Ingegnerizzazione e caratterizzazione di un modello optogenetico della giunzione neuromuscolare umana

Riepilogo

Descriviamo un sistema di imaging riproducibile, automatizzato e imparziale per caratterizzare la funzione di giunzione neuromuscolare utilizzando tessuto muscolare scheletrico ingegnerizzato umano e motoneuroni optogenetici. Questo sistema consente la quantificazione funzionale della connettività neuromuscolare nel tempo e rileva una diminuzione della funzione neuromuscolare causata da neurotossine e miastenia grave del siero del paziente.

Abstract

Molte malattie neuromuscolari, come la miastenia grave (MG), sono associate a disfunzione della giunzione neuromuscolare (NMJ), che è difficile da caratterizzare nei modelli animali a causa delle differenze fisiologiche tra animali e umani. L'ingegneria tissutale offre l'opportunità di fornire modelli in vitro di NMJ umani funzionali che possono essere utilizzati per diagnosticare e studiare patologie NMJ e testare potenziali terapie. Incorporando proteine optogenetiche in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), abbiamo generato neuroni che possono essere stimolati con specifiche lunghezze d'onda della luce. Se l'NMJ è sano e funzionale, un segnale neurochimico dal motoneurone provoca la contrazione muscolare. Attraverso l'integrazione dell'optogenetica e della microfabbricazione con l'ingegneria tissutale, abbiamo stabilito una metodologia imparziale e automatizzata per caratterizzare la funzione NMJ utilizzando l'analisi video. È stato sviluppato un protocollo standardizzato per la formazione di NMJ, la stimolazione ottica con registrazione video simultanea e l'analisi video della contrattilità tissutale. La stimolazione dei motoneuroni optogenetici da parte della luce per indurre contrazioni muscolari scheletriche ricapitola la fisiologia NMJ umana e consente ripetute misurazioni funzionali di NMJ nel tempo e in risposta a vari input. Dimostriamo la capacità di questa piattaforma di mostrare miglioramenti funzionali nella connettività neuromuscolare nel tempo e caratterizzare gli effetti dannosi degli anticorpi MG del paziente o delle neurotossine sulla funzione NMJ.

Introduzione

La giunzione neuromuscolare (NMJ) è la sinapsi chimica tra motoneuroni (MN) e cellule muscolari scheletriche (SkM) che consente la contrazione muscolare. Le tossine, come la neurotossina α-bungarotossina (BTX), o le malattie neuromuscolari (NMD) come la miastenia grave (MG) possono portare alla degenerazione del NMJ e alla riduzione del controllo muscolare¹. I modelli di tessuto umano bioingegnerizzati ricapitolano meglio i meccanismi funzionali e fisiologici degli NMJ umani e offrono un maggiore potenziale traslazionale rispetto ai modelli animali.

Mentre i modelli animali hanno avanzato la comprensione della formazione e della funzione del NMJ, ci sono differenze significative tra sinapsi umane e animali che limitano la traduzione dei risultati all'uomo e rendono la caratterizzazione in vivo del NMJ impegnativo ^2,3,4. Gli studi hanno mostrato differenze fisiologiche distinte tra NMJ di topo e umani. I topi hanno NMJ più grandi e densità di zone attive più piccole rispetto agli NMJ umani⁴. Inoltre, gli studi farmacologici condotti su modelli animali non sempre riflettono gli effetti riscontrati negli studi clinici sull'uomo. I modelli di tessuto umano ingegnerizzati offrono l'opportunità di studiare lo sviluppo sano del NMJ e la patologia delle malattie neuromuscolari e consentono screening farmacologici. Le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSCs)⁵ possono essere differenziate in una varietà di tipi di cellule, comprese le cellule muscolari scheletriche ^6,7 e i motoneuroni ^8,9. Le hiPSC possono essere generate facilmente dalle cellule del paziente, consentendo una migliore modellazione della malattia¹⁰ e lo screening farmacologico ^11,12 attraverso modelli tissutali specifici per il paziente.

