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要約

我々は、ヒト工学的骨格筋組織および光遺伝学的運動ニューロンを用いて神経筋接合機能を特徴付けるための、再現可能で自動化された、偏りのないイメージングシステムについて記載する。このシステムは、経時的な神経筋接続性の機能的定量化を可能にし、神経毒および重症筋無力症患者血清によって引き起こされる神経筋機能の低下を検出する。

要約

重症筋無力症(MG)などの多くの神経筋疾患は、神経筋接合部(NMJ)の機能不全と関連しており、動物とヒトの生理学的差異のために動物モデルで特徴付けることは困難である。組織工学は、NMJ病理の診断と調査、および潜在的な治療法の試験に使用できる機能的ヒトNMJの in vitro モデルを提供する機会を提供します。誘導多能性幹細胞(iPSC)に光遺伝学的タンパク質を組み込むことで、特定の波長の光で刺激できるニューロンを作製しました。NMJが健康で機能的である場合、運動ニューロンからの神経化学的シグナルは筋肉収縮をもたらす。光遺伝学と微細加工を組織工学と統合することにより、ビデオ解析を使用してNMJ機能を特徴付けるための偏りのない自動化された方法論を確立しました。NMJ形成、同時ビデオ録画による光刺激、および組織収縮性のビデオ分析のために標準化されたプロトコルが開発された。骨格筋収縮を誘導するための光による光遺伝学的運動ニューロンの刺激は、ヒトNMJ生理学を反復し、時間の経過とともに様々な入力に応答してNMJの反復機能測定を可能にする。我々は、このプラットフォームの能力が時間の経過とともに神経筋接続性の機能的改善を示し、NMJ機能に対する患者のMG抗体または神経毒の有害な影響を特徴付ける能力を実証します。

概要

神経筋接合部(NMJ)は、運動ニューロン(MN)と骨格筋細胞(SkM)との間の化学シナプスであり、筋肉の収縮を可能にする。神経毒α - バンガロトキシン(BTX)などの毒素、または重症筋無力症(MG)のような神経筋疾患(NMD)は、NMJの変性および筋肉制御の低下をもたらし得る1。バイオエンジニアリングされたヒト組織モデルは、ヒトNMJの機能的および生理学的メカニズムをよりよく再現し、動物モデルよりも大きな翻訳可能性を提供する。

動物モデルはNMJの形成と機能の理解を進めてきたが、ヒトと動物のシナプスの間には、ヒトへの結果の翻訳を制限し、NMJのインビボ特性評価を困難にする有意な違いがある2,3,4。研究では、マウスとヒトのNMJの間に明確な生理学的違いが示されています。マウスは、ヒトNMJと比較してNMJが大きく、活性ゾーン密度が小さくなっています4。さらに、動物モデルで実施された薬物研究は、ヒト臨床試験で見出された効果を必ずしも反映しているとは限らない。操作されたヒト組織モデルは、NMJの健全な発達および神経筋疾患の病理を研究する機会を提供し、薬物スクリーニングを可能にする。ヒト人工多能性幹細胞(hiPSCs)5は、骨格筋細胞6,7および運動ニューロン8,9を含む様々な細胞型に分化させることができる。hiPSCは患者細胞から容易に生成することができ、患者固有の組織モデルを通じて、より良い疾患モデリング10および薬物スクリーニング11,12を可能にする。

SkMsとMNの2次元(2D)単層共培養は、生理学的NMJの形態、表現型、組織、および機能的挙動を欠いている。 NMJは2D培養においてランダムに形成され、分析のための運動ユニットの単離を阻害し、正確な機能測定を制限し、反復的で体系的な実験のためのそれらの使用を妨げる13.NMJの3次元(3D)組織モデルは、これらの制限の多くを克服し、生理学的NMJの形態学的および機能的特徴を反復する7、14、15、16、17。このモデルを使用して、2つの組織タイプを別々に開発し、軸索成長を導くことによって統合し、2D培養システムと比較してより組織化されたNMJを発達させることを可能にする。

