Разработка и характеристика оптогенетической модели нервно-мышечного соединения человека

Резюме

Мы описываем воспроизводимую, автоматизированную и непредвзятую систему визуализации для характеристики функции нервно-мышечного соединения с использованием искусственной скелетной мышечной ткани человека и оптогенетических мотонейронов. Эта система позволяет проводить функциональную количественную оценку нервно-мышечной связности с течением времени и обнаруживает снижение нервно-мышечной функции, вызванное нейротоксинами и миастенией в сыворотке крови пациента.

Аннотация

Многие нервно-мышечные заболевания, такие как миастения (МГ), связаны с дисфункцией нервно-мышечного соединения (NMJ), которую трудно охарактеризовать на животных моделях из-за физиологических различий между животными и людьми. Тканевая инженерия предлагает возможности для предоставления in vitro моделей функциональных NMJ человека, которые могут быть использованы для диагностики и исследования патологий NMJ и тестирования потенциальных терапевтических средств. Включив оптогенетические белки в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs), мы создали нейроны, которые можно стимулировать с помощью определенных длин волн света. Если NMJ здоров и функционален, нейрохимический сигнал от мотонейрона приводит к сокращению мышц. Благодаря интеграции оптогенетики и микрофабрикации с тканевой инженерией мы создали объективную и автоматизированную методологию характеристики функции NMJ с использованием видеоанализа. Разработан стандартизированный протокол формирования NMJ, оптической стимуляции с одновременной видеозаписью и видеоанализа сократимости тканей. Стимуляция оптогенетических мотонейронов светом для индуцирования сокращений скелетных мышц повторяет физиологию NMJ человека и позволяет проводить повторные функциональные измерения NMJ с течением времени и в ответ на различные входы. Мы демонстрируем способность этой платформы демонстрировать функциональные улучшения в нервно-мышечной связности с течением времени и характеризовать повреждающее воздействие антител или нейротоксинов пациента на функцию NMJ.

Введение

Нервно-мышечное соединение (NMJ) представляет собой химический синапс между мотонейронами (MNs) и клетками скелетных мышц (SkM), который позволяет сокращать мышцы. Токсины, такие как нейротоксин α-бунгаротоксин (BTX), или нервно-мышечные заболевания (NMD), такие как миастения (MG), могут привести к дегенерации NMJ и снижению мышечного контроля¹. Биоинженерные модели тканей человека лучше отражают функциональные и физиологические механизмы НМЖ человека и предлагают больший трансляционный потенциал, чем животные модели.

В то время как животные модели продвинули понимание формирования и функции NMJ....

протокол

Все клеточные линии для этой работы были созданы и использованы в соответствии с институциональными руководящими принципами Колумбийского университета, Нью-Йорк, США.

1. Подготовка биореактора

1. Изготовление форм для биореакторов
   1. Загрузите файл САПР биореактора из дополнительного файла САПР или создайте собственный дизайн.
   2. Сгенерируйте траекторию инструмента с ЧПУ из 3D-модели с помощью программного обеспечения CAM.
   3. Станок ацетальных форм с использованием фрезерного станка с ЧПУ.
2. Изготовление биореакторов
   1. Смешайте основание 10:1 со смесью ....

Результаты

Нервно-мышечные соединения были получены путем совместного культивирования оптогенетических мотонейронов, полученных из hiPSC, с неоптогенетической скелетной мышечной тканью. Первичные скелетные миобласты человека (SkM) были засеяны в платформы и дифференцированы в многоядерные миотру.......

Обсуждение

Эта система представляет собой инженерную 3D-модель тканей человека, которая сочетает в себе оптогенетику и обработку видео, чтобы обеспечить автоматизированную и непредвзятую оценку функции NMJ. Используя стандартизированный протокол, мы продемонстрировали способность измерять изме?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells
SkMDC	Cook Myosite	P01059-14M
Media and Supplements
Advanced DMEM/F12	ThermoFisher Scientific	12634-020
Bovine Serum Albumin solution	Millipore Sigma	A9576-50ML
G-5 Supplement (100X)	ThermoFisher Scientific	17503-012
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	10131-035
Insulin, Recombinant Human	Millipore Sigma	91077C-100MG
Matrigel	Corning	354277
mTeSR Plus	Stem Cell Technologies	100-0276
MyoTonic Growth Media Kit	Cook Myosite	MK-4444
N-2 Supplement	ThermoFisher Scientific	17502-048
NBactiv4 500 mL	BrainBits LLC	Nb4-500
Neurobasal Medium	ThermoFisher Scientific	21103-049
Neurobasal-A Medium	ThermoFisher Scientific	A13710-01
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	P2443
ReLeSR	Stem Cell Technologies	5872
Plasticware
30 mm cage cube system	ThorLabs	CM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4
37 µm Reversible Strainer, large	Stem Cell Technologies	27250
546 nm short-pass excitation filter	Semrock	FF01-546/SP-25
573 nm dichroic mirror	Semrock	FF573-Di01–25x36
594 nm long- pass emission filter	Semrock	BLP01-594R-25
594 nm long-pass excitation filter	Semrock	BLP01-594R-25
Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA	LuxeonStarLEDs	SP-05-B4
Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic - Integrated Legs	LuxeonStarLEDs	10413
Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture Dish	Corning	3261
Heat sink	LuxeonStarLEDs	LPD-19-10B
Optics
pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterile	PluriSelect	43-50400-03
pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterile	PluriSelect	43-50500-03
Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA	LuxeonStarLEDs	SP-05-R5
ring-actuated iris diaphragm	ThorLabs	SM1D12D
T-Cube LED drivers	ThorLabs	LEDD1B, KPS101
Molds
Female Threaded Hex Standoffs,  3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2"	McMaster	91920A046
Low-Profile C-Clamp	McMaster	1705A12
Growth Factors
Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate	Millipore Sigma	A9501-1G
CHIR 99021, 10 mg	Tocris	4423/10
DAPT 10 mg	R&D Systems	2634/10
Human CNTF, research grade, 5 µg	Miltenyl Biotec	130-096-336
Human Vitronectin Protein, CF	R&D Systems	2349-VN-100
Human Vitronectin Protein, CF	R&D Systems	2349-VN-100
IGF1 Recombinant Human Protein	ThermoFisher Scientific	PHG0078
Laminin mouse protein, natural	ThermoFisher Scientific	23017015
Recombinant Human Agrin Protein	R&D Systems	6624-AG-050
Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ug	R&D Systems	212-GD-050/CF
Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ug	Cell Sciences	CRN500D
Recombinant Human Neurotrophin-4	Cell Sciences	CRN501B
Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus	R&D Systems	1845-SH-100
Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ug	Peprotech	450-02
Retinoic Acid, 50 mg	Millipore Sigma	R2625-50
SAG Smoothened Agonist	Millipore Sigma	566660
SB431542 10 mg	Stem Cell Technologies	72234
StemMACS LDN-193189	Miltenyl Biotec	130-103-925
Vitronectin from human plasma	Millipore Sigma	V8379-50UG
Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254
Antibodies
α-actinin mAb (Mouse IgG1)	Abcam	ab9465
Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat)	Millipore	AB144P
Desmin mAb (Mouse IgG1)	Dako	M076029-2
Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b)	DSHB	MF20
Equipment
Arduino Uno R3	Arduino	A000066
Automated stage	Applied scientific instrumentation	MS- 2000 XYZ
Expanded plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-001 (115V)
Invitrogen Countess Automated Cell Counter	Marshal Scientific	I-CACC
IX-81 Inverted fluorescence microscope	Olympus	IX-ILL100LH
Series Stage Top Incubator System	Tokai Hit STX	TOKAI-HIT-STXG
Zyla 4.2 sCOMS Camera	Andor Technology	ZYLA-4.2P-CL10
Software
Arduino Software (IDE)	Arduino	IDE 1.8.19
Mastercam	Mastercam	Mastercam for Solidworks
Matlab	Matlab	R2021b
NIS elements	Nikon	Basic Research
Solidworks 3D CAD	Solidworks	Solidworks Standard