פלזמה עשירה בטסיות דם לטיפול במחלות פני השטח של העין

Summary

ליזטים של טסיות דם מייצגים כלי מתפתח לטיפול במחלות פני השטח של העין. כאן אנו מציעים שיטה להכנה, חלוקה, אחסון ואפיון של ליזאט טסיות שנאסף מתורמי טסיות.

Abstract

מחלות שונות של פני השטח של העין מטופלות בטיפות עיניים שמקורן בדם. השימוש בהם הוכנס לקליניקה בגלל תכולת המטבוליטים וגורמי הגדילה שלהם, המקדמת התחדשות פני השטח של העין. ניתן להכין טיפות עיניים על בסיס דם ממקורות שונים (כלומר, תרומת אפרזיס מדם מלא או טסיות דם), כמו גם עם פרוטוקולים שונים (למשל, דילולים שונים ומחזורי הקפאה/הפשרה). שונות זו מעכבת את הסטנדרטיזציה של פרוטוקולים קליניים, וכתוצאה מכך, את הערכת היעילות הקלינית שלהם. פירוט ושיתוף ההליכים המתודולוגיים עשויים לתרום להגדרת קווים מנחים משותפים. במהלך השנים האחרונות, מוצרים אלוגניים מתפזרים כחלופה לטיפולים האוטולוגיים מכיוון שהם מבטיחים סטנדרטים גבוהים יותר של יעילות; ביניהם, טיפות עיניים פלזמה עשירות טסיות דם (PRP-L) מוכנים עם נהלי ייצור פשוטים. ביחידה לרפואת עירוי ב- AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, איטליה, PRP-L מתקבל מתרומת טסיות-אפרזיס. מוצר זה מדולל בתחילה ל-0.3 x 10^{9 טסיות} /מ"ל (החל מריכוז ממוצע של 1 x 10 9 טסיות/מ"ל) ב-NaCl של^0.9 %. טסיות מדוללות מוקפאות/מופשרות, ולאחר מכן צנטריפוגות כדי לסלק פסולת. הנפח הסופי מפוצל ל-1.45 מ"ל ומאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס. לפני מתן לחולים, טיפות עיניים נבדקות לסטריליות. חולים יכולים לאחסן ליזטים טסיות ב -15 מעלות צלזיוס למשך עד חודש. הרכב גורם הצמיחה מוערך גם מתוך aliquots שנבחרו באקראי, ואת הערכים הממוצעים מדווחים כאן.

Introduction

מוצרים שמקורם בדם נמצאים בשימוש נרחב בטיפול בפצעים¹, כירורגיית לסתות ואורתופדיה, ולטיפול^{במחלות שונות} של פני השטח של העין 2 כגון מחלת העין היבשה (DED)³. ב- DED, ההומיאוסטזיס של סרט הדמעות נפגע כתוצאה מתפקוד לא תקין של גורמים שונים המעורבים בייצור דמעות ותקינות פני השטח של העין ^4,5.

DED מאופיין בהטרוגניות בסיבות ובחומרה ^6,7,8 ועשוי להיות תוצאה של גורמים שונים כמו הזדקנות, מין⁹, עדשות מגע, תרופות אקטואליות או סיסטמיות 10^, או מצבים קיימים כמו תסמונת סיוגרן ¹⁰. למרות שיש להם תסמינים קלים, DED משפיע על מיליוני אנשים ברחבי העולם, ומשפיע על איכות חייהם וגם על מערכת הבריאות⁶.

טיפולים רבים דווחו עבור פתולוגיה זו, אבל עדיין אין קונצנזוס על הפתרון היעיל ביותר¹². נכון להיום, דמעות מלאכותיות הן קו הטיפול הראשון שמטרתו לשחזר את ההרכב המיימי של סרט הדמעות, אם כי תחליפים אלה אינם מכילים את המומסים הפעילים ביולוגית העיקריים של דמעות טבעיות ^6,11. מוצרים מבוססי טסיות נחשבים לחלופה תקפה^12,13 לקרעים מלאכותיים^, אם כי יעילותם הקלינית, המלצות לשימוש ושיטות ההכנות עדיין נתונות לוויכוח³.

