Ingénierie et caractérisation d’un modèle optogénétique de la jonction neuromusculaire humaine

Résumé

Nous décrivons un système d’imagerie reproductible, automatisé et impartial pour caractériser la fonction de la jonction neuromusculaire à l’aide de tissus musculaires squelettiques et de motoneurones optogénétiques. Ce système permet la quantification fonctionnelle de la connectivité neuromusculaire au fil du temps et détecte la diminution de la fonction neuromusculaire causée par les neurotoxines et la myasthénie grave du sérum du patient.

Résumé

De nombreuses maladies neuromusculaires, telles que la myasthénie grave (MG), sont associées à un dysfonctionnement de la jonction neuromusculaire (NMJ), qui est difficile à caractériser dans les modèles animaux en raison des différences physiologiques entre les animaux et les humains. L’ingénierie tissulaire offre la possibilité de fournir des modèles in vitro de NMJ humains fonctionnels qui peuvent être utilisés pour diagnostiquer et étudier les pathologies NMJ et tester des thérapies potentielles. En incorporant des protéines optogénétiques dans les cellules souches pluripotentes induites (CSPi), nous avons généré des neurones qui peuvent être stimulés avec des longueurs d’onde de lumière spécifiques. Si le NMJ est sain et fonctionnel, un signal neurochimique du motoneurone entraîne une contraction musculaire. Grâce à l’intégration de l’optogénétique et de la microfabrication à l’ingénierie tissulaire, nous avons établi une méthodologie impartiale et automatisée pour caractériser la fonction NMJ à l’aide de l’analyse vidéo. Un protocole standardisé a été développé pour la formation de NMJ, la stimulation optique avec enregistrement vidéo simultané et l’analyse vidéo de la contractilité tissulaire. La stimulation des motoneurones optogénétiques par la lumière pour induire des contractions musculaires squelettiques récapitule la physiologie humaine du NMJ et permet des mesures fonctionnelles répétées du NMJ au fil du temps et en réponse à divers intrants. Nous démontrons la capacité de cette plateforme à montrer des améliorations fonctionnelles de la connectivité neuromusculaire au fil du temps et à caractériser les effets néfastes des anticorps MG ou des neurotoxines des patients sur la fonction NMJ.

Introduction

La jonction neuromusculaire (NMJ) est la synapse chimique entre les motoneurones (MN) et les cellules musculaires squelettiques (SkM) qui permet la contraction musculaire. Les toxines, telles que la neurotoxine α-bungarotoxine (BTX), ou les maladies neuromusculaires (NMD) comme la myasthénie grave (MG) peuvent entraîner une dégénérescence de la NMJ et des réductions du contrôle musculaire¹. Les modèles de tissus humains issus de la bioingénierie récapitulent mieux les mécanismes fonctionnels et physiologiques des NMJ humains et offrent un plus grand potentiel de traduction que les modèles animaux.

Bien que les modèles animaux aient fait progresser la compréhension de la formation et de la fonction du NMJ, il existe des différences significatives entre les synapses humaines et animales qui limitent la traduction des résultats chez l’homme et rendent la caractérisation in vivo du NMJ difficile ^2,3,4. Des études ont montré des différences physiologiques distinctes entre les NMJ de souris et les NMJ humains. Les souris ont des NMJ plus importants et des densités de zone active plus petites par rapport aux NMJ humains⁴. De plus, les études sur les médicaments menées sur des modèles animaux ne reflètent pas toujours les effets observés dans les essais cliniques chez l’homme. Les modèles de tissus humains modifiés offrent la possibilité d’étudier le développement sain de la NMJ et la pathologie des maladies neuromusculaires et permettent des dépistages de médicaments. Les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSCs)⁵ peuvent être différenciées en une variété de types de cellules, y compris les cellules musculaires squelettiques ^6,7 et les motoneurones ^8,9. Les CSHS peuvent être générés facilement à partir des cellules des patients, ce qui permet une meilleure modélisation de la maladie¹⁰ et un dépistage des médicaments^11,12 grâce à des modèles tissulaires spécifiques au patient.