我々の以前の研究は、光遺伝学と組織工学を組み合わせることで、NMJ機能の正確な非侵襲的刺激および評価を可能にすることを実証した18,19。遺伝子工学を通じて、光感受性タンパク質をhiPSCのゲノムに組み込むことができます。青色光に応答して開くイオンチャネルであるチャネルロドプシン-2(ChR2)をニューロンなどの興奮性細胞の膜に統合することで、細胞活性化に対する非接触時空間制御が可能になる20、21、22。ChR2を担持するhiPSCは、青色光に敏感な光遺伝学的運動ニューロンに分化することができ、ニューロンを刺激する典型的な侵襲的電極の必要性を排除し、電極23による筋細胞の望ましくない刺激を回避する。このシステムは、光遺伝学的運動ニューロンを使用して、非光遺伝学的骨格筋細胞の収縮を刺激する。ビデオ取得と制御された青色光照明を組み合わせることで、共培養組織を同時に刺激し、NMJ機能のために記録することができます。

MGは、ニコチン性アセチルコリン受容体(AChR)を標的とする自己抗体によって引き起こされ、NMJ機能の低下および筋力低下をもたらす24。これは、提示された症状、電気診断、および血清学的血液検査による自己抗体の検出に基づいて診断される。しかし、MGに関与するすべての自己抗体が同定されているわけではなく、一部の血清陰性患者はMGと診断されているが、認識された抗体はない25,26。我々のシステムは、MG患者からの血清の添加前後のNMJの繰り返しの機能評価を可能にし、MG抗体によって引き起こされる機能的および生化学的変化に関する非常に貴重な洞察を提供する18。当社のプロトコルは、NMJ病理の診断と調査、および潜在的な治療法の試験に使用できる機能的ヒトNMJの3Dインビトロモデルを作成する方法を示しています。我々は、マイクロ流体デバイスとより大きなオープンウェルバイオリアクタープラットフォームの2つのプラットフォームでシステムの汎用性を実証しています。

プロトコル

この研究のためのすべての細胞株は、コロンビア大学、ニューヨーク州、米国の制度的ガイドラインに準拠して作成され、使用された。

1. バイオリアクターの準備

  1. バイオリアクター金型を作る
    1. 補足CADファイルからバイオ リアクターCADファイル をダウンロードするか、カスタム独自の設計を作成します。
    2. CAM ソフトウェアを使用して、3D モデルから CNC ツールパスを生成します。
    3. CNCフライス盤を使用してアセタール金型を加工します。
  2. バイオリアクターの製作
    1. ポリジメチルシロキサンの10:1のベースと硬化剤の混合物(PDMS、4つのプラットフォーム/金型あたり77gの混合物)を混合する。
    2. 混合物を真空チャンバーに入れ、すべてのバルブを閉じ、真空をオンにして、気泡が残らなくなるまで混合物を少なくとも30分間脱気する。混合物を金型に注ぎ、真空チャンバ内の金型を1時間脱気する。
    3. 金型の上半分を正しい向きにして金型を閉じます。スチール製の六角形の棒を中央に置き、両側にクランプします。
    4. 上部をPDMSで補充します。
    5. 金型を65°Cのオーブンで少なくとも4時間硬化させます。
    6. 室温まで冷却した後、プラットフォームを金型から取り外します。
    7. 1時間のサイクルの食器用石鹸、400mLの100%イソプロパノール、および蒸留水を使用して、超音波浴中で装置を洗浄する。
    8. 65°Cで一晩乾燥させる。
    9. ガラスカバースリップを1%非イオン性界面活性剤ポリオールに30分間浸し、カバースリップがすべて適切にコーティングされるように重ならないことを確認します。
    10. 蒸留水でよくすすぎ、65°Cで一晩乾燥させます。
    11. 6 L/分の酸素を含む高い場所でプラズマクリーナーを1〜2分間使用して、ガラスカバースリップとPDMSプラットフォームを処理します。治療が完了したら、PDMSをカバースリップに少なくとも30秒間押し下げて、2つを接着します。
    12. セルを追加する前に、接着したデバイスをオートクレーブします。

