JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы описываем воспроизводимую, автоматизированную и непредвзятую систему визуализации для характеристики функции нервно-мышечного соединения с использованием искусственной скелетной мышечной ткани человека и оптогенетических мотонейронов. Эта система позволяет проводить функциональную количественную оценку нервно-мышечной связности с течением времени и обнаруживает снижение нервно-мышечной функции, вызванное нейротоксинами и миастенией в сыворотке крови пациента.

Аннотация

Многие нервно-мышечные заболевания, такие как миастения (МГ), связаны с дисфункцией нервно-мышечного соединения (NMJ), которую трудно охарактеризовать на животных моделях из-за физиологических различий между животными и людьми. Тканевая инженерия предлагает возможности для предоставления in vitro моделей функциональных NMJ человека, которые могут быть использованы для диагностики и исследования патологий NMJ и тестирования потенциальных терапевтических средств. Включив оптогенетические белки в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs), мы создали нейроны, которые можно стимулировать с помощью определенных длин волн света. Если NMJ здоров и функционален, нейрохимический сигнал от мотонейрона приводит к сокращению мышц. Благодаря интеграции оптогенетики и микрофабрикации с тканевой инженерией мы создали объективную и автоматизированную методологию характеристики функции NMJ с использованием видеоанализа. Разработан стандартизированный протокол формирования NMJ, оптической стимуляции с одновременной видеозаписью и видеоанализа сократимости тканей. Стимуляция оптогенетических мотонейронов светом для индуцирования сокращений скелетных мышц повторяет физиологию NMJ человека и позволяет проводить повторные функциональные измерения NMJ с течением времени и в ответ на различные входы. Мы демонстрируем способность этой платформы демонстрировать функциональные улучшения в нервно-мышечной связности с течением времени и характеризовать повреждающее воздействие антител или нейротоксинов пациента на функцию NMJ.

Введение

Нервно-мышечное соединение (NMJ) представляет собой химический синапс между мотонейронами (MNs) и клетками скелетных мышц (SkM), который позволяет сокращать мышцы. Токсины, такие как нейротоксин α-бунгаротоксин (BTX), или нервно-мышечные заболевания (NMD), такие как миастения (MG), могут привести к дегенерации NMJ и снижению мышечного контроля1. Биоинженерные модели тканей человека лучше отражают функциональные и физиологические механизмы НМЖ человека и предлагают больший трансляционный потенциал, чем животные модели.

В то время как животные модели продвинули понимание формирования и функции NMJ, существуют значительные различия между синапсами человека и животных, которые ограничивают трансляцию результатов людям и делают характеристику NMJ in vivo сложной 2,3,4. Исследования показали отчетливые физиологические различия между NMJ мышей и людей. Мыши имеют большие NMJ и меньшую плотность активных зон по сравнению с NMJ человека4. Кроме того, исследования лекарств, проведенные на животных моделях, не всегда отражают эффекты, обнаруженные в клинических испытаниях на людях. Инженерные модели тканей человека дают возможность изучать здоровое развитие NMJ и патологию нервно-мышечных заболеваний и позволяют проводить скрининг лекарств. Индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (hiPSCs)5 могут быть дифференцированы на различные типы клеток, включая клетки скелетных мышц 6,7 и мотонейроны 8,9. hiPSCs могут быть легко получены из клеток пациента, что позволяет лучше моделировать заболевание10 и скрининг лекарств11,12 с помощью моделей тканей, специфичных для пациента.

Двумерным (2D) монослойным кокультурам SkMs и MNs не хватает морфологии, фенотипа, организации и функционального поведения физиологических NMJ. NMJ случайным образом формируются в 2D-культуре, что ингибирует выделение двигательных единиц для анализа, ограничивает точные функциональные измерения и препятствует их использованию для повторных, систематических экспериментов13 . Трехмерные (3D) тканевые модели NMJ преодолевают многие из этих ограничений, повторяя морфологические и функциональные характеристики физиологических NMJ 7,14,15,16,17. Используя эту модель, два типа тканей разрабатываются отдельно, а затем интегрируются путем направления роста аксонов, что позволяет развиваться более организованным NMJ по сравнению с системами 2D-культур.

