitation filter	Semrock	BLP01-594R-25
Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA	LuxeonStarLEDs	SP-05-B4
Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic - Integrated Legs	LuxeonStarLEDs	10413
Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture Dish	Corning	3261
Heat sink	LuxeonStarLEDs	LPD-19-10B
Optics
pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterile	PluriSelect	43-50400-03
pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterile	PluriSelect	43-50500-03
Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA	LuxeonStarLEDs	SP-05-R5
ring-actuated iris diaphragm	ThorLabs	SM1D12D
T-Cube LED drivers	ThorLabs	LEDD1B, KPS101
Molds
Female Threaded Hex Standoffs,  3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2"	McMaster	91920A046
Low-Profile C-Clamp	McMaster	1705A12
Growth Factors
Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate	Millipore Sigma	A9501-1G
CHIR 99021, 10 mg	Tocris	4423/10
DAPT 10 mg	R&D Systems	2634/10
Human CNTF, research grade, 5 µg	Miltenyl Biotec	130-096-336
Human Vitronectin Protein, CF	R&D Systems	2349-VN-100
Human Vitronectin Protein, CF	R&D Systems	2349-VN-100
IGF1 Recombinant Human Protein	ThermoFisher Scientific	PHG0078
Laminin mouse protein, natural	ThermoFisher Scientific	23017015
Recombinant Human Agrin Protein	R&D Systems	6624-AG-050
Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ug	R&D Systems	212-GD-050/CF
Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ug	Cell Sciences	CRN500D
Recombinant Human Neurotrophin-4	Cell Sciences	CRN501B
Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus	R&D Systems	1845-SH-100
Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ug	Peprotech	450-02
Retinoic Acid, 50 mg	Millipore Sigma	R2625-50
SAG Smoothened Agonist	Millipore Sigma	566660
SB431542 10 mg	Stem Cell Technologies	72234
StemMACS LDN-193189	Miltenyl Biotec	130-103-925
Vitronectin from human plasma	Millipore Sigma	V8379-50UG
Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254
Antibodies
α-actinin mAb (Mouse IgG1)	Abcam	ab9465
Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat)	Millipore	AB144P
Desmin mAb (Mouse IgG1)	Dako	M076029-2
Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b)	DSHB	MF20
Equipment
Arduino Uno R3	Arduino	A000066
Automated stage	Applied scientific instrumentation	MS- 2000 XYZ
Expanded plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-001 (115V)
Invitrogen Countess Automated Cell Counter	Marshal Scientific	I-CACC
IX-81 Inverted fluorescence microscope	Olympus	IX-ILL100LH
Series Stage Top Incubator System	Tokai Hit STX	TOKAI-HIT-STXG
Zyla 4.2 sCOMS Camera	Andor Technology	ZYLA-4.2P-CL10
Software
Arduino Software (IDE)	Arduino	IDE 1.8.19
Mastercam	Mastercam	Mastercam for Solidworks
Matlab	Matlab	R2021b
NIS elements	Nikon	Basic Research
Solidworks 3D CAD	Solidworks	Solidworks Standard