מוצרים המבוססים על דם חולקים עם דמעות הרכב דומה במונחים של מטבוליטים¹⁴, חלבונים, שומנים, ויטמינים, יונים, גורמי גדילה (GFs), תרכובות נוגדות חמצון 11 ואוסמולריות (300 mOsm/L)¹¹. באמצעות הפעילות הסינרגטית של מרכיביהם, הם מקדמים את התחדשות אפיתל הקרנית, מעכבים את שחרורם של ציטוקינים דלקתיים ומגדילים את מספר תאי הגביע ואת הביטוי של מוצינים בלחמית ^2,3.

עד כה, הטרוגניות במוצרים מבוססי דם עיניים תועדה בספרות; ניתן לסווג מוצרים אלה לפי מוצא תורמי הדם, כלומר אוטולוגי או אלוגני, כמו גם מקור הדם, כלומר דם היקפי, דם טבורי, סרום או טסיות דם.

למרות שמוצרים אוטולוגיים היו^{הנפוצים ביותר 3}, אלה אלוגניים הופכים כעת לבחירה המועדפת, שכן הם מבטיחים יעילות גבוהה יותר ותקני בטיחות 15, יחד עם הפחתה משמעותית בעלויות^16,17. מחקרים קודמים, אכן, הוכיחו כי מוצרים מבוססי דם המתקבלים מחולים עם מחלות אוטואימוניות ו/או סיסטמיות עשויים להראות שינוי באיכות ובפונקציונליות 6,16,17. למרות העובדה שטיפות עיניים מבוססות סרום הן הנפוצות ביותר, מוצרים מבוססי טסיות דם מקבלים לאחרונה אישור כחלופה תקפה, שכן ניתן להכין אותם בקלות תוך שמירה על רמות משמעותיות של יעילות ^3,11. ניתן לחלק מוצרים מבוססי טסיות הזמינות כיום בפלזמה עשירה בטסיות דם (PRP), ליזאט פלזמה עשיר בטסיות (PRP-L) ופלזמה עשירה בגורמי גדילה (PRGF)³.

ביניהם, PRP-L יש את היתרון של להיות מוצר קפוא חיים ארוכים. ניתן להכין PRP-L מאפרזיס, מעילי באפי, או אפילו מטסיות שפג תוקפן (PLTs)^18,19, מה שמפחית באופן יקר את הבזבוז שלהן. ניתן לאחסן את האליקוטים במשך חודשים במרכזי עירויי הדם בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס או אפילו בבתי החולים בטמפרטורה של −15 מעלות צלזיוס לתקופות קצרות יותר.

PRP-L מועשרים מאוד ב-GFs, אשר הוכחו כמעודדים התחדשות פני השטח של העיניים 12,20,21. עם זאת, ישנם רק מחקרים קליניים מעטים שדווחו בתחום זה, וכולם השתמשו במקורות אוטולוגיים ^3,22. PRP-L עדיין זקוק לאימות ואפיון נוספים לפני שניתן יהיה להשתמש בו באופן שגרתי לטיפול במחלות פני העין, שכן אין הנחיות סטנדרטיות להכנתו, חלוקתו ואחסון³.

כאן, פרוטוקול מפורט משותף לייצור PRP-L המשמש ביחידה לרפואת עירוי ב- AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, איטליה, וחלוקה לחולים עם DED. אנו שואפים לסייע לקהילה המדעית לפתח שיטות הכנה סטנדרטיות, שעשויות להגביר את ההומוגניות והעקביות במחקרים ובגישות קליניות ברחבי העולם.

Protocol

PRP-L המשמש להערכה כמותית של גורמי צמיחה נאספו במסגרת מחקר רחב יותר על אפיון מוצרי PRP למטרות רגנרטיביות, שבוצע ב- AUSL-IRCCS di Reggio Emilia ואושר על ידי הוועדה האתית של אזור וסטה אמיליה נורד ב-10 בינואר 2019 (פרוטוקול מספר 2019/0003319). התורמים נתנו את הסכמתם מדעת בהתאם להצהרת הלסינקי. לא היה צורך באישור אתי לאיסוף הנתונים המצטברים והאנונימיים של שאלון מדד מחלות פני השטח של העין (OSDI), המשמש באופן שגרתי רופאים לניטור תסמיני תסמונת העין היבשה. איור 1A מציג מתווה של הפרוטוקול שבוצע, בעוד שהתמונות באיור 1B מתארות את השלבים העיקריים של ההליך.

