Lisado plasmático rico en plaquetas para el tratamiento de enfermedades de la superficie ocular

Resumen

Los lisados plaquetarios representan una herramienta emergente para el tratamiento de las enfermedades de la superficie ocular. Aquí, proponemos un método para la preparación, dispensación, almacenamiento y caracterización del lisado plaquetario recolectado de donantes de plaquetas.

Resumen

Varias enfermedades de la superficie ocular se tratan con gotas oculares derivadas de la sangre. Su uso se ha introducido en la práctica clínica debido a su contenido de metabolitos y factores de crecimiento, lo que promueve la regeneración de la superficie ocular. Las gotas oftálmicas a base de sangre se pueden preparar a partir de diferentes fuentes (es decir, donación de sangre total o aféresis plaquetaria), así como con diferentes protocolos (por ejemplo, diferentes diluciones y ciclos de congelación / descongelación). Esta variabilidad dificulta la estandarización de los protocolos clínicos y, en consecuencia, la evaluación de su eficacia clínica. Detallar y compartir los procedimientos metodológicos puede contribuir a definir directrices comunes. En los últimos años, los productos alogénicos se han ido difundiendo como alternativa a los tratamientos autólogos, ya que garantizan mayores estándares de eficacia; entre ellos, las gotas oftálmicas de lisado de plasma rico en plaquetas (PRP-L) se preparan con procedimientos de fabricación simples. En la unidad de medicina transfusional de AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, Italia, el PRP-L se obtiene de la donación de aféresis plaquetaria. Este producto se diluye inicialmente a 0,3 x 10 9 plaquetas/ml (a partir de una concentración media de 1 x 10 9 plaquetas/ml) en NaCl al^0,9%. Las plaquetas diluidas se congelan/descongelan y, posteriormente, se centrifugan para eliminar los residuos. El volumen final se divide en alícuotas de 1,45 ml y se almacena a −80 °C. Antes de ser dispensado a los pacientes, las gotas para los ojos se prueban para determinar su esterilidad. Los pacientes pueden almacenar lisados plaquetarios a -15 °C durante un máximo de 1 mes. La composición del factor de crecimiento también se evalúa a partir de alícuotas seleccionadas al azar, y los valores medios se informan aquí.

Introducción

Los productos derivados de la sangre son ampliamente utilizados en el cuidado de heridas¹, cirugía maxilofacial y ortopédica, y para el tratamiento de diferentes enfermedades de la superficie ocular² como la enfermedad del ojo seco (DED)³. En la DED, la homeostasis de la película lagrimal se ve afectada como consecuencia del funcionamiento anormal de diferentes factores involucrados en la producción de lágrimas y la integridad de la superficie ocular ^4,5.

La DED se caracteriza por heterogeneidad en las causas y la gravedad ^6,7,8 y puede ser consecuencia de diferentes factores como el envejecimiento, el sexo⁹, las lentes de contacto, los medicamentos tópicos o sistémicos 10^, o condiciones preexistentes como el síndrome de Sjögren¹⁰. A pesar de tener síntomas leves, el DED afecta a millones de personas en todo el mundo, afectando su calidad de vida y también el sistema de salud⁶.

Muchos tratamientos han sido reportados para esta patología, pero aún no hay consenso sobre la solución más efectiva¹². Hasta la fecha, las lágrimas artificiales son la primera línea de terapia dirigida a restaurar la composición acuosa de la película lagrimal, aunque estos sustitutos no contienen los principales solutos biológicamente activos de las lágrimas naturales ^6,11. Los productos a base de plaquetas se consideran una alternativa válida^12,13 a las lágrimas artificiales^, aunque su eficacia clínica, recomendaciones de uso y métodos de preparación siguen siendo un tema de debate³.

Los productos derivados de la sangre comparten con las lágrimas una composición similar en términos de metabolitos¹⁴, proteínas, lípidos, vitaminas, iones, factores de crecimiento (GF), compuestos antioxidantes 11 y osmolaridad (300 mOsm/L)¹¹. A través de la actividad sinérgica de sus componentes, promueven la regeneración del epitelio corneal, inhiben la liberación de citoquinas inflamatorias y aumentan el número de células caliciformes y la expresión de mucinas en la conjuntiva ^2,3.

Hasta ahora, la heterogeneidad en los productos oftálmicos a base de sangre se ha documentado en la literatura; Estos productos se pueden clasificar según el origen de los donantes de sangre, es decir, autólogos o alogénicos, así como la fuente de sangre, es decir, sangre periférica, sangre del cordón umbilical, suero o plaquetas.

A pesar de que los productos autólogos fueron los más extendidos³, los alogénicos se están convirtiendo en la opción preferida, ya que garantizan mayores estándares de eficacia y seguridad 15, junto con una reducción significativa de los costos^16,17. Estudios previos, de hecho, demostraron que los productos sanguíneos obtenidos de pacientes con enfermedades autoinmunes y/o sistémicas pueden mostrar una calidad y funcionalidad alteradas 6,16,17. A pesar de que los colirios a base de suero son los más extendidos, los productos a base de plaquetas se están afirmando recientemente como una alternativa válida, ya que pueden ser fácilmente preparados manteniendo niveles significativos de eficacia ^3,11. Los productos a base de plaquetas actualmente disponibles se pueden dividir en plasma rico en plaquetas (PRP), lisado plasmático rico en plaquetas (PRP-L) y plasma rico en factores de crecimiento (PRGF)³.

Entre ellos, el PRP-L tiene la ventaja de ser un producto congelado de larga duración. El PRP-L se puede preparar a partir de aféresis, capas leucocitarias o incluso de plaquetas expirantes (PLTs)^18,19, reduciendo preciosamente su desperdicio. Las alícuotas pueden almacenarse durante meses en los centros de transfusiones de sangre a -80 °C o incluso en los hogares de los pacientes a -15 °C durante períodos más cortos.

Los PRP-L están altamente enriquecidos en GFs, que han demostrado estimular la regeneración de la superficie ocular 12,20,21. Sin embargo, existen pocos estudios clínicos reportados en esta área, y todos ellos utilizaron fuentes autólogas ^3,22. El PRP-L aún necesita una mayor validación y caracterización antes de que pueda ser utilizado rutinariamente para el tratamiento de enfermedades de la superficie ocular, ya que no existen pautas estandarizadas para su preparación, dispensación y almacenamiento³.

En este documento, se comparte un protocolo detallado para la producción de PRP-L utilizado en la Unidad de Medicina Transfusional en AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, Italia, y la dispensación a pacientes con DED. Nuestro objetivo es ayudar a la comunidad científica a desarrollar métodos estándar de preparación, que pueden aumentar la homogeneidad y la consistencia en los estudios y enfoques clínicos en todo el mundo.

Protocolo

El PRP-L utilizado para la evaluación cuantitativa de los factores de crecimiento se recogió en un estudio más amplio sobre la caracterización de productos de PRP con fines regenerativos, llevado a cabo en el AUSL-IRCCS di Reggio Emilia y aprobado por el Comité de Ética del Área Vasta Emilia Nord el 10 de enero de 2019 (número de protocolo 2019/0003319). Los donantes dieron su consentimiento informado de conformidad con la Declaración de Helsinki. No fue necesaria la aprobación ética para recopilar los datos agregados y anónimos del cuestionario Ocular Surface Disease Index (OSDI), que los médicos utilizan habitualmente para controlar los síntomas del síndrome del ojo seco. La Figura 1A muestra un esquema del protocolo seguido, mientras que las imágenes de la Figura 1B muestran los pasos principales del procedimiento.

1. Recolección de plasma rico en plaquetas (PRP)

1. aféresis PRP
   1. Para este protocolo, seleccione donantes de plaquetas de acuerdo con las leyes italianas: los donantes de plaquetas deben tener entre 18 y 65 años, con parámetros normales de presión y recuento sanguíneo y un recuento de plaquetas no inferior a 180 x 10⁹ plaquetas / L²³. Los donantes elegibles no pueden tomar medicamentos antiplaquetarios o anticoagulantes dentro de 1 semana antes de la donación.
   2. Realizar aféresis plaquetaria plasmática utilizando un sistema automatizado de recolección de sangre, de acuerdo con las instrucciones del fabricante y las leyes nacionales²³, para obtener 1 unidad de plasma rico en plaquetas (PRP) de un solo donante. Recolecte PRP en una solución anticoagulante de adenina citrato dextrosa A (ACD-A).
      NOTA: La aféresis plaquetaria se realiza con un procedimiento continuo; El tiempo de recogida está en un rango entre 40 min y 90 min. La cantidad de ACD administrada a los donantes y el tiempo de los procedimientos dependen de las características del donante, por ejemplo, hematocrito y calibre de aguja.
2. Características de las unidades PRP
   NOTA: El siguiente paso generalmente se realiza automáticamente por el sistema automatizado de recolección de sangre durante el procedimiento de aféresis plasmática-plaquetaria. Consulte el manual de instrucciones del fabricante.
   1. Resuspender las unidades de PRP recogidas por aféresis en una cantidad adecuada de solución conservante con la cantidad mínima de plasma residual, necesaria para mantener un pH > 6,4 durante todo el tiempo de conservación, hasta un volumen final medio de 180 ml netos de la solución anticoagulante (alrededor de 40 ml).
      NOTA: De acuerdo con la ley italiana, los controles de calidad deben evaluar que el recuento de plaquetas (PLT) sea de al menos 2,0 x 10¹¹ PLTs/unidad, mientras que los leucocitos residuales tienen que ser inferiores a 1 x 10⁶ células/unidad.
   2. Conservar el PRP leucodepleto e irradiado durante un máximo de 5 días a 22 °C ± 2 °C en un agitador de plaquetas antes de su posterior manipulación²³.
3. Dilución de PRP
   1. Inmediatamente antes de comenzar la dilución de PRP, realice un recuento de PLT con un hemocitómetro utilizando la muestra recolectada de la bolsa principal a través de un pico perforante.
      NOTA: Realice los siguientes pasos en esterilidad bajo una campana de riesgo biológico de clase II. Use equipo de protección personal (bata de laboratorio, guantes y gafas) durante el procedimiento.
   2. Diluir PRP con una cantidad adecuada de NaCl estéril al 0,9% hasta una concentración final de 0,32 x 10 9 ± 0,03 x 10⁹ PLTs/mL, que simula la concentración media de PLT en sangre periférica.
   3. Aprovechando un pico penetrante para bolsas de sangre, divida el PRP diluido en bolsas de recolección vacías de 300 ml para alcanzar un volumen neto de 190 ml / bolsa.
   4. Utilizar una alícuota de PRP diluido residual (generalmente 1 mL) para realizar controles de calidad evaluando posibles contaminaciones microbianas. Realice un ensayo de esterilidad siguiendo las instrucciones del fabricante en un laboratorio de microbiología (ver Tabla de materiales).
      NOTA: Utilice viales de cultivo específicos para hemocultivos aeróbicos, que son capaces de realizar el cultivo cualitativo y la recuperación de microorganismos aeróbicos (principalmente bacterias y levaduras) a partir de muestras de sangre de pequeño volumen.
   5. Guarde las bolsas de PRP diluidas a -80 °C durante un máximo de 2 meses antes de descongelarlas.