Наше предыдущее исследование показало, что сочетание оптогенетики с тканевой инженерией может обеспечить точную неинвазивную стимуляцию и оценку функции NMJ18,19. С помощью генной инженерии светочувствительные белки могут быть интегрированы в геном hiPSCs. Интеграция канала родопсина-2 (ChR2), ионного канала, который открывается в ответ на синий свет, в мембрану возбудимых клеток, таких как нейроны, позволяет осуществлять бесконтактный пространственно-временный контроль над активацией клеток 20,21,22. hiPSCs, несущие ChR2, могут быть дифференцированы в оптогенетические мотонейроны, чувствительные к синему свету, устраняя необходимость в типичных инвазивных электродах, которые стимулируют нейроны, и избегая нежелательной стимуляции мышечных клеток электродами23. Эта система использует оптогенетические мотонейроны для стимуляции сокращений в неоптогенетических клетках скелетных мышц. Сочетание сбора видео и контролируемого освещения синим светом позволяет одновременно стимулировать и записывать совместно культивируемые ткани для функции NMJ.

MG вызывается аутоантителами, нацеленными на никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (AChR), что приводит к снижению функции NMJ и мышечной слабости24. Он диагностируется на основе представленных симптомов, электродиагностики и обнаружения аутоантител с помощью серологических анализов крови. Тем не менее, не все аутоантитела, участвующие в МГ, были идентифицированы, и у некоторых серонегативных пациентов диагностируется МГ, но без признанных антител25,26. Наша система позволяет проводить повторную функциональную оценку NMJ до и после добавления сыворотки от пациентов с МГ, обеспечивая бесценную информацию о функциональных и биохимических изменениях, вызванных антителами MG18. Наш протокол иллюстрирует, как создавать 3D-модели in vitro функционального NMJ человека, которые могут быть использованы для диагностики и исследования патологий NMJ и тестирования потенциальных терапевтических средств. Мы демонстрируем универсальность системы на двух платформах: микрофлюидном устройстве и более крупной платформе биореактора с открытой скважиной.

протокол

Все клеточные линии для этой работы были созданы и использованы в соответствии с институциональными руководящими принципами Колумбийского университета, Нью-Йорк, США.

1. Подготовка биореактора

  1. Изготовление форм для биореакторов
    1. Загрузите файл САПР биореактора из дополнительного файла САПР или создайте собственный дизайн.
    2. Сгенерируйте траекторию инструмента с ЧПУ из 3D-модели с помощью программного обеспечения CAM.
    3. Станок ацетальных форм с использованием фрезерного станка с ЧПУ.
  2. Изготовление биореакторов
    1. Смешайте основание 10:1 со смесью отверждающего агента полидиметилсилоксана (PDMS, 77 г смеси на 4 платформы/формы).
    2. Поместите смесь в вакуумную камеру, закройте все клапаны, включите вакуум и дегазируйте смесь не менее чем на 30 минут, пока не останутся пузырьки воздуха. Вылейте смесь в формы и дегазируйте формы в вакуумной камере в течение 1 ч.
    3. Закройте формы верхней половиной формы в правильной ориентации. Поместите стальной шестиугольный стержень по центру и зажмите с обеих сторон.
    4. Наполните верхнюю часть PDMS.
    5. Отверждайте формы в духовке с температурой 65 °C в течение не менее 4 ч.
    6. Снимите платформы с форм после охлаждения до комнатной температуры.
    7. Очистите устройства в ультразвуковой ванне, используя 1-часовой цикл мыла для посуды, 400 мл 100% изопропанола и дистиллированной воды.
    8. Сушить ночью при 65 °C.
    9. Замачивайте стеклянные крышки в 1% неионного поверхностно-активного полиола в течение 30 минут и убедитесь, что крышки не укладываются так, чтобы все они были должным образом покрыты.
    10. Хорошо промыть дистиллированной водой и высушить на ночь при температуре 65 °C.
    11. Используйте плазменный очиститель на высоком уровне с 6 л/мин кислорода в течение 1-2 мин для обработки стеклянных крышек и платформы PDMS. После обработки свяжите их вместе, прижав PDMS к крышке в течение не менее 30 с.
    12. Автоклавируйте связанные устройства перед добавлением ячеек.