1. אוסף פלזמה עשירה בטסיות דם (PRP)

1. אפרזיס PRP
   1. עבור פרוטוקול זה, בחר תורמי טסיות על פי החוקים האיטלקיים: תורמי טסיות חייבים להיות בני 18-65, עם פרמטרים תקינים של לחץ וספירת דם וספירת טסיות לא פחות מ 180 x 10⁹ טסיות / L²³. תורמים זכאים אינם יכולים ליטול תרופות נוגדות טסיות או נוגדות קרישה תוך שבוע לפני התרומה.
   2. בצע פלזמה-טסיות-אפרזיס באמצעות מערכת איסוף דם אוטומטית, על פי הוראות היצרנים והחוקים הלאומיים²³, כדי לקבל יחידה אחת של פלזמה עשירה בטסיות דם של תורם יחיד (PRP). אסוף PRP בתמיסת אדנין ציטראט דקסטרוז A (ACD-A) תמיסת נוגדי קרישה.
      הערה: טסיות-אפרזיס מתבצעת עם הליך מתמשך; זמן האיסוף הוא בטווח שבין 40 דקות ל -90 דקות. כמות ה-ACD המועברת לתורמים וזמן ההליכים תלויים במאפייני התורם, כגון המטוקריט ומד מחט.
2. מאפייני יחידות PRP
   הערה: השלב הבא מבוצע בדרך כלל באופן אוטומטי על ידי מערכת איסוף הדם האוטומטית במהלך הליך פלזמה-טסיות-אפרזיס. אנא עיין במדריך ההוראות של היצרן.
   1. השהה את יחידות ה- PRP שנאספו על ידי אפרזיס בכמות מספקת של תמיסה משמרת עם הכמות המינימלית של פלזמה שיורית, הדרושה לשמירה על pH > 6.4 במהלך כל זמן האחסון, לנפח סופי ממוצע של 180 מ"ל נטו של התמיסה נוגדת הקרישה (כ -40 מ"ל).
      הערה: על פי החוק האיטלקי, בקרות איכות צריכות להעריך כי ספירת הטסיות (PLTs) היא לפחות 2.0 x 10¹¹ PLTs / יחידה, בעוד leucocytes שיורי צריך להיות פחות מ 1 x 10^{6 תאים} / יחידה.
   2. יש לאחסן PRP מקודד ומוקרן למשך 5 ימים לכל היותר ב-22°C ±-2°C על שייקר טסיות לפני מניפולציה נוספת²³.
3. דילול PRP
   1. מיד לפני תחילת דילול PRP, בצע ספירת PLT עם המוציטומטר באמצעות הדגימה שנאספה מהשקית הראשית דרך דוקרנים חודרים.
      הערה: בצע את השלבים הבאים בסטריליות תחת מכסה מנוע biohazard מדרגה II. יש ללבוש ציוד הגנה אישי (מעיל מעבדה, כפפות ומשקפי מגן) במהלך ההליך.
   2. לדלל PRP עם כמות מספקת של NaCl סטרילי 0.9% לריכוז סופי של 0.32 x 10⁹ ± 0.03 x 10⁹ PLTs / mL, המדמה את ריכוז PLT הממוצע בדם היקפי.
   3. תוך ניצול ספייק נוקב לשקיות דם, חלקו את ה- PRP המדולל לשקיות איסוף ריקות של 300 מ"ל כדי להגיע לנפח נטו של 190 מ"ל לשקית.
   4. השתמש aliquot של PRP מדולל שיורי (בדרך כלל 1 מ"ל) כדי לבצע בקרות איכות הערכת זיהומים מיקרוביאליים אפשריים. בצע בדיקת סטריליות בהתאם להוראות היצרן במעבדה מיקרוביולוגית (ראה טבלת חומרים).
      הערה: השתמש בבקבוקוני תרבית ספציפיים לתרביות דם אירוביות, המסוגלים לבצע את התרבית האיכותית ואת ההתאוששות של מיקרואורגניזמים אירוביים (בעיקר חיידקים ושמרים) מדגימות דם בנפח קטן.
   5. יש לאחסן שקיות PRP מדוללות בטמפרטורה של −80°C למשך חודשיים לכל היותר לפני ההפשרה.