Le co-colture monostrato bidimensionali (2D) di SkM e MN mancano della morfologia, del fenotipo, dell'organizzazione e del comportamento funzionale degli NMJ fisiologici. Gli NMJ si formano casualmente in coltura 2D, il che inibisce l'isolamento delle unità motorie per l'analisi, limita le misurazioni funzionali accurate e ne impedisce l'uso per esperimenti ripetuti e sistematici¹³ . I modelli tissutali tridimensionali (3D) di NMJ superano molte di queste limitazioni, ricapitolando le caratteristiche morfologiche e funzionali delle NMJ fisiologiche 7,14,15,16,17. Utilizzando questo modello, i due tipi di tessuto vengono sviluppati separatamente e quindi integrati dirigendo la crescita assonale, consentendo lo sviluppo di NMJ più organizzati rispetto ai sistemi di coltura 2D.

Il nostro studio precedente ha dimostrato che la combinazione di optogenetica con l'ingegneria tissutale può consentire un'accurata stimolazione non invasiva e la valutazione della funzione NMJ^18,19. Attraverso l'ingegneria genetica, le proteine sensibili alla luce possono essere integrate nel genoma delle hiPSC. L'integrazione di channelrhodopsin-2 (ChR2), un canale ionico che si apre in risposta alla luce blu, nella membrana di cellule eccitabili come i neuroni consente il controllo spaziotemporale senza contatto sull'attivazione cellulare 20,21,22. Le hiPSC che trasportano ChR2 possono essere differenziate in motoneuroni optogenetici sensibili alla luce blu, eliminando la necessità di elettrodi invasivi tipici che stimolano i neuroni ed evitando la stimolazione indesiderata delle cellule muscolari da parte degli elettrodi²³. Questo sistema utilizza motoneuroni optogenetici per stimolare le contrazioni nelle cellule muscolari scheletriche non optogenetiche. La combinazione di acquisizione video e illuminazione controllata della luce blu consente di stimolare e registrare simultaneamente i tessuti co-coltivati per la funzione NMJ.

MG è causato da autoanticorpi che prendono di mira i recettori nicotinici dell'acetilcolina (AChR), che si traduce in diminuzione della funzione NMJ e debolezza muscolare²⁴. Viene diagnosticata in base ai sintomi presentati, all'elettrodiagnosi e al rilevamento di autoanticorpi tramite esami del sangue sierologici. Tuttavia, non tutti gli autoanticorpi coinvolti nella MG sono stati identificati e ad alcuni pazienti sieronegativi viene diagnosticata la MG ma senza anticorpi riconosciuti^25,26. Il nostro sistema consente una valutazione funzionale ripetuta dell'NMJ prima e dopo l'aggiunta di siero da pazienti con MG, fornendo preziose informazioni sui cambiamenti funzionali e biochimici causati dagli anticorpi MG¹⁸. Il nostro protocollo illustra come produrre modelli 3D in vitro di NMJ umano funzionale che possono essere utilizzati per diagnosticare e studiare patologie NMJ e testare potenziali terapie. Dimostriamo la versatilità del sistema in due piattaforme, un dispositivo microfluidico e una più grande piattaforma di bioreattore a pozzo aperto.

Protocollo

Tutte le linee cellulari per questo lavoro sono state create e utilizzate in conformità con le linee guida istituzionali della Columbia University, NY, USA.

