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  • 摘要
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  • 结果
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  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

血小板裂解物是治疗眼表疾病的新兴工具。在这里,我们提出了一种从血小板供体收集的血小板裂解物的制备,分配,储存和表征的方法。

摘要

各种眼表疾病用血液来源的眼药水治疗。它们的使用已被引入临床实践,因为它们的代谢物和生长因子含量,可促进眼表再生。血液滴眼液可以由不同的来源(即全血或血小板单采捐献)以及不同的方案(例如,不同的稀释液和冻融循环)制备。这种可变性阻碍了临床方案的标准化,从而阻碍了对其临床疗效的评估。详细说明和分享方法程序可能有助于确定共同准则。在过去的几年中,同种异体产品作为自体治疗的替代品一直在扩散,因为它们保证了更高的疗效标准;其中,富血小板血浆裂解物(PRP-L)滴眼液是通过简单的制造程序制备的。在意大利雷焦艾米利亚的AUSL-IRCCS的输血医学部门,PRP-L是通过血小板单采捐赠获得的。本品最初在0.9%NaCl中稀释至0.3 x 10 9血小板/mL(从平均浓度1 x 109血小板/mL开始)。稀释的血小板被冷冻/解冻,然后离心以消除碎片。将最终体积分成 1.45 mL 等分试样并储存在 −80 °C。 在分配给患者之前,对眼药水进行无菌测试。患者可将血小板裂解物在-15°C下储存长达1个月。生长因子组成也从随机选择的等分试样中评估,并在此处报告平均值。

引言

血液衍生产品广泛用于伤口护理1、颌面和骨科手术,以及治疗不同的眼表疾病2,如干眼病(DED)3。在DED中,泪膜稳态由于泪液产生和眼表完整性所涉及的不同因素的异常功能而受损45

DED的特征是病因和严重程度678的异质性,可能是不同因素的结果,如衰老,性别9,隐形眼镜,局部或全身药物10或干燥综合征10等预先存在的疾病。尽管症状轻微,但DED影响了全世界数百万人,影响了他们的生活质量和卫生系统6

已经报道了许多针对这种病理的治疗方法,但对于最有效的解决方案仍未达成共识12。迄今为止,人工泪液是旨在恢复泪膜水成分的第一线治疗,尽管这些替代品不含天然泪液的主要生物活性溶质611。基于血小板的产品被认为是人工泪液的有效替代品1213,尽管它们的临床疗效使用建议和制备方法仍然是一个有争议的问题3

血液产品在代谢物14、蛋白质、脂质、维生素、离子、生长因子(GFs)、抗氧化化合物11和渗透压(300 mOsm/L)11方面与泪液具有相似的成分。通过其组分的协同活性,它们促进角膜上皮的再生,抑制炎性细胞因子的释放,并增加杯状细胞的数量和结膜中粘蛋白的表达23

到目前为止,文献中已经记录了眼科血液制品的异质性;这些产品可以根据献血者的来源(即自体或同种异体)以及血液来源(即外周血、脐带血、血清或血小板)进行分类。

尽管自体产品是最普遍的3,但同种异体产品现在已成为首选,因为它们确保了更高的功效和安全性标准15,同时显着降低了成本1617。事实上,先前的研究证明,从自身免疫和/或全身性疾病患者获得的血液产品可能会显示出改变的质量和功能61617。尽管基于血清的滴眼液是最普遍的,但基于血小板的产品最近被确认为一种有效的替代品,因为它们可以很容易地制备,同时保持显着的功效水平311。目前可用的基于血小板的产品可分为富血小板血浆(PRP),富血小板血浆裂解物(PRP-L)和富含生长因子的血浆(PRGF)3

其中,PRP-L具有长寿命冷冻产品的优点。PRP-L可以由单采术,血沉棕黄层甚至过期血小板(PLT)制备1819从而大大减少其浪费。等分试样可以在-80°C的输血中心储存数月,甚至可以在-15°C的患者家中储存较短的时间。

PRP-L富含GFs,已被证明可以刺激眼表再生122021。然而,该领域只有很少的临床研究报道,并且所有研究都使用自体来源322。PRP-L在常规用于治疗眼表疾病之前仍需要进一步的验证和表征,因为没有关于其制备,分配和储存的标准化指南3

在此,分享了一个详细的方案,用于生产在意大利雷焦艾米利亚的AUSL-IRCCS输血医学部门使用的PRP-L,并向DED患者分配。我们的目标是帮助科学界开发标准的制备方法,这可能会提高全球研究和临床方法的同质性和一致性。

研究方案

用于生长因子定量评估的PRP-L是在AUSL-IRCCS di Reggio Emilia进行的关于再生目的PRP产品表征的更广泛研究中收集的,并于2019年1月10日由Vasta Emilia Nord地区伦理委员会批准(协议号2019 / 0003319)。捐助者根据《赫尔辛基宣言》表示知情同意。收集眼表疾病指数(OSDI)问卷的汇总匿名数据不需要伦理批准,临床医生常规使用该问卷来监测干眼综合征症状。图 1A 显示了所遵循的协议的轮廓,而 图1B 中的图片描述了该过程的主要步骤。

1. 富血小板血浆 (PRP) 收集

  1. PRP 单采术
    1. 对于此协议,根据意大利法律选择血小板供体:血小板供体必须为18-65岁,具有正常的压力和血细胞计数参数,血小板计数不低于180 x 109 血小板/ L23。符合条件的捐献者在捐献前 1 周内不能服用抗血小板或抗凝药物。
    2. 根据制造商的说明和国家法律23,使用自动采血系统进行血浆 - 血小板 - 血液分离术,以获得1单位的单供体富血小板血浆(PRP)。收集柠檬酸腺嘌呤葡萄糖溶液 A (acd-A) 抗凝剂溶液中的 PRP。
      注意:血小板单采术是通过连续程序进行的;收集时间在40分钟到90分钟之间。提供给供体的ACD量和手术时间取决于供体的特征,例如血细胞比容和针规。
  2. PRP单元的特点
    注意:以下步骤通常由自动采血系统在血浆-血小板-单采过程中自动执行。请查看制造商的说明手册。
    1. 将通过单采术收集的PRP单位重悬于足够量的防腐剂溶液中,并具有最少量的残留血浆,这是在整个储存时间内保持pH值>6.4所必需的,平均最终体积为抗凝剂溶液净值180 mL(约40 mL)。
      注意:根据意大利法律,质量控制必须评估血小板(PLT)计数至少为2.0 x 10 11 PLT/单位,而残留的白细胞必须小于1 x10 6 个细胞/单位。
    2. 在进一步操作之前,在血小板振荡器上将白细胞去除和照射的PRP在22°C±2°C下储存最多5天23
  3. 枸杞子稀释
    1. 在开始PRP稀释之前,使用血细胞计数器使用通过穿刺尖峰从主袋收集的样品进行PLT计数。
      注意:在II类生物危害罩下执行无菌后续步骤。在手术过程中穿戴个人防护设备(实验室外套、手套和护目镜)。
    2. 用足量的无菌 0.9% NaCl 稀释 PRP,最终浓度为 0.32 x 10 9 ± 0.03 x 109 PLT/mL,模拟外周血中的平均 PLT 浓度。
    3. 利用血袋的刺穿尖峰,将稀释的PRP分成300 mL空收集袋,以达到190 mL/袋的净体积。
    4. 使用等分试样残留稀释的PRP(通常为1 mL)进行质量控制,评估可能的微生物污染。按照制造商的说明在微生物实验室进行无菌测定(见 材料表)。
      注意:使用专门用于好氧血液培养的培养瓶,这些培养瓶能够从小体积血液标本中进行需氧微生物(主要是细菌和酵母)的定性培养和回收。
    5. 在解冻前将稀释的PRP袋在-80°C下储存最多2个月。

2. 富血小板血浆裂解物(PRP-L)制备

  1. 解冻
    1. 在开始解冻程序之前,请确保将温浴设置为37°C。 将PRP袋放入温水浴中,等待完全解冻。
  2. PRP-L 系列
    1. 在室温下以3000× g 离心PRP袋30分钟。
      注意:后续步骤应在II类生物危害罩下无菌进行。
    2. 利用转印袋的刺穿尖刺,将离心袋与空的无菌 300 mL 转印袋连接起来。小心地将PRP-L上清液转移到新袋中,同时避免碎屑。如果可能,请使用袋式压滤机。
    3. 用袋子封口机密封PRP-L装置的连接管。
  3. PRP-L等分
    注意:含有 190 mL PRP 的起始单位(参见步骤 1.3.3.)足以填充两个滴眼液套件(有关用于应用和保存血液成分滴眼液的特定医疗设备的详细信息,请参阅 材料表)。滴眼液套件应在II类罩下打开,整个小瓶位于预连接的注射器上方,旋塞阀的中心箭头指向左侧以排除抗菌过滤器。
    1. 用无菌注射器收集 30-60 mL PRP-L,并将注射器连接到灌装线上的鲁尔/锁连接。
    2. 根据制造商的说明,将旋塞阀旋转半圈,以打开含PRP-L的注射器和预连接注射器之间的线。用PRP-L填充预连接的注射器。
    3. 断开PRP-L注射器,关闭鲁尔/锁连接的管帽并将旋塞阀旋转到原始位置。使用滴眼液试剂盒注射器用PRP-L填充小瓶。
    4. 重复步骤 2.3.1.-2.3.3 中的过程。直到所有涂抹器小瓶都装满。确保每个涂抹器都已正确填充,然后用袋子封口机单独密封它们。
    5. 使用新的眼药水套件重复该过程。
    6. 使用少量残留稀释的PRP-L来评估可能的微生物污染(见步骤1.3.4)。
      注意:如果液体不小心到达绳子末端的抗菌过滤器,吸吸器可能会抵抗阻力,阻碍填充。要继续填充循环,请从字符串末端的抗菌疏水过滤器中将字符串的末端部分升高约 5/6 等分试样。在这个位置,使用已经充满空气的新无菌注射器(30 mL体积)。连接抗菌过滤器的母鲁尔/锁,用力反复按压注射器的柱塞,以去除所有血液成分残留物,并使抗菌过滤器的膜不含液体。取出注射器并填充剩余的小瓶。
  4. PRP-L 存储
    1. 正确标记每个涂抹器并将它们放入塑料袋中。也给塑料袋贴上标签,注意突出捐赠者的血型。
    2. 根据意大利法律23 和指南24,在患者分配前在-80°C下储存最多24个月。

3. PRP-L 分配

  1. 最好通过匹配PRP-L血型来分配患者。使用冷藏箱运送 PRP-L 涂抹器小瓶,并确保每个涂抹器小瓶含有 1.45 mL PRP-L,相当于大约 45 滴。指导患者,施用器小瓶可以在-15°C下在患者家中储存长达1个月。

结果

使用血清源性滴眼液(这是最常用于治疗眼表面疾病的血液产品)的基本原理在于其GF的含量,GF几乎完全来自循环血小板。与外周血血清相比,PRP 含有的血小板数量(因此也含有血小板来源的 GF),范围在 0.15 x 10 9-0.45 x 109 PLT/mL 之间。根据意大利法律,以PRP为单位的血小板计数应至少为0.9 x 10 9-1 x 109 PLT/mL。因此,为了获得模拟血清滴眼液功效的产品,应在裂解?...

讨论

近年来,基于血小板的产品用于眼表病变的临床使用有所增加,但由于缺乏科学稳健性,它们的扩散受到阻碍。这主要是由于供体来源和制备方案存在很大差异,而供体来源和制备方案通常没有完全披露或不是专门为分配目的而设计的。特别是,仍然缺乏有关通过单采术收集的基于血小板的产品的信息。因此,本工作的目的是描述通过单采术获得的富血小板血浆裂解物(PRP-L)用于治疗DED的逐步?...

披露声明

作者声明不存在利益冲突。

致谢

作者希望感谢"Casa del Dono di Reggio Emilia"提供供体来源的血小板浓缩物。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipments
CompoSeal Mobilea IIFresenius Kabi, Germanybag sealer
HeraSafe hoodHeraeus Instruments, GermanyClass II biohazard hood
MCS+ 9000 Mobile Platelet Collection SystemHaemonetics, Italyautomated plasma and multicomponent collection equipment for donating platelet, red cell, plasma, or combination blood components
Platelet shaker, PF396iHelmer, USAPlatelet shaker
Raycell X-ray Blood IrradiatorMDS Nordion, CanadaX-ray Blood Irradiator
ROTIXA 50RSHettich Zentrifugen, GermanyHigh speed entrifuge
Sysmex XS-1000iSysmex Europe GMBH, Germanyhaemocytometer for platelet count
Warm bath, WB-M15Falc Instruments, ItalyWarm bath
Materials
ACD-A anticoagulant solution AFenwal Inc., USADIN 00788139anticoagulant solution for platelet apheresis (1000 ml)
BD BACTEC Peds Plus/F Culture vialsBD Biosciences, USABD 442020Sterility assay
BD BACTEC Peds Plus/F Culture vialsBD Biosciences, USA442020At least 2 vials for sterility assay
BD Luer Lok SyringeBD Plastipack, USA300865At least 4 sterile syringes (50 ml)
Bio-Plex Human Cancer Panel 1BioRad Laboratories, USA171AC500MStandard panel for PDGF isoforms assessment
Bio-Plex Human Cancer Panel 2BioRad Laboratories, USA171AC600MStandard panel for EGF assessment
Bio-Plex MAGPIX Multiplex ReaderBioRad Laboratories, USAMagpixThis instrument allows multiple immunoassays using functionalized magnetic beads.
Bio-Plex Pro TGF-b AssayBioRad Laboratories, USA10024984Set and standards for TGFb isoforms assessment
BioRetARIES s.r.l., ItalyA2DH0020At least 4 piercing spike for blood bags
Blood collection tubeBD Vacutainer, USA3678351 tube, necessary to perform platelet counts
Eye drops kit. COL Medical Device for the application and preservation of eye drops from haemocomponentsBiomed Device s.r.l., ItalyCOLC50Eye drops kit. At least 2 kits for each PRP unit collected
Human Cancer PDGF-AB/BB Set 1x96wellBioRad Laboratories, USA171BC511Set for PDGF isoforms assessment
Human Cancer2 EGF Set 1x96wellBioRad Laboratories, USA171BC603MSet for EGF assessment
NaCl 0.9% sterile solutionBaxter S.p.A., ItalyB05BB011000 ml
OSDI QuestionnaireAllergan Inc., USAOSDIOcular Surface Disease Index Questionnaire
Piercing spikeBioRet ARIES s.r.l., ItalyBS051004Spike
Platelet Additive Solution A+ T-PAS+TERUMO BCT Inc., Italy40842preservative solution for platelet concentrates (1000 ml)
Software ExcelMicrosoft, USAExcelData analysis software
Teruflex Transfer bag 1000 mlTERUMO BCT Inc., ItalyBB*T100BM1 for PRP dilution
Teruflex Transfer bag 300 mlTERUMO BCT Inc., ItalyBB*030CMAt least 6 for each PRP unit collected

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