2. הכנת ליזאט פלזמה עשירה בטסיות דם (PRP-L)

1. הפשרה
   1. לפני תחילת הליך ההפשרה, ודא כי אמבטיה חמה מוגדרת ב 37 מעלות צלזיוס. הכניסו את שקיות ה- PRP לאמבטיה החמה והמתינו עד להפשרה מוחלטת.
2. אוסף PRP-L
   1. צנטריפוגה שקיות PRP ב 3000 x גרם במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: השלבים הבאים צריכים להתבצע בסטריליות תחת מכסה מנוע ביו-האזרד מדרגה II.
   2. תוך ניצול הספייק החודר של תיק ההעברה, חבר את התיק הצנטריפוגה לשקית העברה סטרילית ריקה של 300 מ"ל. בזהירות העבירו את ה-PRP-L, תוך הימנעות מפסולת, לתוך השקית החדשה. במידת האפשר, יש להשתמש במכבש שקית.
   3. אטם את צינור החיבור של יחידת PRP-L עם חותם שקית.
3. PRP-L אליציטוט
   הערה: יחידת התחלה המכילה 190 מ"ל PRP (ראה שלב 1.3.3.) מספיקה למילוי שתי ערכות טיפות עיניים (לפרטים על המכשירים הרפואיים הספציפיים המשמשים ליישום ושימור טיפות עיניים ממרכיבי הדם, עיין בטבלת החומרים). יש לפתוח ערכות טיפות עיניים מתחת למכסה מנוע מדרגה II כאשר בקבוקוני המיתרים השלמים ממוקמים מעל המזרק המחובר מראש והחץ המרכזי של הפקק מצביע שמאלה כדי לא לכלול את המסנן האנטי בקטריאלי.
   1. לאסוף 30-60 מ"ל של PRP-L עם מזרק סטרילי ולקשר את המזרק לחיבור Luer / מנעול על קו המילוי.
   2. על פי הוראות היצרן, סובב את הסטופר בחצי סיבוב כדי לפתוח את הקו בין המזרק המכיל PRP-L לבין המזרק המחובר מראש. מלא את המזרק המחובר מראש ב- PRP-L.
   3. נתק את מזרק PRP-L, סגור את מכסה הצינור של חיבור הלואר/נעילה וסובב את ה-stopcock למיקום המקורי. השתמש במזרק ערכת טיפות העיניים כדי למלא את הבקבוקונים ב- PRP-L.
   4. חזור על ההליך משלבים 2.3.1.-2.3.3. עד שכל בקבוקוני המוליך מתמלאים. ודא כי כל המוליך מלא כראוי, ולאחר מכן לאטום אותם בנפרד עם חותם שקית.
   5. חזור על ההליך עם ערכת טיפות עיניים חדשה.
   6. השתמש באליקוט קטן של PRP-L מדולל שיורי כדי להעריך זיהום מיקרוביאלי אפשרי (ראה שלב 1.3.4.).
      הערה: אם הנוזל מגיע בטעות למסנן האנטי-בקטריאלי שבקצה החוט, מזרק היניקה עלול להתנגד להתנגדות, מה שמעכב את המילוי. כדי להמשיך את מחזור המילוי, הרימו את החלק הסופי של המחרוזת לכ-5/6 אליקוטים מהמסנן ההידרופובי האנטי-בקטריאלי שבקצה החוט. במצב זה, להשתמש מזרק סטרילי חדש (של נפח 30 מ"ל) כי כבר מלא באוויר. חברו את הלואר/מנעול הנשי של המסנן האנטי-בקטריאלי ולחצו חזק ושוב על הבוכנה של המזרק כדי להסיר את כל שאריות רכיב הדם ולהפוך את הממברנה של המסנן האנטי-בקטריאלי ללא הנוזל. מוציאים את המזרק וממלאים את הבקבוקונים הנותרים.
4. אחסון PRP-L
   1. תייג כראוי כל אפליקטור והכניס אותם לשקית ניילון. תייג גם את שקית הניילון, תוך הקפדה להדגיש את קבוצת הדם של התורם.
   2. יש לאחסן בטמפרטורה של −80°C למשך 24 חודשים לכל היותר לפני הקצאת המטופל, על פי החוק האיטלקי²³ והנחיות²⁴.

3. חלוקת PRP-L

1. בצע את הקצאת המטופל עדיף על ידי התאמת קבוצת הדם PRP-L. ספק בקבוקוני אפליקטור PRP-L באמצעות קופסה קרירה וודא שכל בקבוקון אפליקטור מכיל 1.45 מ"ל של PRP-L, המתאים לכ-45 טיפות. להנחות את המטופל כי בקבוקונים המוליך ניתן לאחסן בבתי המטופלים עד 1 חודש ב -15 מעלות צלזיוס.