1. Preparazione del bioreattore

1. Realizzare stampi per bioreattori
   1. Scaricare un file CAD del bioreattore dal file CAD supplementare o creare un progetto personalizzato.
   2. Generare un percorso utensile CNC dal modello 3D utilizzando il software CAM.
   3. Macchina stampi acetali utilizzando una fresatrice CNC.
2. Fabbricazione di bioreattori
   1. Mescolare una base 10:1 alla miscela di agenti polimerizzanti di polidimetilsilossano (PDMS, 77 g di miscela per 4 piattaforme/stampi).
   2. Posizionare la miscela in una camera a vuoto, chiudere tutte le valvole, accendere il vuoto e degassare la miscela per almeno 30 minuti fino a quando non rimangono bolle d'aria. Versare la miscela in stampi e degassare gli stampi nella camera a vuoto per 1 ora.
   3. Chiudere gli stampi con la metà superiore dello stampo nell'orientamento corretto. Posizionare un'asta esagonale in acciaio sopra il centro e bloccare su entrambi i lati.
   4. Riempi la parte superiore con PDMS.
   5. Polimerizzare gli stampi in forno a 65 °C per almeno 4 ore.
   6. Rimuovere le piattaforme dagli stampi dopo il raffreddamento a temperatura ambiente.
   7. Pulire i dispositivi in un bagno ad ultrasuoni utilizzando cicli di 1 ora di sapone per i piatti, 400 ml di isopropanolo al 100% e acqua distillata.
   8. Asciugare durante la notte a 65 °C.
   9. Immergere le coperture in vetro in poliolo tensioattivo non ionico all'1% per 30 minuti e assicurarsi che le coperture non si impilano in modo che siano tutte adeguatamente rivestite.
   10. Risciacquare bene con acqua distillata e asciugare per una notte a 65 °C.
   11. Utilizzare un detergente al plasma in alto con 6 L / min di ossigeno per 1-2 minuti per trattare i coperchi di vetro e la piattaforma PDMS. Una volta trattati, legare i due insieme premendo il PDMS verso il basso sulla coverslip per almeno 30 s.
   12. Autoclave dei dispositivi incollati prima di aggiungere celle.

2. Costruire una configurazione di stimolazione ottica

1. Utilizzando un sistema a cubo a gabbia da 30 mm, collegare uno specchio dicroico da 573 nm al centro. Accoppia un LED rosso da 627 nm con un filtro di eccitazione a lungo passaggio da 594 nm e collegalo al lato superiore del cubo, con il LED rivolto verso lo specchio. Quindi collegare un LED blu da 488 nm con un filtro di eccitazione a passaggio corto da 546 nm sul lato adiacente del cubo, con il LED rivolto verso lo specchio come mostrato nello schema nella Figura 3A.
2. Attaccare un diaframma dell'iride azionato ad anello sul fondo del cubo della gabbia per controllare le dimensioni dell'area illuminata.
3. Alimenta ogni LED da un driver LED T-Cube e controllalo tramite una scheda Arduino Uno Rev3. Collegare l'ingresso laterale del driver LED a una spina della fonte di alimentazione, collegare l'uscita centrale ad Arduino e collegare l'uscita laterale direttamente ai LED.
4. Collegare Arduino Uno ad un PC tramite un cavo USB.
5. Scaricare file dal collegamento GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis).
6. Apri il file "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" dalla cartella GitHub.
7. Impostare i parametri di partenza: Passi = 30; startFrequency = 0,5; endFrequency = 3; pulseLength = 100.
8. Assicurarsi che l'uscita pin 4 sia assegnata al driver LED blu e che l'uscita pin 2 sia assegnata al driver LED rosso. Verificare che i fili centrali del driver LED siano collegati a terra e alla rispettiva uscita pin.
9. Compila e carica il programma "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" su Arduino.
10. Collegare ogni driver LED al canale corrispondente.

3. Configurazione della coltura cellulare (giorno -21-0)

1. Cellule muscolari scheletriche primarie
   1. Scongelare ed espandere i mioblasti scheletrici primari (ottenuti da Cook Myosite) per un massimo di sei passaggi utilizzando il mezzo di crescita miotonico (+ supplemento). Mantenere le celle in un incubatore impostato a 37 °C e 5% CO₂.
   2. Cambia i media ogni 2 giorni.
   3. Una volta che le cellule sono confluenti per circa il 60%, passarle usando lo 0,05% di tripsina-EDTA (1x, per 5 minuti a 37 °C). Raccogliere le cellule dissociate e aggiungere nuovi mezzi per neutralizzare la tripsina.
   4. Abbassare le cellule a 300 x g e aspirare il surnatante sopra il pellet cellulare.
   5. Risospese le cellule con MGM e seme 1:3 con 60 ml per pallone a triplo strato.
2. ChR2-hiPSC
   NOTA: Tutte le linee cellulari per questo lavoro sono state create e utilizzate in conformità con le linee guida istituzionali della Columbia University, NY, USA. In questo protocollo, le hiPSC che esprimono ChR2 sono state generate tramite l'editing del genoma CRISPR-Cas9 utilizzando i metodi precedentemente descritti¹⁸, ma qualsiasi linea cellulare optogenetica stabile (lentivirale, piggyBac, ecc.) può essere utilizzata allo stesso modo. Sono stati scelti promotori costitutivi espressi sia in iPSC che in motoneuroni (CAG). Le cellule sono risultate avere cariotipo sano, come notato in precedenti pubblicazioni ^18,19.
   1. Rivestire piastre a 6 pozzetti con 1 mL/pozzetto di matrice di membrana basale solubilizzata diluita in DMEM/F12 (1:80) e incubare le piastre a temperatura ambiente per 1 ora.
   2. Semina iPSC su piastre rivestite a 6 pozzetti con 2 mL di terreno di coltura cellulare privo di alimentatore (iPSC media), scambiando 2 mL di media a giorni alterni e passando ogni 5-7 giorni. Mantenere le cellule in un incubatore impostato a 37 ^{° C e 5% CO}₂.
   3. Passaggio
      1. Dissociare le cellule staminali incubando con 1 mL di reagente rilasciando cellule staminali prive di enzimi per 4 minuti e tagliando meccanicamente con una pipetta P1000 a punta larga.
      2. Cellule di semi in un rapporto di 1:24 o 1:48 in mezzi iPSC con 2 μM di dicloridrato Y-27632 in 2 ml/pozzetto su piastre rivestite a 6 pozzetti.

4. Semina del tessuto muscolare scheletrico (giorno -3)

1. Isolare e contare 30 x 10⁶ mioblasti utilizzando un contatore cellulare automatizzato.
2. Sospendere i mioblasti in una miscela 4:1 di 3 mg/mL di collagene I e matrice solubilizzata della membrana basale (800 μL di miscela di collagene + 200 μL di matrice di membrana basale per raggiungere un volume finale di 1 mL). Per il componente collagene, aggiungere l'agente neutralizzante di accompagnamento (miscela 9:1 di collagene all'agente neutralizzante) e diluire la miscela con 1x PBS per ottenere un volume di 800 μL.
3. Aggiungere 15 μL di sospensione di collagene cellulare a ciascuna camera muscolare del bioreattore, assicurandosi di distribuire la sospensione su entrambi i pilastri utilizzando la punta della pipetta (Figura 2).
4. Lasciare polimerizzare la miscela cellula-gel a 37 °C per 30 minuti e quindi riempire bene ogni bioreattore con 450 μL di terreno di crescita miotonico.
5. Dopo 3 giorni (una volta che il gel si è compattato), iniziare la differenziazione del miotubo.

5. Differenziazione miotubica (giorni 0-14)

1. Iniziare l'infusione di miotubi commutando i tessuti a 450 μL di mezzi che inducono la fusione (FS, Tabella 1) per 7 giorni, cambiando i mezzi a giorni alterni.
   NOTA: Provare a iniziare la differenziazione dei miotubi lo stesso giorno della differenziazione dei motoneuroni dalle hiPSC al fine di seminare i motoneuroni alla fine dei programmi di differenziazione di entrambi i tipi di cellule.
2. Il giorno 7 cambiare il mezzo a 450 μL di terreno di maturazione Ia (MMIa, Tabella 1).
3. Il giorno 9, passare a 450 μL di terreno di maturazione Ib (MMIb, Tabella 1).
4. Il giorno 11, cambiare il supporto a 450 μL di NbActiv4. Continuare a cambiare il supporto ogni 2 giorni fino a quando i motoneuroni non sono seminati (Passaggio 7).

6. Differenziazione del motoneurone (giorni 0-14)

NOTA: Il nostro protocollo di differenziazione dei motoneuroni è stato adattato da Maury et al⁸.

1. Il giorno 0, trasferire 4 x 10⁶ ChR2- hiPSC su una capsula di Petri ad attacco ultra-basso con 15 mL di terreno di coltura di sospensione del motoneurone (MSCM, Tabella 1). Integrare MSCM con 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 idrato e 5 μM Y-27632 dicloridrato.
2. Il giorno 2, isolare le neurosfere (NS) con un filtro reversibile da 37 μM e riplazionare in 15 mL di MSCM con 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 idrato e 0,1 μM di acido retinoico. NS dovrebbe essere visibile nella capsula di Petri senza usare un microscopio dopo il giorno 2.
3. Il giorno 4, trasferire le cellule e i mezzi in un tubo da 50 ml e consentire alle neurosfere di depositarsi sul fondo (5 minuti). Aspirare il surnatante e risospesare le cellule in 15 ml di MSCM integrati con 0,5 μM SAG, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431541 e 0,1 μM di acido retinoico.
4. Il giorno 7, ripetere il passaggio 6.3. ma risospese le cellule in 15 mL di MSCM integrati con 0,5 μM SAG e 0,1μM di acido retinoico.
5. Il giorno 9, ripetere il passaggio 6.3. ma le cellule risospese in 15 mL di MSCM integrate con 10 μM DAPT.
6. Il giorno 11, ripetere il passaggio 6.3. ma risospese le cellule in 15 mL di MSCM integrate con 20 ng/mL BDNF e 10 ng/mL GDNF.
7. Il giorno 14, semina i motoneuroni nella piattaforma.

7. Semina di aggregati di motoneuroni in bioreattore (giorno 14)

1. Preparare una miscela di gel 4:1 di 2 mg/mL di collagene I e Matrigel (800 μL di miscela di collagene + 200 μL di Matrigel per raggiungere un volume finale di 1 mL). Per il componente collagene, aggiungere l'agente neutralizzante di accompagnamento (miscela 9:1 di collagene all'agente neutralizzante) e diluire la miscela con 1x PBS per ottenere un volume finale di 800 μL.
2. Utilizzare un filtro cellulare da 400 nm per selezionare grandi neurosfere e risospescerle nella miscela di gel.
3. Aspirare i mezzi dal serbatoio e con attenzione dal pozzo della neurosfera (Figura 2).
4. Aggiungere 15 μL di miscela di gel nel canale della neurosfera.
5. Caricare una pipetta da 10 μL con 10 μL di gel e quindi scegliere una neurosfera.
6. Depositare la NS nel canale della neurosfera e assicurarsi che la NS sia nella camera. Sollevare lentamente la pipetta rilasciando il gel rimanente una volta depositato l'NS. Se non sei sicuro che l'NS sia stato depositato correttamente, controlla la sua posizione usando un microscopio.
7. Lasciare polimerizzare il gel per 30 minuti a 37 °C.
8. Aggiungere 450 μL di NbActiv4 integrati con 20 ng/mL BDNF e 10 ng/mL GDNF ai serbatoi.
9. Cambia i media a giorni alterni per consentire la crescita assonale dalla NS al tessuto muscolare.

8. Stimolazione ottica simultanea e registrazione video della funzione NMJ (giorno 24+)

1. Per l'imaging, utilizzare un microscopio fluorescente invertito con una fotocamera scientifica complementare metallo-ossido-semiconduttore (sCMOS).
2. Impostare il binning del software della fotocamera su 2x2, esposizione a 20 ms, rolling shutter ON, velocità di lettura a 540 MHz, gamma dinamica: 12 bit e guadagno 1 e modalità sensore: sovrapposizione.
3. Usa l'obiettivo 2x sul microscopio per visualizzare i microtissu.
4. Collegare una camera a cellule vive (37 °C, 5% CO₂) allo stadio del microscopio.
5. Selezionare la regione di interesse (ROI) che contiene il tessuto dei tessuti scheletrici innervati per ridurre al minimo le dimensioni del file e il tempo di elaborazione.
6. Posizionare un filtro di emissione passa-lungo da 594 nm tra il campione e l'obiettivo di imaging per filtrare gli impulsi di luce blu dalla fotocamera.
7. Posizionare una piastra rettangolare a 4 pozzetti contenente 4 bioreattori (24 tessuti) nella camera delle cellule vive.
8. Fare clic su Live View. Centra e focalizza l'immagine con il ROI desiderato.
9. Carica il codice macro personalizzato dalla cartella GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) per controllare la posizione dello stage, la scheda Arduino e l'acquisizione video.
10. Impostare il filmato di output come segue: day_tissue group_tissue name_experiment.nd2.
11. Esegui il codice macro con le coordinate X,Y desiderate impostate sullo stage e acquisisci un time lapse veloce con 1700 fotogrammi a 50 fotogrammi/s.
12. Sostituire il supporto dopo l'imaging e restituire i campioni all'incubatore. Consentire almeno 24 ore tra le sessioni di acquisizione delle immagini per evitare l'affaticamento dei tessuti.

9. Elaborazione e analisi dei lotti (giorno 24+)

1. Elaborazione filmati
   1. Utilizza il codice MATLAB personalizzato per elaborare i video in analisi batch. I file possono essere scaricati dalla cartella GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis). Le funzioni sono elencate e spiegate nella Tabella 2.
      NOTA: il codice è compatibile con i formati .nd2 e .czi. Richiede l'elaborazione parallela per essere attivato in MATLAB e ha bisogno del pacchetto bioformati.
   2. Eseguire lo script recursiveOSAnalysis per analizzare i filmati tramite elaborazione parallela. Avere tutti i video acquisiti nella stessa cartella e selezionare quella cartella durante l'esecuzione del codice.
   3. Regolate i parametri post-analisi in base alle esigenze.
      1. Modificare baselineTime (opzione 1) se la contrazione spontanea viene rilevata all'inizio della registrazione. Questo mostrerà una lettura iniziale superiore a 0 e avrà bisogno che il fotogramma venga spostato per compensare.
      2. Modificare peakThreshold (opzione 2) se le contrazioni non vengono registrate. Il codice rileverà le contrazioni superiori al 25% del picco più alto per impostazione predefinita in modo che questo valore possa essere modificato.
      3. Modificare minMinProminence e minMinWidth per regolare la sensibilità quando si rileva l'inizio di ogni picco.
   4. Genera output video e grafico.
      1. Eseguire recursiveOSMovie per generare un file video per ogni tessuto con la rispettiva traccia di contrattilità.

10. Perturbazione della funzione NMJ (giorno 24+)

1. Preparare i mezzi di trattamento aggiungendo un effettore esterno al mezzo basale NbActiv4 integrato con 20 ng/mL BDNF e 10 ng/mL GDNF.
   1. Per l'esperimento MG sera, utilizzare il 20% di sieri del paziente MG in NbActiv4 + BDNF + GDNF.
   2. Per l'esperimento BTX, utilizzare 5 μg/mL BTX in NbActiv4 + BDNF + GDNF.
2. Stimolare/visualizzare utilizzando il passaggio 3.2. per registrare la linea di base.
3. Sostituire il mezzo nei tessuti con mezzi di trattamento (450 μL/tessuto).
4. Incubare per il tempo desiderato (48 ore per i sieri del paziente, 20 minuti per BTX).
5. Stimolare/visualizzare di nuovo utilizzando il passaggio 3.2. per registrare la funzione dopo il trattamento.
6. Rimuovere il mezzo di trattamento e lasciare riposare i tessuti per il tempo desiderato (48 ore dopo la rimozione dei sieri)
   NOTA: consentire almeno 24 ore tra la stimolazione e l'imaging per evitare l'affaticamento dei tessuti

Risultati

Le giunzioni neuromuscolari sono state generate dalla co-coltura di motoneuroni optogenetici derivati da hiPSC con tessuto muscolare scheletrico non optogenetico. I mioblasti scheletrici primari umani (SkM) sono stati seminati nelle piattaforme e differenziati in miotubi multinucleati utilizzando il protocollo di 2 settimane. I motoneuroni optogenetici sono stati differenziati separatamente, ma in parallelo con la differenziazione del miotubo, e quindi seminati nella piattaforma (Figura 1). ...

Discussione

Questo sistema è un modello di tessuto umano 3D ingegnerizzato che combina optogenetica ed elaborazione video per consentire una valutazione automatizzata e imparziale della funzione NMJ. Utilizzando un protocollo standardizzato, abbiamo dimostrato la capacità di misurare i cambiamenti nella funzione NMJ durante lo sviluppo fisiologico e caratterizzare gli effetti dannosi di patologie come l'esposizione alle neurotossine e la miastenia gravis dei sieri dei pazienti.

