Plättchenreiches Plasmalysat zur Behandlung von Erkrankungen der Augenoberfläche

Zusammenfassung

Thrombozytenlysate stellen ein aufstrebendes Werkzeug für die Behandlung von Augenoberflächenerkrankungen dar. Hier schlagen wir eine Methode zur Herstellung, Dispensation, Lagerung und Charakterisierung von Thrombozytenlysat vor, das von Thrombozytenspendern gewonnen wurde.

Zusammenfassung

Verschiedene Augenoberflächenerkrankungen werden mit Augentropfen aus Blut behandelt. Ihre Verwendung wurde aufgrund ihres Metaboliten- und Wachstumsfaktorgehalts, der die Regeneration der Augenoberfläche fördert, in die klinische Praxis eingeführt. Blutbasierte Augentropfen können aus verschiedenen Quellen (z. B. Vollblut- oder Thrombozytenapheresespende) sowie mit verschiedenen Protokollen (z. B. verschiedene Verdünnungen und Gefrier- / Tauzyklen) hergestellt werden. Diese Variabilität behindert die Standardisierung klinischer Protokolle und damit die Bewertung ihrer klinischen Wirksamkeit. Die Einzelheiten und der Austausch der methodischen Verfahren können zur Festlegung gemeinsamer Leitlinien beitragen. In den letzten Jahren haben sich allogene Produkte als Alternative zu den autologen Behandlungen verbreitet, da sie höhere Wirksamkeitsstandards garantieren. unter ihnen werden die plättchenreichen Plasmalysat (PRP-L) Augentropfen mit einfachen Herstellungsverfahren hergestellt. In der Abteilung für Transfusionsmedizin am AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, Italien, wird PRP-L aus einer Thrombozytenapheresespende gewonnen. Dieses Produkt wird zunächst auf 0,3 x 10 9 Thrombozyten/ml (ausgehend von einer durchschnittlichen Konzentration von 1 x 10 9 Thrombozyten/ml) in^0,9% NaCl verdünnt. Verdünnte Blutplättchen werden eingefroren/aufgetaut und anschließend zentrifugiert, um Ablagerungen zu beseitigen. Das Endvolumen wird in 1,45 ml Aliquots aufgeteilt und bei −80 °C gelagert. Vor der Abgabe an Patienten werden Augentropfen auf Sterilität getestet. Patienten können Thrombozytenlysate bei −15 °C für bis zu 1 Monat lagern. Die Zusammensetzung des Wachstumsfaktors wird ebenfalls aus zufällig ausgewählten Aliquots bewertet, und die Mittelwerte werden hier angegeben.

Einleitung

Aus Blut gewonnene Produkte werden häufig in der Wundversorgung¹, in der Kiefer- und Gesichtschirurgie und orthopädischen Chirurgie sowie zur Behandlung verschiedener Augenoberflächenerkrankungen² wie der Erkrankung des trockenen Auges (DED)³ eingesetzt. Bei DED ist die Tränenfilmhomöostase infolge der abnormalen Funktion verschiedener Faktoren, die an der Tränenproduktion und der Integrität der Augenoberfläche beteiligt sind, beeinträchtigt ^4,5.

DED ist durch Heterogenität in Ursachen und Schweregrad ^6,7,8 gekennzeichnet und kann eine Folge verschiedener Faktoren wie Alterung, Geschlecht 9, Kontaktlinsen^, topische oder systemische Medikamente 10 oder Vorerkrankungen wie das Sjögren-Syndrom¹⁰ sein. Trotz leichter Symptome betrifft DED Millionen von Menschen weltweit und beeinträchtigt ihre Lebensqualität und das^{Gesundheitssystem6}.

Viele Behandlungen wurden für diese Pathologie berichtet, aber es gibt immer noch keinen Konsens über die wirksamste Lösung¹². Bis heute sind künstliche Tränen die erste Therapielinie, die darauf abzielt, die wässrige Zusammensetzung des Tränenfilms wiederherzustellen, obwohl diese Ersatzstoffe nicht die wichtigsten biologisch aktiven gelösten Stoffe natürlicher Tränen enthalten ^6,11. Produkte auf Thrombozytenbasis gelten als gültige Alternative^12,13 zu künstlichen Tränen^, obwohl ihre klinische Wirksamkeit, Anwendungsempfehlungen und Zubereitungsmethoden noch umstritten sind³.