2. Preparación de lisado de plasma rico en plaquetas (PRP-L)

1. Descongelación
   1. Antes de iniciar el procedimiento de descongelación, asegúrese de que el baño caliente esté a 37 °C. Coloque las bolsas de PRP en el baño caliente y espere hasta que se descongelen por completo.
2. Colección PRP-L
   1. Centrifugar las bolsas de PRP a 3000 x g durante 30 min a temperatura ambiente.
      NOTA: Los siguientes pasos deben realizarse en esterilidad bajo una campana de riesgo biológico de clase II.
   2. Aprovechando la punta perforante de la bolsa de transferencia, conecte la bolsa centrifugada con una bolsa de transferencia estéril vacía de 300 ml. Con cuidado, transfiera el sobrenadante PRP-L, evitando residuos, a la nueva bolsa. Cuando sea posible, use una prensa de bolsas.
   3. Selle el tubo de conexión de la unidad PRP-L con un sellador de bolsas.
3. Alícuota PRP-L
   NOTA: Una unidad inicial que contenga 190 ml de PRP (ver paso 1.3.3.) es suficiente para llenar dos kits de gotas para los ojos (para obtener detalles sobre los dispositivos médicos específicos utilizados para la aplicación y preservación de gotas para los ojos de los componentes sanguíneos, consulte la Tabla de materiales). Los kits de gotas para los ojos deben abrirse debajo de una campana de clase II con todos los viales de cuerda colocados sobre la jeringa preconectada y la flecha central de la llave de paso apuntando hacia la izquierda para excluir el filtro antibacteriano.
   1. Recoja 30-60 ml de PRP-L con una jeringa estéril y conecte la jeringa a la conexión Luer/lock en la línea de llenado.
   2. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, gire la llave de paso a la mitad de una vuelta para abrir la línea entre la jeringa que contiene PRP-L y la jeringa preconectada. Llene la jeringa preconectada con PRP-L.
   3. Desconecte la jeringa PRP-L, cierre la tapa del tubo de la conexión luer/lock y gire la llave de paso a la posición original. Utilice la jeringa del kit de gotas para los ojos para llenar los viales con PRP-L.
   4. Repita el procedimiento de los pasos 2.3.1.-2.3.3. hasta que se llenen todos los viales aplicadores. Asegúrese de que cada aplicador esté debidamente lleno, luego séllelos individualmente con un sellador de bolsas.
   5. Repita el procedimiento con un nuevo kit de gotas para los ojos.
   6. Utilice una pequeña alícuota de PRP-L diluido residual para evaluar la posible contaminación microbiana (ver paso 1.3.4.).
      NOTA: Si el líquido alcanza accidentalmente el filtro antibacteriano al final de la cuerda, la jeringa de succión puede oponerse a la resistencia, dificultando el llenado. Para continuar el ciclo de llenado, levante la sección final de la cuerda durante aproximadamente 5/6 alícuotas del filtro hidrófobo antibacteriano al final de la cuerda. En esta posición, use una jeringa estéril nueva (de 30 ml de volumen) que ya haya sido llenada con aire. Conecte el luer/bloqueo hembra del filtro antibacteriano y presione fuerte y repetidamente sobre el émbolo de la jeringa para eliminar todos los residuos de componentes sanguíneos y liberar la membrana del filtro antibacteriano del líquido. Retire la jeringa y llene los viales restantes.
4. Almacenamiento PRP-L
   1. Etiquete adecuadamente cada aplicador y póngalos en una bolsa de plástico. Etiquete también la bolsa de plástico, teniendo cuidado de resaltar el grupo sanguíneo del donante.
   2. Conservar a -80 °C durante un máximo de 24 meses antes de la asignación del paciente, de acuerdo con la ley italiana²³ y las directrices²⁴.

3. Dispensación PRP-L

1. Realice la asignación del paciente preferiblemente haciendo coincidir el grupo sanguíneo PRP-L. Administre los viales del aplicador de PRP-L utilizando una caja fría y asegúrese de que cada vial del aplicador contenga 1,45 ml de PRP-L, lo que corresponde a aproximadamente 45 gotas. Indique al paciente que los viales aplicadores se pueden almacenar en los hogares de los pacientes hasta 1 mes a -15 °C.

Resultados

La justificación para el uso de gotas oftálmicas derivadas del suero (que es el producto a base de sangre más utilizado para el tratamiento de enfermedades de la superficie ocular) radica en su contenido de GF, que se derivan casi por completo de las plaquetas circulantes. El PRP contiene un número significativamente mayor de plaquetas (y, en consecuencia, de GF derivados de plaquetas) en comparación con el suero de sangre periférica, que oscila entre 0,15 x 10 9-0,45 x 10⁹ PLTs/mL. De acuerdo...

Discusión

En los últimos años, el uso clínico de productos a base de plaquetas para patologías de la superficie ocular ha aumentado, pero su difusión se ve obstaculizada por la falta de robustez científica. Esto se debe principalmente a la gran heterogeneidad en las fuentes de donantes y los protocolos de preparación, que a menudo no se divulgan completamente o no están diseñados específicamente para el propósito para el que se dispensan. En particular, todavía falta información sobre los productos a base de plaquetas...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
CompoSeal Mobilea II	Fresenius Kabi, Germany		bag sealer
HeraSafe hood	Heraeus Instruments, Germany		Class II biohazard hood
MCS+ 9000 Mobile Platelet Collection System	Haemonetics, Italy		automated plasma and multicomponent collection equipment for donating platelet, red cell, plasma, or combination blood components
Platelet shaker, PF396i	Helmer, USA		Platelet shaker
Raycell X-ray Blood Irradiator	MDS Nordion, Canada		X-ray Blood Irradiator
ROTIXA 50RS	Hettich Zentrifugen, Germany		High speed entrifuge
Sysmex XS-1000i	Sysmex Europe GMBH, Germany		haemocytometer for platelet count
Warm bath, WB-M15	Falc Instruments, Italy		Warm bath
Materials
ACD-A anticoagulant solution A	Fenwal Inc., USA	DIN 00788139	anticoagulant solution for platelet apheresis (1000 ml)
BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials	BD Biosciences, USA	BD 442020	Sterility assay
BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials	BD Biosciences, USA	442020	At least 2 vials for sterility assay
BD Luer Lok Syringe	BD Plastipack, USA	300865	At least 4 sterile syringes (50 ml)
Bio-Plex Human Cancer Panel 1	BioRad Laboratories, USA	171AC500M	Standard panel for PDGF isoforms assessment
Bio-Plex Human Cancer Panel 2	BioRad Laboratories, USA	171AC600M	Standard panel for EGF assessment
Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader	BioRad Laboratories, USA	Magpix	This instrument allows multiple immunoassays using functionalized magnetic beads.
Bio-Plex Pro TGF-b Assay	BioRad Laboratories, USA	10024984	Set and standards for TGFb isoforms assessment
BioRet	ARIES s.r.l., Italy	A2DH0020	At least 4 piercing spike for blood bags
Blood collection tube	BD Vacutainer, USA	367835	1 tube, necessary to perform platelet counts
Eye drops kit. COL Medical Device for the application and preservation of eye drops from haemocomponents	Biomed Device s.r.l., Italy	COLC50	Eye drops kit. At least 2 kits for each PRP unit collected
Human Cancer PDGF-AB/BB Set 1x96well	BioRad Laboratories, USA	171BC511	Set for PDGF isoforms assessment
Human Cancer2 EGF Set 1x96well	BioRad Laboratories, USA	171BC603M	Set for EGF assessment
NaCl 0.9% sterile solution	Baxter S.p.A., Italy	B05BB01	1000 ml
OSDI Questionnaire	Allergan Inc., USA	OSDI	Ocular Surface Disease Index Questionnaire
Piercing spike	BioRet ARIES s.r.l., Italy	BS051004	Spike
Platelet Additive Solution A+ T-PAS+	TERUMO BCT Inc., Italy	40842	preservative solution for platelet concentrates (1000 ml)
Software Excel	Microsoft, USA	Excel	Data analysis software
Teruflex Transfer bag 1000 ml	TERUMO BCT Inc., Italy	BB*T100BM	1 for PRP dilution
Teruflex Transfer bag 300 ml	TERUMO BCT Inc., Italy	BB*030CM	At least 6 for each PRP unit collected