Studi precedenti hanno ri...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells
SkMDC	Cook Myosite	P01059-14M
Media and Supplements
Advanced DMEM/F12	ThermoFisher Scientific	12634-020
Bovine Serum Albumin solution	Millipore Sigma	A9576-50ML
G-5 Supplement (100X)	ThermoFisher Scientific	17503-012
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	10131-035
Insulin, Recombinant Human	Millipore Sigma	91077C-100MG
Matrigel	Corning	354277
mTeSR Plus	Stem Cell Technologies	100-0276
MyoTonic Growth Media Kit	Cook Myosite	MK-4444
N-2 Supplement	ThermoFisher Scientific	17502-048
NbActiv4 500 mL	BrainBits LLC	Nb4-500
Neurobasal Medium	ThermoFisher Scientific	21103-049
Neurobasal-A Medium	ThermoFisher Scientific	A13710-01
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	P2443
ReLeSR	Stem Cell Technologies	5872
Plasticware
30 mm cage cube system	ThorLabs	CM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4
37 µm Reversible Strainer, large	Stem Cell Technologies	27250
546 nm short-pass excitation filter	Semrock	FF01-546/SP-25
573 nm dichroic mirror	Semrock	FF573-Di01–25x36
594 nm long- pass emission filter	Semrock	BLP01-594R-25
594 nm long-pass excitation filter	Semrock	BLP01-594R-25
Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA	LuxeonStarLEDs	SP-05-B4
Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic - Integrated Legs	LuxeonStarLEDs	10413
Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture Dish	Corning	3261
Heat sink	LuxeonStarLEDs	LPD-19-10B
Optics
pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterile	PluriSelect	43-50400-03
pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterile	PluriSelect	43-50500-03
Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA	LuxeonStarLEDs	SP-05-R5
ring-actuated iris diaphragm	ThorLabs	SM1D12D
T-Cube LED drivers	ThorLabs	LEDD1B, KPS101
Molds
Female Threaded Hex Standoffs,  3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2"	McMaster	91920A046
Low-Profile C-Clamp	McMaster	1705A12
Growth Factors
Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate	Millipore Sigma	A9501-1G
CHIR 99021, 10 mg	Tocris	4423/10
DAPT 10 mg	R&D Systems	2634/10
Human CNTF, research grade, 5 µg	Miltenyl Biotec	130-096-336
Human Vitronectin Protein, CF	R&D Systems	2349-VN-100
Human Vitronectin Protein, CF	R&D Systems	2349-VN-100
IGF1 Recombinant Human Protein	ThermoFisher Scientific	PHG0078
Laminin mouse protein, natural	ThermoFisher Scientific	23017015
Recombinant Human Agrin Protein	R&D Systems	6624-AG-050
Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ug	R&D Systems	212-GD-050/CF
Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ug	Cell Sciences	CRN500D
Recombinant Human Neurotrophin-4	Cell Sciences	CRN501B
Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus	R&D Systems	1845-SH-100
Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ug	Peprotech	450-02
Retinoic Acid, 50 mg	Millipore Sigma	R2625-50
SAG Smoothened Agonist	Millipore Sigma	566660
SB431542 10 mg	Stem Cell Technologies	72234
StemMACS LDN-193189	Miltenyl Biotec	130-103-925
Vitronectin from human plasma	Millipore Sigma	V8379-50UG
Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254
Antibodies
α-actinin mAb (Mouse IgG1)	Abcam	ab9465
Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat)	Millipore	AB144P
Desmin mAb (Mouse IgG1)	Dako	M076029-2
Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b)	DSHB	MF20
Equipment
Arduino Uno R3	Arduino	A000066
Automated stage	Applied scientific instrumentation	MS- 2000 XYZ
Expanded plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-001 (115V)
Invitrogen Countess Automated Cell Counter	Marshal Scientific	I-CACC
IX-81 Inverted fluorescence microscope	Olympus	IX-ILL100LH
Series Stage Top Incubator System	Tokai Hit STX	TOKAI-HIT-STXG
Zyla 4.2 sCOMS Camera	Andor Technology	ZYLA-4.2P-CL10
Software
Arduino Software (IDE)	Arduino	IDE 1.8.19
Mastercam	Mastercam	Mastercam for Solidworks
Matlab	Matlab	R2021b
NIS elements	Nikon	Basic Research
Solidworks 3D CAD	Solidworks	Solidworks Standard