Blutbasierte Produkte teilen mit Tränen eine ähnliche Zusammensetzung in Bezug auf Metaboliten¹⁴, Proteine, Lipide, Vitamine, Ionen, Wachstumsfaktoren (GFs), antioxidative Verbindungen 11 und Osmolarität (300 mOsm / L)¹¹. Durch die synergistische Aktivität ihrer Bestandteile fördern sie die Regeneration des Hornhautepithels, hemmen die Freisetzung entzündlicher Zytokine und erhöhen die Anzahl der Becherzellen und die Expression von Mucinen in der Bindehaut ^2,3.

Bisher ist die Heterogenität in ophthalmologischen blutbasierten Produkten in der Literatur dokumentiert; Diese Produkte können nach der Herkunft der Blutspender, d.h. autolog oder allogen, sowie nach der Blutquelle, d.h. peripherem Blut, Nabelschnurblut, Serum oder Blutplättchen, klassifiziert werden.

Obwohl autologe Produkte am weitesten verbreitet waren³, werden allogene Produkte jetzt zur bevorzugten Wahl, da sie höhere Wirksamkeits- und Sicherheitsstandards¹⁵ zusammen mit einer erheblichen Kostensenkung gewährleisten^16,17. Frühere Studien haben in der Tat gezeigt, dass blutbasierte Produkte, die von Patienten mit Autoimmun- und/oder systemischen Erkrankungen gewonnen wurden, eine veränderte Qualität und Funktionalität aufweisen können 6,16,17. Trotz der Tatsache, dass Serum-basierte Augentropfen am weitesten verbreitet sind, werden Produkte auf Thrombozytenbasis in letzter Zeit als gültige Alternative bestätigt, da sie leicht hergestellt werden können, während sie ein signifikantes^{Wirksamkeitsniveau} beibehalten ^3,11. Derzeit verfügbare plättchenbasierte Produkte können in plättchenreiches Plasma (PRP), plättchenreiches Plasmalysat (PRP-L) und wachstumsfaktorreiches Plasma (PRGF)³ unterteilt werden.

Unter ihnen hat PRP-L den Vorteil, ein langlebiges Tiefkühlprodukt zu sein. PRP-L kann aus Apherese, Buffy-Coats oder sogar aus auslaufenden Blutplättchen (PLTs)^18,19 hergestellt werden^, wodurch deren Verschwendung erheblich reduziert wird. Die Aliquots können monatelang in den Bluttransfusionszentren bei −80 °C oder sogar bei Patienten zu Hause bei −15 °C für kürzere Zeiträume gelagert werden.

PRP-L sind stark angereichert in GFs, die nachweislich die Regeneration der Augenoberfläche stimulieren 12,20,21. Dennoch gibt es nur wenige berichtete klinische Studien in diesem Bereich, und alle verwendeten autologe Quellen ^3,22. PRP-L muss noch weiter validiert und charakterisiert werden, bevor es routinemäßig zur Behandlung von Augenoberflächenerkrankungen eingesetzt werden kann, da es keine standardisierten Richtlinien für seine Herstellung, Abgabe und Lagerung gibt³.

Hierin wird ein detailliertes Protokoll für die Herstellung von PRP-L in der Abteilung für Transfusionsmedizin in AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, Italien, und die Abgabe an Patienten mit DED veröffentlicht. Unser Ziel ist es, die wissenschaftliche Gemeinschaft bei der Entwicklung von Standardpräparationsmethoden zu unterstützen, die die Homogenität und Konsistenz in weltweiten Studien und klinischen Ansätzen erhöhen können.

Protokoll

PRP-L, das für die quantitative Bewertung von Wachstumsfaktoren verwendet wird, wurde im Rahmen einer breiteren Studie zur Charakterisierung von PRP-Produkten für regenerative Zwecke gesammelt, die am AUSL-IRCCS di Reggio Emilia durchgeführt und am 10. Januar 2019 vom Ethikausschuss Area Vasta Emilia Nord genehmigt wurde (Protokollnummer 2019/0003319). Die Geber gaben ihre informierte Zustimmung gemäß der Deklaration von Helsinki. Für die Erfassung der aggregierten, anonymen Daten des OSDI-Fragebogens (Ocular Surface Disease Index), der routinemäßig von Klinikern zur Überwachung der Symptome des Syndroms des trockenen Auges verwendet wird, war keine ethische Genehmigung erforderlich. Abbildung 1A zeigt einen Überblick über das befolgte Protokoll, während die Bilder in Abbildung 1B die wichtigsten Schritte des Verfahrens darstellen.

1. Sammlung von plättchenreichem Plasma (PRP)

1. PRP-Apherese
   1. Wählen Sie für dieses Protokoll Thrombozytenspender nach italienischem Recht aus: Thrombozytenspender müssen 18-65 Jahre alt sein, normale Druck- und Blutbildparameter und eine Thrombozytenzahl von mindestens 180 x 10⁹ Blutplättchen / L²³ aufweisen. Geeignete Spender können innerhalb von 1 Woche vor der Spende keine Thrombozytenaggregationshemmer oder gerinnungshemmende Medikamente einnehmen.
   2. Führen Sie eine Plasma-Thrombozyten-Apherese mit einem automatisierten Blutentnahmesystem gemäß den Anweisungen des Herstellers und den nationalen Gesetzen²³ durch, um 1 Einheit plättchenreiches Plasma (PRP) mit einem einzigen Donor zu erhalten. Sammeln Sie PRP in Adenincitrat-Dextroselösung Eine (ACD-A) gerinnungshemmende Lösung.
      HINWEIS: Die Thrombozytenapherese wird mit einem kontinuierlichen Verfahren durchgeführt; Die Zeit der Abholung liegt in einem Bereich zwischen 40 min und 90 min. Die Menge der ACD, die an die Spender abgegeben wird, und die Zeit der Eingriffe hängen von den Spendereigenschaften ab, z. B. Hämatokrit und Nadelstärke.
2. Eigenschaften von PRP-Einheiten
   HINWEIS: Der folgende Schritt wird normalerweise automatisch vom automatisierten Blutentnahmesystem während des Plasma-Thrombozyten-Apherese-Verfahrens durchgeführt. Bitte beachten Sie die Bedienungsanleitung des Herstellers.
   1. Die durch Apherese gewonnenen PRP-Einheiten werden in einer ausreichenden Menge Konservierungslösung mit der minimalen Menge an Restplasma, die erforderlich ist, um den pH-Wert > 6,4 während der gesamten Lagerzeit aufrechtzuerhalten, auf ein mittleres Endvolumen von 180 ml netto der gerinnungshemmenden Lösung (etwa 40 ml) resuspendiert.
      HINWEIS: Nach italienischem Recht müssen Qualitätskontrollen feststellen, dass die Anzahl der Thrombozyten (PLTs) mindestens 2,0 x 10 11 PLTs/Einheit beträgt, während Restleukozyten weniger als 1 x^{10 6} Zellen/Einheit betragen müssen.
   2. Leukodiertes und bestrahltes PRP vor der weiteren Behandlung maximal 5 Tage bei 22 °C ± 2 °C auf einem Thrombozytenschüttler lagern²³.
3. PRP-Verdünnung
   1. Führen Sie unmittelbar vor Beginn der PRP-Verdünnung eine PLT-Zählung mit einem Hämozytometer durch, wobei die Probe aus dem Hauptbeutel durch einen Piercing-Spike entnommen wird.
      HINWEIS: Führen Sie die nächsten Schritte zur Sterilität unter einer Biohazard-Haube der Klasse II durch. Tragen Sie während des Eingriffs persönliche Schutzausrüstung (Laborkittel, Handschuhe und Schutzbrille).
   2. PRP wird mit einer ausreichenden Menge steriler 0,9% NaCl auf eine Endkonzentration von 0,32 x 10 9 ± 0,03 x 10⁹ PLTs/ml verdünnt, was die durchschnittliche PLT-Konzentration im peripheren Blut simuliert.
   3. Unter Ausnutzung eines Piercing-Spikes für Blutbeutel teilen Sie das verdünnte PRP in 300 ml leere Sammelbeutel auf, um ein Nettovolumen von 190 ml / Beutel zu erreichen.
   4. Verwenden Sie ein Aliquot von verdünntem Rest-PRP (normalerweise 1 ml), um Qualitätskontrollen durchzuführen, um mögliche mikrobielle Kontaminationen zu bewerten. Führen Sie einen Sterilitätstest gemäß den Anweisungen des Herstellers in einem mikrobiologischen Labor durch (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Verwenden Sie Kulturfläschchen, die speziell für aerobe Blutkulturen geeignet sind, die in der Lage sind, die qualitative Kultur und Erholung von aeroben Mikroorganismen (hauptsächlich Bakterien und Hefe) aus kleinvolumigen Blutproben durchzuführen.
   5. Verdünnte PRP-Beutel vor dem Auftauen maximal 2 Monate bei −80 °C lagern.

2. Plättchenreiche Plasmalysat-Zubereitung (PRP-L)

1. Auftauen
   1. Stellen Sie vor Beginn des Auftauvorgangs sicher, dass ein warmes Bad auf 37 °C eingestellt ist. Legen Sie die PRP-Beutel in das warme Bad und warten Sie, bis sie vollständig aufgetaut sind.
2. Kollektion PRP-L
   1. Zentrifugieren Sie die PRP-Beutel bei 3000 x g für 30 min bei Raumtemperatur.
      HINWEIS: Die nächsten Schritte sollten in Sterilität unter einer Biohazard-Haube der Klasse II durchgeführt werden.
   2. Verbinden Sie den zentrifugierten Beutel unter Ausnutzung des Piercing-Spikes des Transferbeutels mit einem leeren sterilen 300-ml-Transferbeutel. Übertragen Sie den PRP-L-Überstand vorsichtig unter Vermeidung von Ablagerungen in den neuen Beutel. Wenn möglich, verwenden Sie eine Beutelpresse.
   3. Verschließen Sie das Anschlussrohr der PRP-L-Einheit mit einer Beutelversiegelung.
3. PRP-L Alizitat
   HINWEIS: Eine Starteinheit mit 190 ml PRP (siehe Schritt 1.3.3.) reicht aus, um zwei Augentropfen-Kits zu füllen (Einzelheiten zu den spezifischen Medizinprodukten, die für die Anwendung und Konservierung von Augentropfen aus Blutbestandteilen verwendet werden, finden Sie in der Materialtabelle). Augentropfen-Kits sollten unter einer Haube der Klasse II geöffnet werden, wobei die gesamten Durchstechflaschen über der vorangeschlossenen Spritze positioniert sind und der zentrale Pfeil des Absperrhahns nach links zeigt, um den antibakteriellen Filter auszuschließen.
   1. Sammeln Sie 30-60 ml PRP-L mit einer sterilen Spritze und verbinden Sie die Spritze mit dem Luer/Lock-Anschluss an der Abfülllinie.
   2. Drehen Sie den Absperrhahn gemäß den Anweisungen des Herstellers um eine halbe Umdrehung, um die Leitung zwischen der PRP-L-haltigen Spritze und der vorangeschlossenen Spritze zu öffnen. Füllen Sie die vorangeschlossene Spritze mit PRP-L.
   3. Trennen Sie die PRP-L-Spritze, schließen Sie die Schlauchkappe der Luer/Lock-Verbindung und drehen Sie den Absperrhahn in die ursprüngliche Position. Verwenden Sie die Augentropfen-Kit-Spritze, um die Durchstechflaschen mit PRP-L zu füllen.
   4. Wiederholen Sie den Vorgang aus den Schritten 2.3.1.-2.3.3. bis alle Applikatorfläschchen gefüllt sind. Stellen Sie sicher, dass jeder Applikator ordnungsgemäß gefüllt ist, und verschließen Sie ihn dann einzeln mit einem Beutelverschließer.
   5. Wiederholen Sie den Vorgang mit einem neuen Augentropfen-Kit.
   6. Verwenden Sie ein kleines Aliquot des verbleibenden verdünnten PRP-L, um eine mögliche mikrobielle Kontamination zu beurteilen (siehe Schritt 1.3.4.).
      HINWEIS: Wenn die Flüssigkeit versehentlich den antibakteriellen Filter am Ende der Schnur erreicht, kann die Saugspritze dem Widerstand entgegenwirken und die Füllung behindern. Um den Füllzyklus fortzusetzen, heben Sie den Endabschnitt der Schnur für etwa 5/6 Aliquots aus dem antibakteriellen hydrophoben Filter am Ende der Schnur an. Verwenden Sie in dieser Position eine neue sterile Spritze (von 30 ml Volumen), die bereits mit Luft gefüllt wurde. Schließen Sie den weiblichen Luer/Lock des antibakteriellen Filters an und drücken Sie hart und wiederholt auf den Kolben der Spritze, um alle Rückstände von Blutbestandteilen zu entfernen und die Membran des antibakteriellen Filters von der Flüssigkeit frei zu machen. Entfernen Sie die Spritze und füllen Sie die restlichen Durchstechflaschen.
4. PRP-L Lagerung
   1. Beschriften Sie jeden Applikator richtig und legen Sie ihn in einen Plastikbeutel. Beschriften Sie auch die Plastiktüte und achten Sie darauf, die Blutgruppe des Spenders hervorzuheben.
   2. Lagerung bei −80 °C für maximal 24 Monate vor der Patientenzuweisung gemäß dem italienischen Gesetz²³ und den Richtlinien²⁴.

3. PRP-L Dispensation

1. Führen Sie die Patientenzuordnung vorzugsweise durch Abgleich der PRP-L-Blutgruppe durch. Geben Sie PRP-L-Applikatorfläschchen in einer Kühlbox ab und stellen Sie sicher, dass jede Applikatordurchstechflasche 1,45 ml PRP-L enthält, was etwa 45 Tropfen entspricht. Weisen Sie den Patienten an, dass Applikatorfläschchen bis zu 1 Monat bei den Patienten zu Hause bei −15 °C gelagert werden können.