2. Построение установки оптической стимуляции

  1. Используя 30-миллиметровую систему кубического сепаратора, прикрепите 573-нм дихроичное зеркало в центре. Соедините красный светодиод 627 нм с 594-нм фильтром возбуждения с длинными проходами и прикрепите его к верхней стороне куба, причем светодиод будет обращен к зеркалу. Затем прикрепите синий светодиод 488 нм с фильтром возбуждения коротких частот 546 нм к соседней стороне куба, причем светодиод будет обращен к зеркалу, как показано на схеме на рисунке 3A.
  2. Прикрепите диафрагму радужной оболочки с кольцевым приводом к нижней части куба клетки, чтобы контролировать размер освещенной области.
  3. Питание каждого светодиода с помощью светодиодного драйвера T-Cube и управление с помощью платы Arduino Uno Rev3. Подключите боковой вход светодиодного драйвера к разъему источника питания, подключите средний выход к Arduino и подключите боковой выход непосредственно к светодиодам.
  4. Подключите Arduino Uno к ПК с помощью USB-кабеля.
  5. Загрузка файлов по ссылке GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis).
  6. Откройте файл "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" из папки GitHub.
  7. Установка начальных параметров: Шагов = 30; startFrequency = 0,5; endFrequency = 3; pulseДлинь = 100.
  8. Убедитесь, что контактный выход 4 назначен драйверу синего светодиода, а контактный выход 2 назначен драйверу красного светодиода. Убедитесь, что средние провода светодиодного драйвера подключены к земле и к соответствующему выводу.
  9. Скомпилируйте и загрузите программу "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" в Arduino.
  10. Подключите каждый светодиодный драйвер к соответствующему каналу.

3. Настройка клеточной культуры (день -21-0)

  1. Первичные клетки скелетных мышц
    1. Разморозить и расширить первичные скелетные миобласты (полученные из миозита Кука) максимум на шесть проходов с использованием миотонической питательной среды (+ добавка). Поддерживайте ячейки в инкубаторе, установленные на 37 °C и 5% CO2.
    2. Меняйте носитель каждые 2 дня.
    3. Как только клетки станут около 60% сливающимися, пройдите их с использованием 0,05% трипсина-ЭДТА (1x, в течение 5 мин при 37 °C). Соберите диссоциированные клетки и добавьте свежие среды, чтобы нейтрализовать трипсин.
    4. Раскрутите клетки при 300 x g и аспирируйте супернатант над клеточной гранулой.
    5. Повторно суспендировать клетки с MGM и семенами 1:3 с 60 мл на трехслойную колбу.
  2. ChR2-hiPSC
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все клеточные линии для этой работы были созданы и использованы в соответствии с институциональными руководящими принципами Колумбийского университета, Нью-Йорк, США. В этом протоколе ChR2-экспрессирующие hiPSCs генерировались с помощью редактирования генома CRISPR-Cas9 с использованием ранее описанных методов18, но любые стабильные оптогенетические клеточные линии (лентивирусные, piggyBac и т. д.) могут быть использованы таким же образом. Были выбраны конститутивные промоторы, выраженные как в иПСК, так и в мотонейронах (CAG). Было обнаружено, что клетки имеют здоровый кариотип, как отмечалось в предыдущих публикациях18,19.
    1. Покрыть 6-луночные пластины 1 мл/лунку солюбилизированной базальной мембранной матрицей, разведенной в DMEM/F12 (1:80), и инкубировать пластины при комнатной температуре в течение 1 ч.
    2. Посевные иПСК на покрытых 6-луночными пластинами с 2 мл питательной клеточной культуральной среды (iPSC среды), обменивая 2 мл среды через день и проходя каждые 5-7 дней. Поддерживайте клетки в инкубаторе при температуре 37°C и 5% CO2.
    3. Пассаж
      1. Диссоциируют стволовые клетки путем инкубации с 1 мл безферментного реагента, высвобождающего реагент в течение 4 мин и механической резки с широким наконечником пипетки P1000.
      2. Семенные клетки в соотношении 1:24 или 1:48 в среде iPSC с 2 мкМ дигидрохлорида Y-27632 в 2 мл/лунку на покрытых 6-луночными пластинами.

4. Посев скелетно-мышечной ткани (день -3)

  1. Изолируйте и подсчитайте 30 х 106 миобластов с помощью автоматизированного счетчика клеток.
  2. Повторно суспендировать миобласты в смеси 4:1 3 мг/мл коллагена I и солюбилизированной базальной мембранной матрицы (800 мкл коллагеновой смеси + 200 мкл матрицы базальной мембраны для достижения конечного объема 1 мл). Для коллагенового компонента добавляют сопутствующий нейтрализующий агент (смесь коллагена 9:1 с нейтрализующим агентом) и разбавляют смесь 1x PBS для достижения объема 800 мкл.
  3. Добавьте 15 мкл клеточно-коллагеновой суспензии в каждую мышечную камеру биореактора, обязательно распределив суспензию по обеим стойкам с помощью кончика пипетки (рисунок 2).
  4. Дайте клеточно-гелевой смеси полимеризоваться при 37 °C в течение 30 мин, а затем наполните каждый биореактор 450 мкл миотонической питательной среды.
  5. Через 3 дня (как только гель уплотнится) начинают дифференцировку миотубей.