2. 光刺激セットアップの構築

  1. 30 mm ケージ キューブ システムを使用して、中央に 573 nm ダイクロイックミラーを取り付けます。赤色の 627 nm LED と 594 nm ロングパス励起フィルターを結合し、LED を鏡に向けるように立方体の上側に取り付けます。次に、 図3Aの回路図に示すように、546nmのショートパス励起フィルタを備えた青色の488nmのLEDを立方体の隣接側に取り付け、LEDをミラーに向けます。
  2. リング作動式アイリスダイヤフラムをケージキューブの底部に取り付けて、照明領域のサイズを制御します。
  3. T-Cube LEDドライバで各LEDに電力を供給し、ArduinoのUno Rev3ボードを介して制御します。LEDドライバのサイド入力を電源プラグに接続し、中央出力をArduinoに接続し、サイド出力をLEDに直接接続します。
  4. Arduino宇野をUSBケーブルでPCに接続します。
  5. GitHub リンク(https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis)からファイルをダウンロードします。
  6. GitHubフォルダから「Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino」ファイルを開きます。
  7. 開始パラメータを設定する: ステップ = 30;開始周波数 = 0.5;終了周波数 = 3;パルス長 = 100。
  8. ピン出力 4 が青色 LED ドライバに割り当てられ、ピン出力 2 が赤色 LED ドライバに割り当てられていることを確認します。LEDドライバの中央のワイヤがグランドとそれぞれのピン出力に接続されていることを確認します。
  9. "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" プログラムをコンパイルして Arduino にロードします。
  10. 各LEDドライバを対応するチャネルに接続します。

細胞培養セットアップ(-21-0日目)

  1. 初代骨格筋細胞
    1. 筋緊張性増殖培地(+サプリメント)を用いて、一次骨格筋芽細胞(クックミオサイトから得られた)を最大6継代まで解凍し、展開する。細胞を37°Cおよび5%CO2に設定したインキュベーター内で維持する。
    2. メディアは 2 日ごとに交換します。
    3. 細胞が約60%コンフルエントになったら、0.05%トリプシン-EDTA(1x、37°Cで5分間)を用いてそれらを継代する。解離した細胞を収集し、トリプシンを中和するために新鮮な培地を加える。
    4. 細胞を300 x g でスピンダウンし、細胞ペレットの上の上清を吸引します。
    5. 細胞をMGMで再懸濁し、三重層フラスコあたり60mLで1:3にシードする。
  2. ChR2-hiPSC
    注:この研究のためのすべての細胞株は、コロンビア大学、ニューヨーク州、米国の機関ガイドラインに準拠して作成され、使用されました。このプロトコールでは、ChR2発現hiPSCを前述の方法18を使用してCRISPR-Cas9ゲノム編集を介して生成しましたが、任意の安定な光遺伝学的細胞株(レンチウイルス、ピギーバックなど)を同じ方法で使用できます。iPS細胞および運動ニューロンの両方において発現される構成的プロモーター(CAG)を選択した。この細胞は、以前の刊行物18、19に記されているように、健康な核型を有することが見出された。
    1. 6ウェルプレートをDMEM/F12(1:80)で希釈した1mL/ウェルの可溶化基底膜マトリックスでコーティングし、プレートを室温で1時間インキュベートする。
    2. 2 mLのフィーダーフリー細胞培養培地(iPSC培地)でコーティングした6ウェルプレート上の種iPSCを、1日おきに2 mLの培地を交換し、5〜7日ごとに継代する。細胞を37°Cおよび5%CO2に設定したインキュベーター内に維持する。
    3. 継代
      1. 1mLの酵素非含有幹細胞放出試薬と共に4分間インキュベートし、広いチップP1000ピペットで機械的に剪断することにより、幹細胞を解離させる。
      2. iPSC培地中に1:24または1:48の比率で細胞を2mL/ウェルのY-27632二塩酸塩2μMとともにコーティングされた6ウェルプレート上にシードします。

骨格筋組織播種(-3日目)

  1. 自動セルカウンターを使用して、30 x 106 筋芽細胞を単離してカウントします。
  2. 筋芽細胞を、3mg/mLコラーゲンIと可溶化した基底膜マトリックスの4:1混合物に再懸濁する(800μLのコラーゲン混合物+200μLの基底膜マトリックスを最終容量1mLに達する)。コラーゲン成分については、付随する中和剤(中和剤に対するコラーゲンの9:1混合物)を加え、混合物を1x PBSで希釈して800μLの体積を達成する。
  3. バイオリアクターの各筋肉チャンバーに15 μLの細胞コラーゲン懸濁液を加え、ピペットチップを使用して懸濁液を両方のピラーに広げるようにします(図2)。
  4. 細胞とゲルの混合物を37°Cで30分間重合させ、次に各バイオリアクターウェルに450μLの筋緊張性増殖培地を充填する。
  5. 3日後(ゲルが圧縮されたら)、筋管分化を開始する。

5.筋管分化(0-14日目)