Les co-cultures monocouches bidimensionnelles (2D) de SkM et de MN n’ont pas la morphologie, le phénotype, l’organisation et le comportement fonctionnel des NMJ physiologiques. Les NMJ se forment aléatoirement en culture 2D, ce qui inhibe l’isolement des unités motrices pour l’analyse, limite les mesures fonctionnelles précises et empêche leur utilisation pour des expériences répétées et systématiques¹³ . Les modèles tissulaires tridimensionnels (3D) des NMJ surmontent bon nombre de ces limitations, récapitulant les caractéristiques morphologiques et fonctionnelles des NMJ physiologiques 7,14,15,16,17. À l’aide de ce modèle, les deux types de tissus sont développés séparément, puis intégrés en dirigeant la croissance axonale, ce qui permet aux NMJ plus organisés de se développer par rapport aux systèmes de culture 2D.

Notre étude précédente a démontré que la combinaison de l’optogénétique avec l’ingénierie tissulaire peut permettre une stimulation et une évaluation non invasives précises de la fonction NMJ^18,19. Grâce au génie génétique, les protéines sensibles à la lumière peuvent être intégrées dans le génome des hiPSC. L’intégration de la channelrhodopsine-2 (ChR2), un canal ionique qui s’ouvre en réponse à la lumière bleue, dans la membrane des cellules excitables telles que les neurones permet un contrôle spatio-temporel sans contact de l’activation cellulaire 20,21,22. Les hiPSC porteurs de ChR2 peuvent être différenciés en motoneurones optogénétiques sensibles à la lumière bleue, éliminant ainsi le besoin d’électrodes invasives typiques qui stimulent les neurones et évitant la stimulation indésirable des cellules musculaires par des électrodes²³. Ce système utilise des motoneurones optogénétiques pour stimuler les contractions dans les cellules musculaires squelettiques non optogénétiques. La combinaison de l’acquisition vidéo et de l’éclairage contrôlé de la lumière bleue permet aux tissus co-cultivés d’être simultanément stimulés et enregistrés pour la fonction NMJ.

La MG est causée par des auto-anticorps ciblant les récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine (AChR), ce qui entraîne une diminution de la fonction NMJ et une faiblesse musculaire²⁴. Il est diagnostiqué en fonction des symptômes présentés, de l’électrodiagnostic et de la détection d’auto-anticorps via des tests sanguins sérologiques. Cependant, tous les auto-anticorps impliqués dans la MG n’ont pas été identifiés, et certains patients séronégatifs reçoivent un diagnostic de MG mais sans anticorps reconnus^25,26. Notre système permet une évaluation fonctionnelle répétée du NMJ avant et après l’ajout de sérum chez les patients atteints de MG, fournissant des informations inestimables sur les changements fonctionnels et biochimiques causés par les anticorps MG¹⁸. Notre protocole illustre comment produire des modèles 3D in vitro de NMJ humain fonctionnel qui peuvent être utilisés pour diagnostiquer et étudier les pathologies NMJ et tester des thérapies potentielles. Nous démontrons la polyvalence du système en deux plates-formes, un dispositif microfluidique et une plus grande plate-forme de bioréacteur à puits ouvert.

Protocole

Toutes les lignées cellulaires pour ce travail ont été créées et utilisées conformément aux directives institutionnelles de l’Université Columbia, NY, États-Unis.