5. Дифференциация миотубей (дни 0-14)

  1. Начинают инфузию миотубов с переключения тканей на 450 мкл индуцирующих слияние сред (ФС, табл. 1) в течение 7 дней, меняя носители через день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Попробуйте начать дифференцировку миотубов в тот же день, что и дифференцировку мотонейрона от hiPSCs, чтобы посеять мотонейроны в конце графиков дифференцировки обоих типов клеток.
  2. На 7 день изменяют носитель до 450 мкл среды созревания Ia (MMIa, табл. 1).
  3. На 9 день изменяют на 450 мкл среды созревания Ib (MMIb, табл. 1).
  4. На 11 день измените носитель на 450 мкл NbActiv4. Продолжайте менять носитель каждые 2 дня, пока мотонейроны не будут посеяны (шаг 7).

6. Дифференциация мотонейрона (дни 0-14)

ПРИМЕЧАНИЕ: Наш протокол дифференциации мотонейронов был адаптирован из Maury et al8.

  1. На 0 день перенесите 4 x 106 ChR2-hiPSCs в чашку Петри со сверхнизким насадкой с 15 мл питательной среды суспензии мотонейрона (MSCM, таблица 1). Добавка MSCM содержит 3 мкМ ГИДРАТА CHIR99021, 0,2 мкМ LDN193189, 40 мкМ SB431542 гидрата и 5 мкМ Y-27632 дигидрохлорида.
  2. На 2-й день выделяют невросферы (НС) с помощью обратимого сетчатого фильтра 37 мкМ и перекладывают в 15 мл MSCM с 3 мкМ CHIR99021, 0,2 мкМ LDN193189, 40 мкМ SB431542 гидрата и 0,1 мкМ ретиноевой кислоты. NS должен быть виден в чашке Петри без использования микроскопа после 2-го дня.
  3. На 4 день перенесите клетки и среды в трубку объемом 50 мл и дайте невросферам осесть на дно (5 мин). Аспирировать супернатант и повторно суспендировать клетки в 15 мл MSCM, дополненных 0,5 мкМ SAG, 0,2 мкМ LDN193189, 40 мкМ SB431541 и 0,1 мкМ ретиноевой кислоты.
  4. На 7-й день повторите Шаг 6.3. но повторно суспендируют клетки в 15 мл MSCM, дополненных 0,5 мкМ SAG и 0,1 мкМ ретиноевой кислоты.
  5. На 9-й день повторите Шаг 6.3. но повторное суспендирование клеток в 15 мл MSCM, дополненных 10 мкМ DAPT.
  6. На 11-й день повторите Шаг 6.3. но повторно суспендировать клетки в 15 мл MSCM, дополненных 20 нг/мл BDNF и 10 нг/мл GDNF.
  7. На 14-й день посейте мотонейроны в платформу.

7. Посев агрегатов мотонейронов в биореакторе (день 14)

  1. Приготовьте гелевую смесь 4:1 из 2 мг/мл коллагена I и матригеля (800 мкл коллагеновой смеси + 200 мкл матригеля для достижения конечного объема 1 мл). Для коллагенового компонента добавьте сопутствующий нейтрализующий агент (смесь коллагена 9:1 с нейтрализующим агентом) и разбавьте смесь 1x PBS для достижения конечного объема 800 мкл.
  2. Используйте клеточный ситечко 400 нм для выбора больших невросфер и повторного суспендирования их в гелевой смеси.
  3. Аспирировать среды из резервуара и осторожно из невросферного колодца (рисунок 2).
  4. Добавьте 15 мкл гелевой смеси в канал невросферы.
  5. Загрузите пипетку объемом 10 мкл с 10 мкл геля, а затем выберите одну невросферу.
  6. Поместите NS в канал нейросферы и убедитесь, что NS находится в камере. Медленно поднимите пипетку, высвобождая оставшийся гель после осаждения NS. Если вы не уверены, что НС был правильно депонирован, проверьте его местоположение с помощью микроскопа.
  7. Дайте гелю полимеризоваться в течение 30 мин при 37 °C.
  8. Добавьте в резервуары 450 мкл NbActiv4 с добавлением 20 нг/мл BDNF и 10 нг/мл GDNF.
  9. Меняйте среду через день, чтобы обеспечить рост аксонов от NS до мышечной ткани.