  1. 組織を450μLの融合誘導培地(FS、表1)に7日間切り替え、 1日おきに培地を交換することにより、筋管注入を開始する。
    注:両方の細胞型の分化スケジュールの最後に運動ニューロンを播種するために、hiPSCからの運動ニューロン分化と同じ日に筋管分化を開始してみてください。
  2. 7日目に培地を450 μLの成熟培地Iaに変更する(MMIa、 表1)。
  3. 9日目に、450 μLの成熟培地Ibに変更する(MMIb、 表1)。
  4. 11日目に、培地を450 μLのNbActiv4に変更します。運動ニューロンが播種されるまで2日ごとに培地を交換し続ける(ステップ7)。

6. 元ニューロン分化(0~14日目)

注:我々の運動ニューロン分化プロトコルは、Maury et al8から適応された。

  1. 0日目に、4 x106 ChR2-hiPSCsを、15 mLの運動ニューロン浮遊培養培地(MSCM、 表1)を含む超低付着シャーレに移す。MSCMを3 μM CHIR99021、0.2 μM LDN193189、40 μM SB431542水和物および5 μM Y-27632二塩酸塩で補います。
  2. 2日目に、37 μM 可逆ストレーナーでニューロスフェア(NS)を単離し、3 μM CHIR99021、0.2 μM LDN193189、40 μM SB431542水和物、および0.1 μM レチノイン酸を含む15 mLのMSCMに再プレートします。NSは、2日目以降に顕微鏡を使用せずにペトリ皿に見えるはずです。
  3. 4日目に、細胞と培地を50mLチューブに移し、ニューロスフェアが底に沈降するのを待ちます(5分)。上清を吸引し、0.5 μM SAG、0.2 μM LDN193189、40 μM SB431541、および0.1 μM レチノイン酸を添加した 15 mL の MSCM に細胞を再懸濁します。
  4. 7 日目に、ステップ 6.3 を繰り返します。しかし、0.5 μM SAGおよび0.1μMレチノイン酸を添加した15 mLのMSCMに細胞を再懸濁する。
  5. 9 日目に、手順 6.3 を繰り返します。しかし、10μM DAPTを添加した15mLのMSCMに細胞を再懸濁する。
  6. 11 日目に、手順 6.3 を繰り返します。しかし、20ng/mLのBDNFおよび10ng/mLのGDNFを添加した15mLのMSCMに細胞を再懸濁する。
  7. 14日目に、運動ニューロンをプラットフォームに播種する。

7. バイオリアクターに運動ニューロン凝集体を播種する(14日目)

  1. 2 mg/mL のコラーゲン I とマトリゲルの 4:1 ゲル混合物を調製します (800 μL のコラーゲン混合物 + 200 μL のマトリゲルで最終容量が 1 mL に達するまで)。コラーゲン成分については、付属の中和剤(中和剤にコラーゲンを9:1ミックス)を加え、混合物を1x PBSで希釈して、最終容量800μLにします。
  2. 400 nmの細胞ストレーナーを使用して大きなニューロスフェアを選択し、それらをゲル混合物に再懸濁します。
  3. リザーバから媒体を吸引し、神経圏ウェルから慎重に吸引します(図2)。
  4. 15μLのゲル混合物をニューロスフェアチャネルに加える。
  5. 10 μLのピペットに10 μLのゲルをロードし、1つのニューロスフェアを選択します。
  6. NSをニューロスフェアチャネルに沈着させ、NSがチャンバー内にあることを確認する。NSが沈着したら、残りのゲルを解放しながらゆっくりとピペットを持ち上げます。NSが正しく堆積したかどうかわからない場合は、顕微鏡を使用してNSの位置を確認してください。
  7. ゲルを37°Cで30分間重合させる。
  8. 20 ng/mL BDNF および 10 ng/mL GDNF を添加した NbActiv4 を 450 μL リザーバーに加えます。
  9. NSから筋肉組織への軸索成長を可能にするために、1日おきに培地を交換する。

8. NMJ機能の同時光刺激とビデオ録画(24日目以上)

  1. イメージングには、科学的な相補型金属酸化膜半導体(sCMOS)カメラを備えた倒立蛍光顕微鏡を使用してください。
  2. カメラソフトウェアのビニングを2x2、露出を20ミリ秒、ローリングシャッターON、読み出しレートを540MHz、ダイナミックレンジ:12ビット&ゲイン1、センサーモード:オーバーラップに設定します。
  3. 顕微鏡で2倍の対物レンズを使用して、微小組織を画像化します。
  4. 生細胞チャンバー(37°C、5%CO2)を顕微鏡ステージに取り付けます。
  5. 神経支配された骨格組織組織を含む関心領域(ROI)を選択して、ファイルサイズと処理時間を最小限に抑えます。
  6. サンプルとイメージング対物レンズの間に594nmのロングパス発光フィルターを配置して、カメラからの青色光パルスをフィルタリングします。
  7. 4つのバイオリアクター(24組織)を含む長方形の4ウェルプレートを生細胞チャンバーに入れる。
  8. [ ライブ ビュー] をクリックします。画像を中央に配置し、目的のROIに焦点を合わせます。
  9. GitHub フォルダー (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) からカスタムマクロコードをアップロードして、ステージの位置、Arduinoボード、およびビデオ集録を制御します。
  10. 出力ムービーを day_tissue group_tissue name_experiment.nd2 に設定します。
  11. ステージ上で設定した目的のX、Y座標でマクロコードを実行し、50フレーム/秒で1700フレームの高速タイムラプスを取得します。
  12. イメージング後に培地を交換し、サンプルをインキュベーターに戻します。組織の疲労を避けるために、画像取得セッションの間に少なくとも24時間かかります。

9. バッチ処理と分析(24日目以降)

  1. 動画処理
    1. カスタムMATLABコードを使用して、バッチ分析でビデオを処理します。ファイルは GitHub フォルダ (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) からダウンロードできます。これらの機能を表 2 にリストし、説明します。
      注: このコードは、.nd2 および .czi 形式と互換性があります。MATLABでアクティブ化するには並列処理が必要であり、バイオフォーマットパッケージが必要です。
    2. 再帰的OSAnalysis スクリプトを実行して、並列処理によってムービーを分析します。取得したすべてのビデオを同じフォルダに保存し、コードの実行時にそのフォルダを選択します。
    3. 必要に応じて、解析後のパラメータを調整します。
      1. 記録の開始時に自発的な収縮が拾われた場合は、 baselineTime (オプション 1) を変更します。これは0を超える最初の読み取り方法を示し、補正するためにフレームをシフトする必要があります。
      2. 収縮が登録されていない場合は、 peakThreshold (オプション 2) を変更します。このコードは、デフォルトで最高ピークの 25% を超える収縮を検出し、この値を変更できるようにします。
      3. minMinProminence と minMinWidth を変更して、各ピークの開始を検出するときの感度を調整します。
    4. ビデオとグラフの出力を生成します。
      1. recursiveOSMovieを実行して、それぞれの収縮性トレースを持つ各組織のビデオファイルを生成します。

10. NMJ関数の摂動(24日目以降)

  1. 20 ng/mL BDNF および 10 ng/mL GDNF を添加した NbActiv4 基礎培地に外部エフェクターを添加して、治療培地を調製します。
    1. MG血清実験のために、NbActiv4 + BDNF + GDNF中の20%MG患者血清を使用する。
    2. BTX 実験には、NbActiv4 + BDNF + GDNF で 5 μg/mL の BTX を使用します。
  2. ステップ3.2を使用して刺激/画像化する。をクリックしてベースラインを記録します。
  3. 組織内の培地を治療培地(450 μL/組織)と交換します。
  4. 所望の時間(患者血清の場合は48時間、BTXの場合は20時間)インキュベートする。
  5. ステップ3.2を使用して再び刺激/イメージします。治療後の機能を記録する。
  6. 治療培地を除去し、組織を所望の時間(血清除去後48時間)休ませる
    注:組織の疲労を避けるために、刺激とイメージングの間に少なくとも24時間かかります

結果

神経筋接合部は、光遺伝学的hiPSC由来運動ニューロンを非光遺伝学的骨格筋組織と共培養することによって生成された。ヒト原発性骨格筋芽細胞(SkM)をプラットフォームに播種し、2週間のプロトコールを用いて多核筋管に分化させた。光遺伝学的運動ニューロンを別々に分化させたが、筋管分化と並行して、次いでプラットフォームに播種した(図1)。組織は、MN播種後7?...

ディスカッション

このシステムは、光遺伝学とビデオ処理を組み合わせて、NMJ機能の自動的かつ偏りのない評価を可能にする、設計された3Dヒト組織モデルです。標準化されたプロトコールを用いて、生理学的発達中のNMJ機能の変化を測定し、神経毒曝露および重症筋無力症患者血清などの病状の有害な影響を特徴付ける能力を実証した。

以前の研究は、MG患者血清を用いた骨格筋管との?...