1. Préparation du bioréacteur

1. Fabriquer des moules de bioréacteur
   1. Téléchargez un fichier CAO de bioréacteur à partir du fichier CAO supplémentaire ou créez votre propre conception personnalisée.
   2. Générez une trajectoire d’outil CNC à partir du modèle 3D à l’aide d’un logiciel de FAO.
   3. Machines à moules acétal à l’aide d’une fraiseuse CNC.
2. Fabrication de bioréacteurs
   1. Mélanger un mélange de polydiméthylsiloxane (PDMS, 77 g de mélange pour 4 plates-formes/moules) à base d’agent de durcissement.
   2. Placez le mélange dans une chambre à vide, fermez toutes les vannes, allumez le vide et désamorçez le mélange pendant au moins 30 minutes jusqu’à ce qu’il ne reste plus de bulles d’air. Versez le mélange dans des moules et dégazez les moules dans la chambre à vide pendant 1 h.
   3. Fermez les moules avec la moitié supérieure du moule dans la bonne orientation. Placez une tige hexagonale en acier sur le centre et serrez les deux côtés.
   4. Remplissez le dessus avec PDMS.
   5. Durcir les moules dans un four à 65 °C pendant au moins 4 h.
   6. Retirez les plates-formes des moules après refroidissement à la température ambiante.
   7. Nettoyez les appareils dans un bain à ultrasons en utilisant 1 h de cycles de savon à vaisselle, 400 mL d’isopropanol à 100% et de l’eau distillée.
   8. Sécher toute la nuit à 65 °C.
   9. Trempez les couvercles de verre dans du polyol de tensioactif non ionique à 1% pendant 30 minutes et assurez-vous que les couvercles ne s’empilent pas de sorte qu’ils soient tous correctement enduits.
   10. Bien rincer à l’eau distillée et sécher toute la nuit à 65 °C.
   11. Utilisez un nettoyeur plasma à haute température avec 6 L / min d’oxygène pendant 1 à 2 minutes pour traiter les couvercles en verre et la plate-forme PDMS. Une fois traités, collez les deux ensemble en appuyant sur le PDMS sur le couvercle pendant au moins 30 s.
   12. Autoclavez les dispositifs liés avant d’ajouter des cellules.

2. Construire une installation de stimulation optique

1. À l’aide d’un système de cube de cage de 30 mm, fixez un miroir dichroïque de 573 nm au centre. Couplez une LED rouge de 627 nm avec un filtre d’excitation passe-long de 594 nm et fixez-la sur le côté supérieur du cube, la LED faisant face au miroir. Fixez ensuite une LED bleue de 488 nm avec un filtre d’excitation passe-court de 546 nm sur le côté adjacent du cube, la LED faisant face au miroir comme le montre le schéma de la figure 3A.
2. Fixez un diaphragme d’iris actionné par anneau au fond du cube de la cage pour contrôler la taille de la zone éclairée.
3. Alimentez chaque LED par un pilote LED T-Cube et contrôlez via une carte Arduino Uno Rev3. Connectez l’entrée latérale du pilote LED à une fiche de source d’alimentation, connectez la sortie centrale à l’Arduino et connectez la sortie latérale directement aux LED.
4. Connectez l’Arduino Uno à un PC à l’aide d’un câble USB.
5. Téléchargez des fichiers à partir du lien GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis).
6. Ouvrez le fichier « Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino » à partir du dossier GitHub.
7. Définissez les paramètres de départ: Étapes = 30; startFrequency = 0,5; endFrequency = 3; pulseLongueur = 100.
8. Assurez-vous que la sortie de broche 4 est affectée au pilote de LED bleue et que la sortie de broche 2 est affectée au pilote de LED rouge. Vérifiez que les fils du milieu du pilote LED sont connectés à la terre et à la sortie de broche respective.
9. Compilez et chargez le programme « Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino » sur Arduino.
10. Connectez chaque pilote LED à son canal correspondant.

3. Configuration de la culture cellulaire (jour -21-0)

1. Cellules musculaires squelettiques primaires
   1. Décongeler et dilater les myoblastes squelettiques primaires (obtenus à partir de Cook Myosite) pour un maximum de six passages en utilisant un milieu de croissance myotonique (+ supplément). Maintenir les cellules dans un incubateur réglé à 37 °C et 5 % de CO₂.
   2. Changez le média tous les 2 jours.
   3. Une fois que les cellules sont confluentes à environ 60 %, passez-les à l’aide de 0,05 % de trypsine-EDTA (1x, pendant 5 min à 37 °C). Recueillir les cellules dissociées et ajouter un milieu frais pour neutraliser la trypsine.
   4. Faites tourner les cellules à 300 x g et aspirez le surnageant au-dessus de la pastille de cellule.
   5. Remettre en suspension les cellules avec MGM et ensemencer 1:3 avec 60 mL par fiole à triple couche.
2. ChR2-hiPSC
   REMARQUE: Toutes les lignées cellulaires pour ce travail ont été créées et utilisées conformément aux directives institutionnelles de l’Université Columbia, NY, États-Unis. Dans ce protocole, les hiPSC exprimant ChR2 ont été générés via l’édition du génome CRISPR-Cas9 en utilisant les méthodes¹⁸ décrites précédemment, mais toutes les lignées cellulaires optogénétiques stables (lentiviral, piggyBac, etc.) peuvent être utilisées de la même manière. Les promoteurs constitutifs exprimés à la fois dans les CSPi et les motoneurones ont été choisis (CAG). Les cellules se sont avérées avoir un caryotype sain, comme indiqué dans les publications précédentes^18,19.
   1. Enduire les plaques à 6 puits avec 1 mL/puits de matrice de membrane basale solubilisée diluée dans du DMEM/F12 (1:80) et incuber les plaques à température ambiante pendant 1 h.
   2. Ensemencez des CSPi sur des plaques enduites de 6 puits avec 2 mL de milieu de culture cellulaire sans mangeoire (milieux iPSC), échangeant 2 mL de milieu tous les deux jours et passant tous les 5 à 7 jours. Maintenir les cellules dans un incubateur réglé à 37 ^{°C et 5 % de CO}₂.
   3. Le passage
      1. Dissocier les cellules souches en incubant avec 1 mL de réactif libérant des cellules souches sans enzyme pendant 4 min et en cisaillant mécaniquement avec une pipette P1000 à large pointe.
      2. Cellules de semences dans un rapport de 1:24 ou 1:48 dans des milieux iPSC avec 2 μM de dichlorhydrate Y-27632 dans 2 mL/puits sur des plaques revêtues de 6 puits.

4. Ensemencement du tissu musculaire squelettique (jour -3)

1. Isolez et comptez 30 x 10⁶ myoblastes à l’aide d’un compteur de cellules automatisé.
2. Remettre en suspension les myoblastes dans un mélange 4:1 de collagène I de 3 mg/mL et de matrice de membrane basale solubilisée (800 μL de mélange de collagène + 200 μL de matrice de membrane basale pour atteindre un volume final de 1 mL). Pour le composant collagène, ajouter l’agent neutralisant qui l’accompagne (mélange 9:1 de collagène à agent neutralisant) et diluer le mélange avec 1x PBS pour obtenir un volume de 800 μL.
3. Ajouter 15 μL de suspension de collagène cellulaire à chaque chambre musculaire du bioréacteur, en veillant à étaler la suspension sur les deux piliers à l’aide de la pointe de la pipette (Figure 2).
4. Laisser le mélange cellule-gel polymériser à 37 °C pendant 30 min, puis bien remplir chaque bioréacteur avec 450 μL de milieu de croissance myotonique.
5. Après 3 jours (une fois que le gel s’est compacté), commencez la différenciation des myotubes.

5. Différenciation des myotubes (jours 0-14)

1. Commencez la perfusion de myotubes en changeant les tissus en 450 μL de milieux inducteurs de fusion (FS, tableau 1) pendant 7 jours, en changeant les milieux tous les deux jours.
   REMARQUE: Essayez de commencer la différenciation des myotubes le même jour que la différenciation des motoneurones des hiPSC afin d’ensemencer les motoneurones à la fin des calendriers de différenciation des deux types de cellules.
2. Le jour 7, changez le milieu à 450 μL de milieu de maturation Ia (MMIa, tableau 1).
3. Le jour 9, passer à 450 μL de milieu de maturation Ib (MMIb, tableau 1).
4. Le jour 11, changez le média à 450 μL de NbActiv4. Continuez à changer le média tous les 2 jours jusqu’à ce que les motoneurones soient ensemencés (étape 7).

6. Différenciation des motoneurones (jours 0-14)

NOTE: Notre protocole de différenciation des motoneurones a été adapté de Maury et al⁸.

1. Le jour 0, transférez 4 x 10⁶ ChR2- hiPSC dans une boîte de Petri à fixation ultra-faible avec 15 mL de milieu de culture en suspension de motoneurone (MSCM, Tableau 1). Complétez MSCM avec 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 hydrate et 5 μM Y-27632 dichlorhydrate.
2. Le jour 2, isolez les neurosphères (NS) avec une passoire réversible de 37 μM et replaquez dans 15 mL de MSCM avec 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 hydrate et 0,1 μM d’acide rétinoïque. NS devrait être visible dans la boîte de Petri sans utiliser de microscope après le jour 2.
3. Le jour 4, transférez les cellules et les milieux dans un tube de 50 mL et laissez les neurosphères s’installer au fond (5 min). Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 15 mL de MSCM complété par 0,5 μM SAG, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431541 et 0,1 μM d’acide rétinoïque.
4. Le jour 7, répétez l’étape 6.3. mais remettre en suspension les cellules dans 15 mL de MSCM complété par 0,5 μM DE SAG et 0,1 μM d’acide rétinoïque.
5. Le jour 9, répétez l’étape 6.3. mais remettre en suspension des cellules dans 15 mL de MSCM complété par 10 μM de DAPT.
6. Le jour 11, répétez l’étape 6.3. mais remettre en suspension les cellules dans 15 mL de MSCM complété par 20 ng/mL BDNF et 10 ng/mL GDNF.
7. Le jour 14, ensemencez les motoneurones dans la plate-forme.

7. Ensemencement d’agrégats de motoneurones dans un bioréacteur (jour 14)

1. Préparer un mélange de gel 4:1 de 2 mg/mL de collagène I et de Matrigel (800 μL de mélange de collagène + 200 μL de Matrigel pour atteindre un volume final de 1 mL). Pour le composant collagène, ajouter l’agent neutralisant qui l’accompagne (mélange 9:1 de collagène à agent neutralisant) et diluer le mélange avec 1x PBS pour obtenir un volume final de 800 μL.
2. Utilisez une passoire cellulaire de 400 nm pour sélectionner de grandes neurosphères et les remettre en suspension dans le mélange de gel.
3. Aspirer les milieux du réservoir et soigneusement de la neurosphère (Figure 2).
4. Ajouter 15 μL de mélange de gel dans le canal de la neurosphère.
5. Chargez une pipette de 10 μL avec 10 μL de gel, puis choisissez une neurosphère.
6. Déposez le NS dans le canal de la neurosphère et assurez-vous que le NS est dans la chambre. Soulevez lentement la pipette tout en libérant le gel restant une fois que le NS est déposé. Si vous n’êtes pas sûr que le NS a été correctement déposé, vérifiez son emplacement à l’aide d’un microscope.
7. Laisser le gel polymériser pendant 30 min à 37 °C.
8. Ajouter 450 μL de NbActiv4 complété par 20 ng/mL de BDNF et 10 ng/mL de GDNF aux réservoirs.
9. Changez le média tous les deux jours pour permettre la croissance axonale de la NS au tissu musculaire.

8. Stimulation optique simultanée et enregistrement vidéo de la fonction NMJ (jour 24+)

1. Pour l’imagerie, utilisez un microscope fluorescent inversé avec une caméra scientifique complémentaire métal-oxyde-semi-conducteur (sCMOS).
2. Réglez le binning du logiciel de l’appareil photo sur 2x2, l’exposition à 20 ms, l’obturateur roulant allumé, le taux de lecture à 540 MHz, la plage dynamique: 12 bits et le gain 1, et le mode capteur: chevauchement.
3. Utilisez un objectif 2x sur le microscope pour imager les microtissus.
4. Fixez une chambre à cellules vivantes (37 °C, 5 % de CO₂) à l’étage du microscope.
5. Sélectionnez la région d’intérêt (ROI) qui contient le tissu tissulaire squelettique innervé afin de minimiser la taille du fichier et le temps de traitement.
6. Placez un filtre d’émission passe-long de 594 nm entre l’échantillon et l’objectif d’imagerie pour filtrer les impulsions de lumière bleue de la caméra.
7. Placez une plaque rectangulaire de 4 puits contenant 4 bioréacteurs (24 tissus) dans la chambre des cellules vivantes.
8. Cliquez sur Affichage en direct. Centrez et concentrez l’image avec le retour sur investissement souhaité.
9. Téléchargez le code de macro personnalisé à partir du dossier GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) pour contrôler la position de la scène, la carte Arduino et l’acquisition vidéo.
10. Définissez le film de sortie comme suit : day_tissue group_tissue name_experiment.nd2.
11. Exécutez le code macro avec les coordonnées X,Y souhaitées définies sur la scène et acquérez un laps de temps rapide avec 1700 images à 50 images / s.
12. Remplacez le support après l’imagerie et retournez les échantillons à l’incubateur. Prévoyez au moins 24 heures entre les séances d’acquisition d’images pour éviter la fatigue des tissus.

9. Traitement et analyse par lots (jour 24+)

1. Traitement de films
   1. Utilisez le code MATLAB personnalisé pour traiter les vidéos en analyse par lots. Les fichiers peuvent être téléchargés à partir du dossier GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis). Les fonctions sont énumérées et expliquées dans le tableau 2.
      REMARQUE: Le code est compatible avec les formats .nd2 et .czi. Il nécessite un traitement parallèle pour être activé dans MATLAB et nécessite le package de bioformats.
   2. Exécutez le script récursifOSAnalysis pour analyser les films via un traitement parallèle. Ayez toutes les vidéos acquises dans le même dossier et sélectionnez ce dossier lors de l’exécution du code.
   3. Ajustez les paramètres de post-analyse selon vos besoins.
      1. Modifiez l’heure de référence (option 1) si la contraction spontanée est détectée au début de l’enregistrement. Cela montrera une lecture initiale bien au-dessus de 0 et nécessitera que le cadre soit déplacé pour compenser.
      2. Modifiez peakThreshold (option 2) si les contractions ne sont pas enregistrées. Le code détectera par défaut les contractions supérieures à 25 % du pic le plus élevé afin que cette valeur puisse être modifiée.
      3. Modifiez minMinProminence et minMinWidth pour ajuster la sensibilité lors de la détection du début de chaque pic.
   4. Générez une sortie vidéo et graphique.
      1. Exécutez recursiveOSMovie pour générer un fichier vidéo pour chaque tissu avec sa trace de contractilité respective.

10. Perturbation de la fonction NMJ (jour 24+)

1. Préparer les milieux de traitement en ajoutant un effecteur externe au milieu basal NbActiv4 complété par 20 ng/mL BDNF et 10 ng/mL GDNF.
   1. Pour l’expérience de sérum MG, utilisez 20% de sérum de patient MG dans NbActiv4 + BDNF + GDNF.
   2. Pour l’expérience BTX, utilisez 5 μg/mL BTX dans NbActiv4 + BDNF + GDNF.
2. Stimuler/imager à l’aide de l’étape 3.2. pour enregistrer la ligne de base.
3. Remplacer les milieux dans les tissus par des milieux de traitement (450 μL/tissu).
4. Incuber pendant le temps souhaité (48 h pour le sérum du patient, 20 min pour le BTX).
5. Stimuler/imager à nouveau à l’aide de l’étape 3.2. pour enregistrer la fonction après le traitement.
6. Retirer le milieu de traitement et laisser reposer les tissus pendant le temps souhaité (48 h après l’élimination du sérum)
   REMARQUE: Prévoyez au moins 24 heures entre la stimulation et l’imagerie pour éviter la fatigue des tissus

Résultats

Les jonctions neuromusculaires ont été générées par la co-culture de motoneurones optogénétiques dérivés de hiPSC avec du tissu musculaire squelettique non optogénétique. Les myoblastes squelettiques primaires humains (SkM) ont été ensemencés dans les plates-formes et différenciés en myotubes multinucléés en utilisant le protocole de 2 semaines. Les motoneurones optogénétiques ont été différenciés séparément, mais en parallèle avec la différenciation des myotubes, puis ensemencés dans la plat...

Discussion

Ce système est un modèle de tissu humain 3D qui combine l’optogénétique et le traitement vidéo pour permettre une évaluation automatisée et impartiale de la fonction NMJ. En utilisant un protocole standardisé, nous avons démontré la capacité de mesurer les changements dans la fonction NMJ au cours du développement physiologique et de caractériser les effets néfastes de pathologies telles que l’exposition aux neurotoxines et la myasthénie grave des sérums de patients.