8. Одновременная оптическая стимуляция и видеозапись функции NMJ (день 24+)

  1. Для визуализации используйте перевернутый флуоресцентный микроскоп с научной комплементарной камерой металл-оксид-полупроводник (sCMOS).
  2. Установите программное обеспечение камеры на 2x2, экспозицию до 20 мс, скользящий затвор вкл., частоту считывания до 540 МГц, динамический диапазон: 12-битный и коэффициент усиления 1 и режим датчика: перекрытие.
  3. Используйте 2x объектив на микроскопе, чтобы получить изображение микроткани.
  4. Прикрепите камеру живых клеток (37 °C, 5% CO2) к ступени микроскопа.
  5. Выберите интересующую область (ROI), содержащую иннервированную ткань скелетных тканей, чтобы свести к минимуму размер файла и время обработки.
  6. Поместите длинночастотный эмиссионный фильтр 594 нм между образцом и объективом изображения, чтобы отфильтровать импульсы синего света от камеры.
  7. Поместите прямоугольную 4-луночную пластину, содержащую 4 биореактора (24 ткани), в камеру живых клеток.
  8. Щелкните Интерактивный просмотр. Центрируйте и фокусируйте изображение с желаемой рентабельностью инвестиций.
  9. Загрузите пользовательский код макроса из папки GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis), чтобы управлять положением сцены, платой Arduino и сбором видео.
  10. Установите выходной фильм как: day_tissue group_tissue name_experiment.nd2.
  11. Запустите макрокод с заданными на сцене координатами X,Y и получите быстрый таймлапс с 1700 кадрами со скоростью 50 кадров/с.
  12. Замените носитель после визуализации и верните образцы в инкубатор. Подождите не менее 24 часов между сеансами получения изображения, чтобы избежать усталости тканей.

9. Пакетная обработка и анализ (день 24+)

  1. Обработка фильмов
    1. Используйте пользовательский код MATLAB для обработки видео в пакетном анализе. Файлы можно загрузить из папки GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis). Функции перечислены и объяснены в таблице 2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Код совместим с форматами .nd2 и .czi. Он требует параллельной обработки для активации в MATLAB и нуждается в пакете биоформатов.
    2. Запустите скрипт рекурсивного анализаOSAnalysis для анализа фильмов с помощью параллельной обработки. Поместите все полученные видео в одну папку и выберите эту папку при выполнении кода.
    3. При необходимости настройте параметры постанализа.
      1. Изменить baselineTime (вариант 1), если спонтанное сокращение улавливается в начале записи. Это покажет начальное считывание выше 0 и потребует смещения кадра для компенсации.
      2. Измените peakThreshold (вариант 2), если сокращения не регистрируются. Код обнаружит сокращения, которые по умолчанию превышают 25% от самого высокого пика, так что это значение можно изменить.
      3. Измените minMinProminence и minMinWidth , чтобы настроить чувствительность при обнаружении начала каждого пика.
    4. Создавайте видео- и графовые выходные данные.
      1. Запустите рекурсивныйOSMovie, чтобы создать видеофайл для каждой ткани с соответствующей трассировкой сократимости.

10. Возмущение функции NMJ (день 24+)

  1. Подготовьте лечебные среды, добавив внешний эффектор к базальным средам NbActiv4, дополненным 20 нг/мл BDNF и 10 нг/мл GDNF.
    1. Для эксперимента с сыворотками МГ используйте 20% МГ сывороток пациента в NbActiv4 + BDNF + GDNF.
    2. Для эксперимента BTX используйте 5 мкг/мл BTX в NbActiv4 + BDNF + GDNF.
  2. Стимуляция/изображение с помощью Шага 3.2. , чтобы записать базовый уровень.
  3. Заменить среду в тканях лечебной средой (450 мкл/ткань).
  4. Инкубировать в течение нужного времени (48 ч для сыворотки пациента, 20 мин для BTX).
  5. Снова стимулируйте/создавайте изображение с помощью Шага 3.2. записывать функцию после лечения.
  6. Удалите лечебные среды и дайте тканям отдохнуть в течение нужного времени (48 ч после удаления сывороток)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подождите не менее 24 часов между стимуляцией и визуализацией, чтобы избежать усталости тканей

Результаты

Нервно-мышечные соединения были получены путем совместного культивирования оптогенетических мотонейронов, полученных из hiPSC, с неоптогенетической скелетной мышечной тканью. Первичные скелетные миобласты человека (SkM) были засеяны в платформы и дифференцированы в многоядерные миотру...