開示事項

著者らは利益相反がないと宣言しています。

謝辞

我々は、NIH[助成金番号EB025765及びEB027062]、国防総省[受賞番号W81XWH-18-1-0095]及びUCSFヘルス・イノベーション・バイ・エンジニアリング(HIVEフェローシップ)による資金支援に感謝する。コロンビア大学幹細胞コアの細胞リプログラミングに関する支援と指導に感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Cells
SkMDCCook MyositeP01059-14M
Media and Supplements
Advanced DMEM/F12ThermoFisher Scientific12634-020
Bovine Serum Albumin solutionMillipore SigmaA9576-50ML
G-5 Supplement (100X)ThermoFisher Scientific17503-012
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)ThermoFisher Scientific10131-035
Insulin, Recombinant HumanMillipore Sigma91077C-100MG
MatrigelCorning354277
mTeSR PlusStem Cell Technologies100-0276
MyoTonic Growth Media KitCook MyositeMK-4444
N-2 SupplementThermoFisher Scientific17502-048
NbActiv4 500 mLBrainBits LLCNb4-500
Neurobasal MediumThermoFisher Scientific21103-049
Neurobasal-A MediumThermoFisher ScientificA13710-01
Pluronic F-127Sigma AldrichP2443
ReLeSRStem Cell Technologies5872
Plasticware
30 mm cage cube systemThorLabsCM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4
37 µm Reversible Strainer, largeStem Cell Technologies27250
546 nm short-pass excitation filterSemrockFF01-546/SP-25
573 nm dichroic mirrorSemrockFF573-Di01–25x36
594 nm long- pass emission filterSemrockBLP01-594R-25
594 nm long-pass excitation filterSemrockBLP01-594R-25
Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mALuxeonStarLEDsSP-05-B4
Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic - Integrated LegsLuxeonStarLEDs10413
Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture DishCorning3261
Heat sinkLuxeonStarLEDsLPD-19-10B
Optics
pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterilePluriSelect43-50400-03
pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterilePluriSelect43-50500-03
Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mALuxeonStarLEDsSP-05-R5
ring-actuated iris diaphragmThorLabsSM1D12D
T-Cube LED driversThorLabsLEDD1B, KPS101
Molds
Female Threaded Hex Standoffs,  3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2"McMaster91920A046
Low-Profile C-ClampMcMaster1705A12
Growth Factors
Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphateMillipore SigmaA9501-1G
CHIR 99021, 10 mgTocris4423/10
DAPT 10 mgR&D Systems2634/10
Human CNTF, research grade, 5 µgMiltenyl Biotec130-096-336
Human Vitronectin Protein, CFR&D Systems2349-VN-100
Human Vitronectin Protein, CFR&D Systems2349-VN-100
IGF1 Recombinant Human ProteinThermoFisher ScientificPHG0078
Laminin mouse protein, naturalThermoFisher Scientific23017015
Recombinant Human Agrin ProteinR&D Systems6624-AG-050
Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ugR&D Systems212-GD-050/CF
Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ugCell SciencesCRN500D
Recombinant Human Neurotrophin-4Cell SciencesCRN501B
Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-TerminusR&D Systems1845-SH-100
Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ugPeprotech450-02
Retinoic Acid, 50 mgMillipore SigmaR2625-50
SAG Smoothened AgonistMillipore Sigma566660
SB431542 10 mgStem Cell Technologies72234
StemMACS LDN-193189Miltenyl Biotec130-103-925
Vitronectin from human plasmaMillipore SigmaV8379-50UG
Y-27632 dihydrochlorideTocris1254
Antibodies
α-actinin mAb (Mouse IgG1)Abcamab9465
Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat)MilliporeAB144P
Desmin mAb (Mouse IgG1)DakoM076029-2
Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b)DSHBMF20
Equipment
Arduino Uno R3ArduinoA000066
Automated stageApplied scientific instrumentationMS- 2000 XYZ
Expanded plasma cleanerHarrick PlasmaPDC-001 (115V)
Invitrogen Countess Automated Cell CounterMarshal ScientificI-CACC
IX-81 Inverted fluorescence microscopeOlympusIX-ILL100LH
Series Stage Top Incubator SystemTokai Hit STXTOKAI-HIT-STXG
Zyla 4.2 sCOMS CameraAndor TechnologyZYLA-4.2P-CL10
Software
Arduino Software (IDE)ArduinoIDE 1.8.19
MastercamMastercamMastercam for Solidworks
MatlabMatlabR2021b
NIS elementsNikonBasic Research
Solidworks 3D CADSolidworksSolidworks Standard

参考文献

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