תוצאות

הרציונל לשימוש בטיפות עיניים שמקורן בסרום (שהוא המוצר מבוסס הדם הנפוץ ביותר לטיפול במחלות פני העין) טמון בתכולתן של GFs, אשר נגזרות כמעט לחלוטין מטסיות דם במחזור. PRP מכיל מספר גבוה משמעותית של טסיות דם (וכתוצאה מכך, של GFs שמקורם בטסיות) בהשוואה לסרום דם היקפי, הנע בין 0.15 x 10 9-0.45 x 10⁹ PLTs / mL.

Discussion

בשנים האחרונות, השימוש הקליני של מוצרים מבוססי טסיות עבור פתולוגיות פני השטח של העין גדל, אבל הדיפוזיה שלהם נפגעת על ידי חוסר חוסן מדעי. זה נגרם בעיקר על ידי הטרוגניות רחבה במקורות התורמים ופרוטוקולי הכנה, שלעתים קרובות אינם נחשפים במלואם או לא תוכננו במיוחד למטרה שלשמה הם מחולקים. במיוחד,...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
CompoSeal Mobilea II	Fresenius Kabi, Germany		bag sealer
HeraSafe hood	Heraeus Instruments, Germany		Class II biohazard hood
MCS+ 9000 Mobile Platelet Collection System	Haemonetics, Italy		automated plasma and multicomponent collection equipment for donating platelet, red cell, plasma, or combination blood components
Platelet shaker, PF396i	Helmer, USA		Platelet shaker
Raycell X-ray Blood Irradiator	MDS Nordion, Canada		X-ray Blood Irradiator
ROTIXA 50RS	Hettich Zentrifugen, Germany		High speed entrifuge
Sysmex XS-1000i	Sysmex Europe GMBH, Germany		haemocytometer for platelet count
Warm bath, WB-M15	Falc Instruments, Italy		Warm bath
Materials
ACD-A anticoagulant solution A	Fenwal Inc., USA	DIN 00788139	anticoagulant solution for platelet apheresis (1000 ml)
BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials	BD Biosciences, USA	BD 442020	Sterility assay
BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials	BD Biosciences, USA	442020	At least 2 vials for sterility assay
BD Luer Lok Syringe	BD Plastipack, USA	300865	At least 4 sterile syringes (50 ml)
Bio-Plex Human Cancer Panel 1	BioRad Laboratories, USA	171AC500M	Standard panel for PDGF isoforms assessment
Bio-Plex Human Cancer Panel 2	BioRad Laboratories, USA	171AC600M	Standard panel for EGF assessment
Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader	BioRad Laboratories, USA	Magpix	This instrument allows multiple immunoassays using functionalized magnetic beads.
Bio-Plex Pro TGF-b Assay	BioRad Laboratories, USA	10024984	Set and standards for TGFb isoforms assessment
BioRet	ARIES s.r.l., Italy	A2DH0020	At least 4 piercing spike for blood bags
Blood collection tube	BD Vacutainer, USA	367835	1 tube, necessary to perform platelet counts
Eye drops kit. COL Medical Device for the application and preservation of eye drops from haemocomponents	Biomed Device s.r.l., Italy	COLC50	Eye drops kit. At least 2 kits for each PRP unit collected
Human Cancer PDGF-AB/BB Set 1x96well	BioRad Laboratories, USA	171BC511	Set for PDGF isoforms assessment
Human Cancer2 EGF Set 1x96well	BioRad Laboratories, USA	171BC603M	Set for EGF assessment
NaCl 0.9% sterile solution	Baxter S.p.A., Italy	B05BB01	1000 ml
OSDI Questionnaire	Allergan Inc., USA	OSDI	Ocular Surface Disease Index Questionnaire
Piercing spike	BioRet ARIES s.r.l., Italy	BS051004	Spike
Platelet Additive Solution A+ T-PAS+	TERUMO BCT Inc., Italy	40842	preservative solution for platelet concentrates (1000 ml)
Software Excel	Microsoft, USA	Excel	Data analysis software
Teruflex Transfer bag 1000 ml	TERUMO BCT Inc., Italy	BB*T100BM	1 for PRP dilution
Teruflex Transfer bag 300 ml	TERUMO BCT Inc., Italy	BB*030CM	At least 6 for each PRP unit collected