Des é...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells
SkMDC	Cook Myosite	P01059-14M
Media and Supplements
Advanced DMEM/F12	ThermoFisher Scientific	12634-020
Bovine Serum Albumin solution	Millipore Sigma	A9576-50ML
G-5 Supplement (100X)	ThermoFisher Scientific	17503-012
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	10131-035
Insulin, Recombinant Human	Millipore Sigma	91077C-100MG
Matrigel	Corning	354277
mTeSR Plus	Stem Cell Technologies	100-0276
MyoTonic Growth Media Kit	Cook Myosite	MK-4444
N-2 Supplement	ThermoFisher Scientific	17502-048
NbActiv4 500 mL	BrainBits LLC	Nb4-500
Neurobasal Medium	ThermoFisher Scientific	21103-049
Neurobasal-A Medium	ThermoFisher Scientific	A13710-01
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	P2443
ReLeSR	Stem Cell Technologies	5872
Plasticware
30 mm cage cube system	ThorLabs	CM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4
37 µm Reversible Strainer, large	Stem Cell Technologies	27250
546 nm short-pass excitation filter	Semrock	FF01-546/SP-25
573 nm dichroic mirror	Semrock	FF573-Di01–25x36
594 nm long- pass emission filter	Semrock	BLP01-594R-25
594 nm long-pass excitation filter	Semrock	BLP01-594R-25
Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA	LuxeonStarLEDs	SP-05-B4
Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic - Integrated Legs	LuxeonStarLEDs	10413
Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture Dish	Corning	3261
Heat sink	LuxeonStarLEDs	LPD-19-10B
Optics
pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterile	PluriSelect	43-50400-03
pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterile	PluriSelect	43-50500-03
Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA	LuxeonStarLEDs	SP-05-R5
ring-actuated iris diaphragm	ThorLabs	SM1D12D
T-Cube LED drivers	ThorLabs	LEDD1B, KPS101
Molds
Female Threaded Hex Standoffs,  3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2"	McMaster	91920A046
Low-Profile C-Clamp	McMaster	1705A12
Growth Factors
Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate	Millipore Sigma	A9501-1G
CHIR 99021, 10 mg	Tocris	4423/10
DAPT 10 mg	R&D Systems	2634/10
Human CNTF, research grade, 5 µg	Miltenyl Biotec	130-096-336
Human Vitronectin Protein, CF	R&D Systems	2349-VN-100
Human Vitronectin Protein, CF	R&D Systems	2349-VN-100
IGF1 Recombinant Human Protein	ThermoFisher Scientific	PHG0078
Laminin mouse protein, natural	ThermoFisher Scientific	23017015
Recombinant Human Agrin Protein	R&D Systems	6624-AG-050
Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ug	R&D Systems	212-GD-050/CF
Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ug	Cell Sciences	CRN500D
Recombinant Human Neurotrophin-4	Cell Sciences	CRN501B
Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus	R&D Systems	1845-SH-100
Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ug	Peprotech	450-02
Retinoic Acid, 50 mg	Millipore Sigma	R2625-50
SAG Smoothened Agonist	Millipore Sigma	566660
SB431542 10 mg	Stem Cell Technologies	72234
StemMACS LDN-193189	Miltenyl Biotec	130-103-925
Vitronectin from human plasma	Millipore Sigma	V8379-50UG
Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254
Antibodies
α-actinin mAb (Mouse IgG1)	Abcam	ab9465
Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat)	Millipore	AB144P
Desmin mAb (Mouse IgG1)	Dako	M076029-2
Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b)	DSHB	MF20
Equipment
Arduino Uno R3	Arduino	A000066
Automated stage	Applied scientific instrumentation	MS- 2000 XYZ
Expanded plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-001 (115V)
Invitrogen Countess Automated Cell Counter	Marshal Scientific	I-CACC
IX-81 Inverted fluorescence microscope	Olympus	IX-ILL100LH
Series Stage Top Incubator System	Tokai Hit STX	TOKAI-HIT-STXG
Zyla 4.2 sCOMS Camera	Andor Technology	ZYLA-4.2P-CL10
Software
Arduino Software (IDE)	Arduino	IDE 1.8.19
Mastercam	Mastercam	Mastercam for Solidworks
Matlab	Matlab	R2021b
NIS elements	Nikon	Basic Research
Solidworks 3D CAD	Solidworks	Solidworks Standard