Обсуждение

Эта система представляет собой инженерную 3D-модель тканей человека, которая сочетает в себе оптогенетику и обработку видео, чтобы обеспечить автоматизированную и непредвзятую оценку функции NMJ. Используя стандартизированный протокол, мы продемонстрировали способность измерять изме?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Мы с благодарностью признаем финансовую поддержку со стороны NIH [номера грантов EB025765 и EB027062], DOD [номер награды W81XWH-18-1-0095] и UCSF Health Innovation via Engineering (HIVE Fellowship). Мы с благодарностью благодарим Columbia University Stem Cell Core за их помощь и руководство по перепрограммированию клеток.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Cells
SkMDCCook MyositeP01059-14M
Media and Supplements
Advanced DMEM/F12ThermoFisher Scientific12634-020
Bovine Serum Albumin solutionMillipore SigmaA9576-50ML
G-5 Supplement (100X)ThermoFisher Scientific17503-012
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)ThermoFisher Scientific10131-035
Insulin, Recombinant HumanMillipore Sigma91077C-100MG
MatrigelCorning354277
mTeSR PlusStem Cell Technologies100-0276
MyoTonic Growth Media KitCook MyositeMK-4444
N-2 SupplementThermoFisher Scientific17502-048
NbActiv4 500 mLBrainBits LLCNb4-500
Neurobasal MediumThermoFisher Scientific21103-049
Neurobasal-A MediumThermoFisher ScientificA13710-01
Pluronic F-127Sigma AldrichP2443
ReLeSRStem Cell Technologies5872
Plasticware
30 mm cage cube systemThorLabsCM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4
37 µm Reversible Strainer, largeStem Cell Technologies27250
546 nm short-pass excitation filterSemrockFF01-546/SP-25
573 nm dichroic mirrorSemrockFF573-Di01–25x36
594 nm long- pass emission filterSemrockBLP01-594R-25
594 nm long-pass excitation filterSemrockBLP01-594R-25
Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mALuxeonStarLEDsSP-05-B4
Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic - Integrated LegsLuxeonStarLEDs10413
Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture DishCorning3261
Heat sinkLuxeonStarLEDsLPD-19-10B
Optics
pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterilePluriSelect43-50400-03
pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterilePluriSelect43-50500-03
Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mALuxeonStarLEDsSP-05-R5
ring-actuated iris diaphragmThorLabsSM1D12D
T-Cube LED driversThorLabsLEDD1B, KPS101
Molds
Female Threaded Hex Standoffs,  3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2"McMaster91920A046
Low-Profile C-ClampMcMaster1705A12
Growth Factors
Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphateMillipore SigmaA9501-1G
CHIR 99021, 10 mgTocris4423/10
DAPT 10 mgR&D Systems2634/10
Human CNTF, research grade, 5 µgMiltenyl Biotec130-096-336
Human Vitronectin Protein, CFR&D Systems2349-VN-100
Human Vitronectin Protein, CFR&D Systems2349-VN-100
IGF1 Recombinant Human ProteinThermoFisher ScientificPHG0078
Laminin mouse protein, naturalThermoFisher Scientific23017015
Recombinant Human Agrin ProteinR&D Systems6624-AG-050
Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ugR&D Systems212-GD-050/CF
Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ugCell SciencesCRN500D
Recombinant Human Neurotrophin-4Cell SciencesCRN501B
Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-TerminusR&D Systems1845-SH-100
Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ugPeprotech450-02
Retinoic Acid, 50 mgMillipore SigmaR2625-50
SAG Smoothened AgonistMillipore Sigma566660
SB431542 10 mgStem Cell Technologies72234
StemMACS LDN-193189Miltenyl Biotec130-103-925
Vitronectin from human plasmaMillipore SigmaV8379-50UG
Y-27632 dihydrochlorideTocris1254
Antibodies
α-actinin mAb (Mouse IgG1)Abcamab9465
Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat)MilliporeAB144P
Desmin mAb (Mouse IgG1)DakoM076029-2
Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b)DSHBMF20
Equipment
Arduino Uno R3ArduinoA000066
Automated stageApplied scientific instrumentationMS- 2000 XYZ
Expanded plasma cleanerHarrick PlasmaPDC-001 (115V)
Invitrogen Countess Automated Cell CounterMarshal ScientificI-CACC
IX-81 Inverted fluorescence microscopeOlympusIX-ILL100LH
Series Stage Top Incubator SystemTokai Hit STXTOKAI-HIT-STXG
Zyla 4.2 sCOMS CameraAndor TechnologyZYLA-4.2P-CL10
Software
Arduino Software (IDE)ArduinoIDE 1.8.19
MastercamMastercamMastercam for Solidworks
MatlabMatlabR2021b
NIS elementsNikonBasic Research
Solidworks 3D CADSolidworksSolidworks Standard

