Ingeniería y caracterización de un modelo optogenético de la unión neuromuscular humana

Resumen

Describimos un sistema de imágenes reproducible, automatizado e imparcial para caracterizar la función de la unión neuromuscular utilizando tejido muscular esquelético diseñado por humanos y motoneuronas optogenéticas. Este sistema permite la cuantificación funcional de la conectividad neuromuscular a lo largo del tiempo y detecta la disminución de la función neuromuscular causada por las neurotoxinas y la miastenia gravis en el suero del paciente.

Resumen

Muchas enfermedades neuromusculares, como la miastenia gravis (MG), están asociadas con la disfunción de la unión neuromuscular (NMJ), que es difícil de caracterizar en modelos animales debido a las diferencias fisiológicas entre animales y humanos. La ingeniería de tejidos ofrece oportunidades para proporcionar modelos in vitro de NMJ humanos funcionales que se pueden utilizar para diagnosticar e investigar patologías de NMJ y probar posibles terapias. Al incorporar proteínas optogenéticas en células madre pluripotentes inducidas (iPSC), generamos neuronas que pueden ser estimuladas con longitudes de onda específicas de luz. Si el NMJ es saludable y funcional, una señal neuroquímica de la motoneurona resulta en la contracción muscular. A través de la integración de la optogenética y la microfabricación con la ingeniería de tejidos, establecimos una metodología imparcial y automatizada para caracterizar la función NMJ utilizando el análisis de video. Se desarrolló un protocolo estandarizado para la formación de NMJ, la estimulación óptica con grabación de video simultánea y el análisis de video de la contractilidad del tejido. La estimulación de motoneuronas optogenéticas por la luz para inducir contracciones del músculo esquelético recapitula la fisiología humana de NMJ y permite mediciones funcionales repetidas de NMJ a lo largo del tiempo y en respuesta a diversas entradas. Demostramos la capacidad de esta plataforma para mostrar mejoras funcionales en la conectividad neuromuscular a lo largo del tiempo y caracterizar los efectos dañinos de los anticuerpos MG o neurotoxinas del paciente en la función NMJ.

Introducción

La unión neuromuscular (NMJ) es la sinapsis química entre las motoneuronas (MN) y las células del músculo esquelético (SkM) que permite la contracción muscular. Las toxinas, como la neurotoxina α-bungarotoxina (BTX), o las enfermedades neuromusculares (NMD) como la miastenia gravis (MG) pueden conducir a la degeneración de la NMJ y reducciones en el control muscular¹. Los modelos de tejidos humanos de bioingeniería recapitulan mejor los mecanismos funcionales y fisiológicos de los NMJ humanos y ofrecen un mayor potencial de traducción que los modelos animales.

Si bien los modelos animales han avanzado en la comprensión de la formación y función del NMJ, existen diferencias significativas entre las sinapsis humanas y animales que limitan la traducción de los resultados a los humanos y hacen que la caracterización in vivo del NMJ sea un desafío ^2,3,4. Los estudios han demostrado diferencias fisiológicas distintas entre los NMJ de ratón y humanos. Los ratones tienen NMJ más grandes y densidades de zona activa más pequeñas en comparación con los NMJ humanos⁴. Además, los estudios de medicamentos realizados en modelos animales no siempre reflejan los efectos encontrados en los ensayos clínicos en humanos. Los modelos de tejido humano diseñados brindan la oportunidad de estudiar el desarrollo saludable de la NMJ y la patología de las enfermedades neuromusculares y permiten la detección de drogas. Las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSCs)⁵ se pueden diferenciar en una variedad de tipos de células, incluidas las células del músculo esquelético ^6,7 y las motoneuronas ^8,9. Las hiPSC se pueden generar fácilmente a partir de células de pacientes, lo que permite un mejor modelado de la enfermedad^{10 y la} detección de fármacos^11,12 a través de modelos de tejido específicos del paciente.

Los cocultivos monocapa bidimensionales (2D) de SkMs y MNs carecen de la morfología, fenotipo, organización y comportamiento funcional de los NMJ fisiológicos. Los NMJ se forman aleatoriamente en cultivo 2D, lo que inhibe el aislamiento de unidades motoras para su análisis, limita las mediciones funcionales precisas e impide su uso para experimentos repetidos y sistemáticos¹³ . Los modelos tisulares tridimensionales (3D) de NMJ superan muchas de estas limitaciones, recapitulando las características morfológicas y funcionales de los NMJ fisiológicos 7,14,15,16,17. Usando este modelo, los dos tipos de tejido se desarrollan por separado y luego se integran dirigiendo el crecimiento axonal, lo que permite que se desarrollen NMJ más organizados en comparación con los sistemas de cultivo 2D.

Nuestro estudio anterior demostró que la combinación de optogenética con ingeniería de tejidos puede permitir una estimulación no invasiva precisa y una evaluación de la función NMJ^18,19. A través de la ingeniería genética, las proteínas sensibles a la luz se pueden integrar en el genoma de las hiPSC. La integración de la canalrodopsina-2 (ChR2), un canal iónico que se abre en respuesta a la luz azul, en la membrana de células excitables como las neuronas permite el control espaciotemporal sin contacto sobre la activación celular 20,21,22. Las hiPSC que transportan ChR2 se pueden diferenciar en motoneuronas optogenéticas sensibles a la luz azul, eliminando la necesidad de electrodos invasivos típicos que estimulan las neuronas y evitando la estimulación no deseada de las células musculares por electrodos²³. Este sistema utiliza motoneuronas optogenéticas para estimular las contracciones en las células del músculo esquelético no optogenético. La combinación de la adquisición de video y la iluminación controlada de luz azul permite que los tejidos cocultivados se estimulen y graben simultáneamente para la función NMJ.

La MG es causada por autoanticuerpos dirigidos a los receptores nicotínicos de acetilcolina (AChR), lo que resulta en una disminución de la función NMJ y debilidad muscular²⁴. Se diagnostica en función de los síntomas presentados, el electrodiagnóstico y la detección de autoanticuerpos a través de análisis de sangre serológicos. Sin embargo, no se han identificado todos los autoanticuerpos implicados en la MG, y algunos pacientes seronegativos son diagnosticados con MG pero sin anticuerpos reconocidos^25,26. Nuestro sistema permite la evaluación funcional repetida de la NMJ antes y después de la adición de suero de pacientes con MG, proporcionando información invaluable sobre los cambios funcionales y bioquímicos causados por los anticuerpos MG¹⁸. Nuestro protocolo ilustra cómo producir modelos 3D in vitro de NMJ humana funcional que se pueden utilizar para diagnosticar e investigar patologías de NMJ y probar posibles terapias. Demostramos la versatilidad del sistema en dos plataformas, un dispositivo microfluídico y una plataforma de biorreactor de pozo abierto más grande.

Protocolo

Todas las líneas celulares para este trabajo fueron creadas y utilizadas de acuerdo con las directrices institucionales de la Universidad de Columbia, NY, EE. UU.

1. Preparación del biorreactor

1. Hacer moldes de biorreactores
   1. Descargue un archivo CAD de biorreactor desde el archivo CAD complementario o cree un diseño propio personalizado.
   2. Genere una trayectoria de herramienta CNC a partir del modelo 3D utilizando el software CAM.
   3. Máquina de moldes de acetal utilizando una fresadora CNC.
2. Fabricación de biorreactores
   1. Mezclar una base 10:1 con la mezcla de agentes de curado de polidimetilsiloxano (PDMS, 77 g de mezcla por 4 plataformas/moldes).
   2. Coloque la mezcla en una cámara de vacío, cierre todas las válvulas, encienda el vacío y desgasifique la mezcla durante al menos 30 minutos hasta que no queden burbujas de aire. Vierta la mezcla en moldes y desgasifique los moldes en la cámara de vacío durante 1 h.
   3. Cierre los moldes con la mitad superior del molde en la orientación correcta. Coloque una varilla hexagonal de acero sobre el centro y una abrazadera en ambos lados.
   4. Rellena la parte superior con PDMS.
   5. Curar los moldes en un horno de 65 °C durante al menos 4 h.
   6. Retire las plataformas de los moldes después de enfriar a temperatura ambiente.
   7. Limpie los dispositivos en un baño ultrasónico utilizando ciclos de 1 h de jabón para platos, 400 ml de isopropanol 100% y agua destilada.
   8. Secar durante la noche a 65 °C.
   9. Remoje las hojas de cubierta de vidrio en poliol surfactante no iónico al 1% durante 30 minutos y asegúrese de que las hojas de cubierta no se apilan para que todas estén debidamente recubiertas.
   10. Enjuague bien con agua destilada y seque durante la noche a 65 °C.
   11. Use un limpiador de plasma en alto con 6 L / min de oxígeno durante 1-2 min para tratar las cubiertas de vidrio y la plataforma PDMS. Una vez tratados, unan los dos presionando el PDMS hacia abajo en el cubrehojas durante al menos 30 s.
   12. Autoclave los dispositivos enlazados antes de agregar celdas.

2. Construcción de una configuración de estimulación óptica

1. Usando un sistema de cubo de jaula de 30 mm, coloque un espejo dicroico de 573 nm en el centro. Acople un LED rojo de 627 nm con un filtro de excitación de paso largo de 594 nm y conéctelo a la parte superior del cubo, con el LED mirando hacia el espejo. A continuación, conecte un LED azul de 488 nm con un filtro de excitación de paso corto de 546 nm al lado adyacente del cubo, con el LED mirando hacia el espejo como se muestra en el esquema de la Figura 3A.
2. Conecte un diafragma de iris accionado por anillo a la parte inferior del cubo de la jaula para controlar el tamaño del área iluminada.
3. Encienda cada LED mediante un controlador LED T-Cube y controle a través de una placa Arduino Uno Rev3. Conecte la entrada lateral del controlador LED a un enchufe de fuente de alimentación, conecte la salida central al Arduino y conecte la salida lateral directamente a los LED.
4. Conecte el Arduino Uno a un PC mediante un cable USB.
5. Descargar archivos desde el enlace de GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis).
6. Abra el archivo "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" de la carpeta GitHub.
7. Establecer parámetros de inicio: Pasos = 30; startFrequency = 0,5; endFrequency = 3; pulseLongitud = 100.
8. Asegúrese de que la salida del pin 4 esté asignada al controlador led azul y la salida del pin 2 se asigne al controlador LED rojo. Compruebe que los cables centrales del controlador LED estén conectados a tierra y a la salida del pin respectivo.
9. Compile y cargue el programa "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" en Arduino.
10. Conecte cada controlador LED a su canal correspondiente.

3. Configuración del cultivo celular (día -21-0)

1. Células primarias del músculo esquelético
   1. Descongelar y expandir los mioblastos esqueléticos primarios (obtenidos de Cook Myosite) para un máximo de seis pasajes utilizando el medio de crecimiento miotónico (+ suplemento). Mantenga las células en una incubadora a 37 °C y 5% de CO₂.
   2. Cambie los medios cada 2 días.
   3. Una vez que las células son aproximadamente 60% confluentes, páselas usando 0.05% de tripsina-EDTA (1x, durante 5 min a 37 °C). Recoge las células disociadas y añade medios frescos para neutralizar la tripsina.
   4. Gire hacia abajo las células a 300 x g y aspire el sobrenadante por encima de la bolita celular.
   5. Resuspendir las células con MGM y sembrar 1:3 con 60 mL por matraz de triple capa.
2. ChR2-hiPSC
   NOTA: Todas las líneas celulares para este trabajo fueron creadas y utilizadas de acuerdo con las directrices institucionales de la Universidad de Columbia, NY, EE. UU. En este protocolo, las hiPSC que expresan ChR2 se generaron a través de la edición del genoma CRISPR-Cas9 utilizando métodos^{previamente descritos 18}, pero cualquier línea celular optogenética estable (lentiviral, piggyBac, etc.) se puede usar de la misma manera. Se eligieron promotores constitutivos expresados tanto en iPSCs como en motoneuronas (CAG). Se encontró que las células tenían cariotipo sano, como se señaló en publicaciones anteriores^18,19.
   1. Cubra las placas de 6 pocillos con 1 ml/pocillo de matriz de membrana basal solubilizada diluida en DMEM/F12 (1:80) e incube las placas a temperatura ambiente durante 1 h.
   2. Semillas iPSC en placas recubiertas de 6 pocillos con 2 ml de medio de cultivo celular sin alimentador (medios iPSC), intercambiando 2 ml de medios cada dos días y pasando cada 5-7 días. Mantenga las células en una incubadora a 37 ^{° C y 5% de CO}₂.
   3. Pasaje
      1. Disociar las células madre incubando con 1 ml de reactivo liberador de células madre libres de enzimas durante 4 min y esquilando mecánicamente con una pipeta P1000 de punta ancha.
      2. Células de semilla en una proporción de 1:24 o 1:48 en medios iPSC con 2 μM de diclorhidrato de Y-27632 en 2 ml/pozo sobre placas recubiertas de 6 pocillos.

4. Siembra de tejido muscular esquelético (día -3)

1. Aísle y cuente 30 x 10⁶ mioblastos utilizando un contador celular automatizado.
2. Resuspendir los mioblastos en una mezcla 4:1 de colágeno I de 3 mg/mL y matriz de membrana basal solubilizada (800 μL de mezcla de colágeno + 200 μL de matriz de membrana basal para alcanzar un volumen final de 1 mL). Para el componente de colágeno, agregue el agente neutralizante acompañante (mezcla 9: 1 de colágeno a agente neutralizante) y diluya la mezcla con 1x PBS para lograr un volumen de 800 μL.
3. Agregue 15 μL de suspensión de colágeno celular a cada cámara muscular del biorreactor, asegurándose de extender la suspensión a través de ambos pilares usando la punta de la pipeta (Figura 2).
4. Deje polimerizar la mezcla de gel celular a 37 °C durante 30 min y luego llene bien cada biorreactor con 450 μL de medios de crecimiento miotónico.
5. Después de 3 días (una vez que el gel se haya compactado), comience la diferenciación de miotubos.

5. Diferenciación de myotube (días 0-14)

1. Comience la infusión de miotubos cambiando los tejidos a 450 μL de medios inductores de fusión (FS, Tabla 1) durante 7 días, cambiando el medio cada dos días.
   NOTA: Trate de comenzar la diferenciación de miotubos el mismo día que la diferenciación de motoneuronas de hiPSC para sembrar motoneuronas al final de los programas de diferenciación de ambos tipos de células.
2. El día 7 cambiar el medio a 450 μL de medio de maduración Ia (MMIa, Tabla 1).
3. En el día 9, cambio a 450 μL de medios de maduración Ib (MMIb, Tabla 1).
4. El día 11, cambie el medio a 450 μL de NbActiv4. Siga cambiando los medios cada 2 días hasta que las motoneuronas se sembran (Paso 7).

6. Diferenciación de motoneuronas (días 0-14)

NOTA: Nuestro protocolo de diferenciación de motoneuronas fue adaptado de Maury et al⁸.

1. El día 0, transfiera 4 x 10⁶ ChR2- hiPSCs a una placa de Petri de fijación ultra baja con 15 ml de medio de cultivo en suspensión de motoneuronas (MSCM, Tabla 1). Suplemento MSCM con 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 hidrato y 5 μM Y-27632 diclorhidrato.
2. El día 2, aislar las neuroesferas (NS) con un colador reversible de 37 μM y replatar en 15 ml de MSCM con 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 hidrato y 0,1 μM de ácido retinoico. El NS debe ser visible en la placa de Petri sin usar un microscopio después del día 2.
3. En el día 4, transfiera las células y los medios a un tubo de 50 ml y permita que las neuroesferas se asienten en el fondo (5 min). Aspirar el sobrenadante y resuspend las células en 15 mL de MSCM suplementado con 0,5 μM SAG, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431541 y ácido retinoico 0,1 μM.
4. El día 7, repita el paso 6.3. pero resuspend las células en 15 ml de MSCM suplementado con 0,5 μM de SAG y 0,1 μM de ácido retinoico.
5. El día 9, repita el paso 6.3. pero células resuspend en 15 ml de MSCM suplementadas con 10 μM DAPT.
6. El día 11, repita el paso 6.3. pero resuspend las células en 15 mL de MSCM suplementado con 20 ng/mL BDNF y 10 ng/mL GDNF.
7. El día 14, siembra las motoneuronas en la plataforma.

7. Siembra de agregados de motoneuronas en biorreactor (día 14)

1. Preparar una mezcla en gel 4:1 de 2 mg/mL de colágeno I y Matrigel (800 μL de mezcla de colágeno + 200 μL de Matrigel para alcanzar un volumen final de 1 mL). Para el componente de colágeno, agregue el agente neutralizante acompañante (mezcla 9: 1 de colágeno a agente neutralizante) y diluya la mezcla con 1x PBS para lograr un volumen final de 800 μL.
2. Utilice un colador celular de 400 nm para seleccionar neuroesferas grandes y resuspendírlas en la mezcla de gel.
3. Aspirar medios desde el reservorio y cuidadosamente desde el pozo de la neuroesfera (Figura 2).
4. Agregue 15 μL de mezcla de gel en el canal de la neuroesfera.
5. Cargue una pipeta de 10 μL con 10 μL de gel y luego elija una neuroesfera.
6. Deposite el NS en el canal de la neuroesfera y asegúrese de que el NS esté en la cámara. Levante lentamente la pipeta mientras libera el gel restante una vez que se deposita el NS. Si no está seguro de que el NS se haya depositado correctamente, verifique su ubicación con un microscopio.
7. Deje que el gel polimerice durante 30 min a 37 °C.
8. Añadir 450 μL de NbActiv4 suplementado con 20 ng/mL BDNF y 10 ng/mL GDNF a los reservorios.
9. Cambie los medios cada dos días para permitir el crecimiento axonal de NS a tejido muscular.

8. Estimulación óptica simultánea y grabación de video de la función NMJ (día 24+)

1. Para obtener imágenes, utilice un microscopio fluorescente invertido con una cámara científica complementaria de metal-óxido-semiconductor (sCMOS).
2. Ajuste el binning del software de la cámara a 2x2, exposición a 20 ms, obturador rodante ON, velocidad de lectura a 540 MHz, rango dinámico: 12 bits y ganancia 1, y modo de sensor: superposición.
3. Utilice el objetivo 2x en el microscopio para obtener imágenes de los microtejidos.
4. Conecte una cámara de células vivas (37 °C, 5% de CO₂) a la etapa del microscopio.
5. Seleccione la región de interés (ROI) que contiene el tejido de los tejidos esqueléticos inervados para minimizar el tamaño del archivo y el tiempo de procesamiento.
6. Coloque un filtro de emisión de paso largo de 594 nm entre la muestra y el objetivo de imagen para filtrar los pulsos de luz azul de la cámara.
7. Coloque una placa rectangular de 4 pocillos que contenga 4 biorreactores (24 tejidos) en la cámara de células vivas.
8. Haz clic en Live View. Centra y enfoca la imagen con el ROI deseado.
9. Cargue el código de macro personalizado desde la carpeta github (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) para controlar la posición del escenario, la placa Arduino y la adquisición de video.
10. Establezca la película de salida como: day_tissue group_tissue name_experiment.nd2.
11. Ejecute el código de macro con las coordenadas X, Y deseadas establecidas en el escenario y adquiera un lapso de tiempo rápido con 1700 cuadros a 50 cuadros / s.
12. Reemplace el medio después de la toma de imágenes y devuelva las muestras a la incubadora. Permita al menos 24 horas entre las sesiones de adquisición de imágenes para evitar la fatiga tisular.

9. Procesamiento y análisis por lotes (día 24+)

1. Procesamiento de películas
   1. Utilice el código personalizado de MATLAB para procesar los vídeos en el análisis por lotes. Los archivos se pueden descargar desde la carpeta GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis). Las funciones se enumeran y explican en la Tabla 2.
      NOTA: El código es compatible con los formatos .nd2 y .czi. Requiere que el procesamiento paralelo se active en MATLAB y necesita el paquete de bioformatos.
   2. Ejecute el script recursiveOSAnalysis para analizar las películas a través del procesamiento paralelo. Tenga todos los videos adquiridos en la misma carpeta y seleccione esa carpeta cuando ejecute el código.
   3. Ajuste los parámetros posteriores al análisis según sea necesario.
      1. Cambie la línea de baseTiempo (opción 1) si se detecta una contracción espontánea al comienzo de la grabación. Esto mostrará una lectura inicial muy por encima de 0 y necesitará que el marco se desplace para compensar.
      2. Cambie peakThreshold (opción 2) si las contracciones no se están registrando. El código detectará contracciones que están por encima del 25% del pico más alto de forma predeterminada para que este valor se pueda cambiar.
      3. Cambie minMinProminence y minMinWidth para ajustar la sensibilidad al detectar el inicio de cada pico.
   4. Genere salida de video y gráficos.
      1. Ejecute recursiveOSMovie para generar un archivo de video para cada tejido con su respectivo rastro de contractilidad.

10. Perturbación de la función NMJ (día 24+)

1. Preparar los medios de tratamiento añadiendo un efector externo a los medios basales NbActiv4 suplementados con 20 ng/mL BDNF y 10 ng/mL GDNF.
   1. Para el experimento de sueros de MG, use sueros de pacientes con MG al 20% en NbActiv4 + BDNF + GDNF.
   2. Para el experimento BTX, utilice 5 μg/mL BTX en NbActiv4 + BDNF + GDNF.
2. Estimular/visualizar usando el Paso 3.2. para registrar la línea base.
3. Reemplace los medios en los tejidos con medios de tratamiento (450 μL/tejido).
4. Incubar durante el tiempo deseado (48 h para sueros de paciente, 20 min para BTX).
5. Estimular/visualizar de nuevo usando el Paso 3.2. para registrar la función después del tratamiento.
6. Retire los medios de tratamiento y deje que los tejidos descansen durante el tiempo deseado (48 h después de la extracción de sueros)
   NOTA: Permita al menos 24 horas entre la estimulación y la obtención de imágenes para evitar la fatiga tisular

Resultados

Las uniones neuromusculares se generaron mediante el co-cultivo de motoneuronas derivadas de hiPSC optogenéticas con tejido muscular esquelético no optogenético. Los mioblastos esqueléticos primarios humanos (SkM) se sembraron en las plataformas y se diferenciaron en miotubos multinucleados utilizando el protocolo de 2 semanas. Las motoneuronas optogenéticas se diferenciaron por separado, pero en paralelo con la diferenciación de miotubos, y luego se sembraron en la plataforma (Figura 1

Discusión

Este sistema es un modelo de tejido humano 3D diseñado que combina optogenética y procesamiento de video para permitir una evaluación automatizada e imparcial de la función NMJ. Utilizando un protocolo estandarizado, hemos demostrado la capacidad de medir los cambios en la función de NMJ durante el desarrollo fisiológico y caracterizar los efectos dañinos de patologías como la exposición a neurotoxinas y los sueros de pacientes con miastenia gravis.

Estudios previos han reportado la c...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells
SkMDC	Cook Myosite	P01059-14M
Media and Supplements
Advanced DMEM/F12	ThermoFisher Scientific	12634-020
Bovine Serum Albumin solution	Millipore Sigma	A9576-50ML
G-5 Supplement (100X)	ThermoFisher Scientific	17503-012
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	10131-035
Insulin, Recombinant Human	Millipore Sigma	91077C-100MG
Matrigel	Corning	354277
mTeSR Plus	Stem Cell Technologies	100-0276
MyoTonic Growth Media Kit	Cook Myosite	MK-4444
N-2 Supplement	ThermoFisher Scientific	17502-048
NbActiv4 500 mL	BrainBits LLC	Nb4-500
Neurobasal Medium	ThermoFisher Scientific	21103-049
Neurobasal-A Medium	ThermoFisher Scientific	A13710-01
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	P2443
ReLeSR	Stem Cell Technologies	5872
Plasticware
30 mm cage cube system	ThorLabs	CM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4
37 µm Reversible Strainer, large	Stem Cell Technologies	27250
546 nm short-pass excitation filter	Semrock	FF01-546/SP-25
573 nm dichroic mirror	Semrock	FF573-Di01–25x36
594 nm long- pass emission filter	Semrock	BLP01-594R-25
594 nm long-pass excitation filter	Semrock	BLP01-594R-25
Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA	LuxeonStarLEDs	SP-05-B4
Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic - Integrated Legs	LuxeonStarLEDs	10413
Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture Dish	Corning	3261
Heat sink	LuxeonStarLEDs	LPD-19-10B
Optics
pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterile	PluriSelect	43-50400-03
pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterile	PluriSelect	43-50500-03
Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA	LuxeonStarLEDs	SP-05-R5
ring-actuated iris diaphragm	ThorLabs	SM1D12D
T-Cube LED drivers	ThorLabs	LEDD1B, KPS101
Molds
Female Threaded Hex Standoffs,  3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2"	McMaster	91920A046
Low-Profile C-Clamp	McMaster	1705A12
Growth Factors
Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate	Millipore Sigma	A9501-1G
CHIR 99021, 10 mg	Tocris	4423/10
DAPT 10 mg	R&D Systems	2634/10
Human CNTF, research grade, 5 µg	Miltenyl Biotec	130-096-336
Human Vitronectin Protein, CF	R&D Systems	2349-VN-100
Human Vitronectin Protein, CF	R&D Systems	2349-VN-100
IGF1 Recombinant Human Protein	ThermoFisher Scientific	PHG0078
Laminin mouse protein, natural	ThermoFisher Scientific	23017015
Recombinant Human Agrin Protein	R&D Systems	6624-AG-050
Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ug	R&D Systems	212-GD-050/CF
Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ug	Cell Sciences	CRN500D
Recombinant Human Neurotrophin-4	Cell Sciences	CRN501B
Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus	R&D Systems	1845-SH-100
Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ug	Peprotech	450-02
Retinoic Acid, 50 mg	Millipore Sigma	R2625-50
SAG Smoothened Agonist	Millipore Sigma	566660
SB431542 10 mg	Stem Cell Technologies	72234
StemMACS LDN-193189	Miltenyl Biotec	130-103-925
Vitronectin from human plasma	Millipore Sigma	V8379-50UG
Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254
Antibodies
α-actinin mAb (Mouse IgG1)	Abcam	ab9465
Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat)	Millipore	AB144P
Desmin mAb (Mouse IgG1)	Dako	M076029-2
Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b)	DSHB	MF20
Equipment
Arduino Uno R3	Arduino	A000066
Automated stage	Applied scientific instrumentation	MS- 2000 XYZ
Expanded plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-001 (115V)
Invitrogen Countess Automated Cell Counter	Marshal Scientific	I-CACC
IX-81 Inverted fluorescence microscope	Olympus	IX-ILL100LH
Series Stage Top Incubator System	Tokai Hit STX	TOKAI-HIT-STXG
Zyla 4.2 sCOMS Camera	Andor Technology	ZYLA-4.2P-CL10
Software
Arduino Software (IDE)	Arduino	IDE 1.8.19
Mastercam	Mastercam	Mastercam for Solidworks
Matlab	Matlab	R2021b
NIS elements	Nikon	Basic Research
Solidworks 3D CAD	Solidworks	Solidworks Standard