Ergebnisse

Der Grund für die Verwendung von Serum-basierten Augentropfen (das am häufigsten zur Behandlung von Augenoberflächenerkrankungen verwendete blutbasierte Produkt) liegt in ihrem Gehalt an GFs, die fast vollständig aus zirkulierenden Blutplättchen gewonnen werden. PRP enthält eine signifikant höhere Anzahl von Blutplättchen (und folglich von aus Blutplättchen gewonnenen GFs) im Vergleich zu peripherem Blutserum, zwischen 0,15 x 10 9-0,45 x 10⁹ PLTs/ml. Nach italienischem Recht sollte die Thro...

Diskussion

In den letzten Jahren hat die klinische Verwendung von plättchenbasierten Produkten für Augenoberflächenpathologien zugenommen, aber ihre Diffusion wird durch den Mangel an wissenschaftlicher Robustheit behindert. Dies ist vor allem auf die große Heterogenität der Spenderquellen und Präparationsprotokolle zurückzuführen, die oft nicht vollständig offengelegt oder nicht speziell für den Zweck, für den sie abgegeben werden, ausgelegt sind. Insbesondere fehlen noch Informationen über plättchenbasierte Produkte,...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
CompoSeal Mobilea II	Fresenius Kabi, Germany		bag sealer
HeraSafe hood	Heraeus Instruments, Germany		Class II biohazard hood
MCS+ 9000 Mobile Platelet Collection System	Haemonetics, Italy		automated plasma and multicomponent collection equipment for donating platelet, red cell, plasma, or combination blood components
Platelet shaker, PF396i	Helmer, USA		Platelet shaker
Raycell X-ray Blood Irradiator	MDS Nordion, Canada		X-ray Blood Irradiator
ROTIXA 50RS	Hettich Zentrifugen, Germany		High speed entrifuge
Sysmex XS-1000i	Sysmex Europe GMBH, Germany		haemocytometer for platelet count
Warm bath, WB-M15	Falc Instruments, Italy		Warm bath
Materials
ACD-A anticoagulant solution A	Fenwal Inc., USA	DIN 00788139	anticoagulant solution for platelet apheresis (1000 ml)
BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials	BD Biosciences, USA	BD 442020	Sterility assay
BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials	BD Biosciences, USA	442020	At least 2 vials for sterility assay
BD Luer Lok Syringe	BD Plastipack, USA	300865	At least 4 sterile syringes (50 ml)
Bio-Plex Human Cancer Panel 1	BioRad Laboratories, USA	171AC500M	Standard panel for PDGF isoforms assessment
Bio-Plex Human Cancer Panel 2	BioRad Laboratories, USA	171AC600M	Standard panel for EGF assessment
Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader	BioRad Laboratories, USA	Magpix	This instrument allows multiple immunoassays using functionalized magnetic beads.
Bio-Plex Pro TGF-b Assay	BioRad Laboratories, USA	10024984	Set and standards for TGFb isoforms assessment
BioRet	ARIES s.r.l., Italy	A2DH0020	At least 4 piercing spike for blood bags
Blood collection tube	BD Vacutainer, USA	367835	1 tube, necessary to perform platelet counts
Eye drops kit. COL Medical Device for the application and preservation of eye drops from haemocomponents	Biomed Device s.r.l., Italy	COLC50	Eye drops kit. At least 2 kits for each PRP unit collected
Human Cancer PDGF-AB/BB Set 1x96well	BioRad Laboratories, USA	171BC511	Set for PDGF isoforms assessment
Human Cancer2 EGF Set 1x96well	BioRad Laboratories, USA	171BC603M	Set for EGF assessment
NaCl 0.9% sterile solution	Baxter S.p.A., Italy	B05BB01	1000 ml
OSDI Questionnaire	Allergan Inc., USA	OSDI	Ocular Surface Disease Index Questionnaire
Piercing spike	BioRet ARIES s.r.l., Italy	BS051004	Spike
Platelet Additive Solution A+ T-PAS+	TERUMO BCT Inc., Italy	40842	preservative solution for platelet concentrates (1000 ml)
Software Excel	Microsoft, USA	Excel	Data analysis software
Teruflex Transfer bag 1000 ml	TERUMO BCT Inc., Italy	BB*T100BM	1 for PRP dilution
Teruflex Transfer bag 300 ml	TERUMO BCT Inc., Italy	BB*030CM	At least 6 for each PRP unit collected