Ссылки

  1. Al-bassam, W., et al. Characteristics, incidence, and outcome of patients admitted to the intensive care unit with myasthenia gravis. Journal of Critical Care. 45, 90-94 (2018).
  2. Vila, O. F., Qu, Y., Vunjak-Novakovic, G. In vitro models of neuromuscular junctions and their potential for novel drug discovery and development. Expert Opinion on Drug Discovery. 15 (3), 307-317 (2020).
  3. Webster, R. G. Animal models of the neuromuscular junction, vitally informative for understanding function and the molecular mechanisms of congenital myasthenic syndromes. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1326 (2018).
  4. Jones, R. A., et al. Cellular and molecular anatomy of the human neuromuscular junction. Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  6. Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), 126 (2018).
  7. Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 4, 04885 (2015).
  8. Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature Biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).
  9. Bianchi, F., et al. Rapid and efficient differentiation of functional motor neurons from human iPSC for neural injury modelling. Stem Cell Research. 32, 126-134 (2018).
  10. Turan, S., Farruggio, A. P., Srifa, W., Day, J. W., Calos, M. P. Precise correction of disease mutations in induced pluripotent stem cells derived from patients with limb girdle muscular dystrophy. Molecular Therapy. 24 (4), 685-696 (2016).
  11. Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  12. Lin, C. -. Y., et al. iPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases. JCI Insight. 4 (18), (2021).
  13. Centeno, E. G. Z., Cimarosti, H., Bithell, A. 2D versus 3D human induced pluripotent stem cell-derived cultures for neurodegenerative disease modelling. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 27 (2018).
  14. Okano, T., Matsuda, T. Tissue engineered skeletal muscle: preparation of highly dense, highly oriented hybrid muscular tissues. Cell Transplantation. 7 (1), 71-82 (1998).
  15. Powell, C. A., Smiley, B. L., Mills, J., Vandenburgh, H. H. Mechanical stimulation improves tissue-engineered human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (5), 1557-1565 (2002).
  16. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  17. Guo, X., et al. A human-based functional NMJ system for personalized ALS modeling and drug testing. Advanced Therapeutics. 3 (11), 2000133 (2020).
  18. Vila, O. F., et al. Bioengineered optogenetic model of human neuromuscular junction. Biomaterials. 276, 121033 (2021).
  19. Vila, O. F., et al. Quantification of human neuromuscular function through optogenetics. Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).
  20. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  21. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  22. Steinbeck, J. A., et al. Functional connectivity under optogenetic control allows modeling of human neuromuscular disease. Cell Stem Cell. 18 (1), 134-143 (2016).
  23. Santhanam, N., et al. Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose response evaluation of therapeutics. Biomaterials. 166, 64-78 (2018).
  24. Phillips Ii, L. H. The epidemiology of myasthenia gravis. Annals of the New York Academy of Sciences. 998 (1), 407-412 (2003).
  25. Sanders, D. B., et al. Does change in acetylcholine receptor antibody level correlate with clinical change in myasthenia gravis. Muscle & Nerve. 49 (4), 483-486 (2014).
  26. Vernino, S. Unraveling the enigma of seronegative myasthenia gravis. JAMA Neurology. 72 (6), 630-631 (2015).
  27. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. , (2018).
  28. Paredes-Redondo, A., et al. Optogenetic modeling of human neuromuscular circuits in Duchenne muscular dystrophy with CRISPR and pharmacological corrections. Science Advances. 7 (37), (2021).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

182

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены