Göz Yüzeyi Hastalıklarının Tedavisinde Trombositten Zengin Plazma Lizat

Özet

Trombosit lizatları, oküler yüzey hastalıklarının tedavisinde ortaya çıkan bir araçtır. Burada, trombosit donörlerinden toplanan trombosit lizatının hazırlanması, dağıtılması, depolanması ve karakterizasyonu için bir yöntem öneriyoruz.

Özet

Çeşitli oküler yüzey hastalıkları kan kaynaklı göz damlaları ile tedavi edilir. Göz yüzeyi yenilenmesini destekleyen metabolit ve büyüme faktörü içeriği nedeniyle kullanımları klinik pratikte tanıtılmıştır. Kan bazlı göz damlaları, farklı kaynaklardan (yani, tam kan veya trombosit aferez bağışı) ve farklı protokollerle (örneğin, farklı seyreltmeler ve donma / çözülme döngüleri) hazırlanabilir. Bu değişkenlik, klinik protokollerin standardizasyonunu ve dolayısıyla klinik etkinliklerinin değerlendirilmesini engellemektedir. Metodolojik prosedürlerin detaylandırılması ve paylaşılması, ortak kılavuzların tanımlanmasına katkıda bulunabilir. Son yıllarda, allojenik ürünler, daha yüksek etkinlik standartlarını garanti ettikleri için otolog tedavilere alternatif olarak yayılmaktadır; Bunlar arasında, trombositten zengin plazma lizat (PRP-L) göz damlaları basit üretim prosedürleri ile hazırlanır. İtalya'nın AUSL-IRCCS di Reggio Emilia kentindeki transfüzyon tıbbı ünitesinde PRP-L, trombosit-aferez bağışından elde edilir. Bu ürün başlangıçta% 0.9 NaCl'de 0.3 x 10 9 trombosit / mL'ye (ortalama 1 x 10⁹ trombosit / mL konsantrasyonundan başlayarak) seyreltilir. Seyreltilmiş trombositler dondurulur / çözülür ve daha sonra kalıntıları gidermek için santrifüj edilir. Son hacim 1.45 mL alikotlara bölünür ve -80 ° C'de saklanır. Hastalara dağıtılmadan önce, göz damlaları sterilite açısından test edilir. Hastalar trombosit lizatlarını 1 aya kadar -15 ° C'de saklayabilirler. Büyüme faktörü bileşimi rastgele seçilmiş alikotlardan da değerlendirilir ve ortalama değerler burada bildirilir.

Giriş

Kan türevi ürünler yara bakımı¹, maksillofasiyal ve ortopedik cerrahide ve kuru göz hastalığı (DED)³ gibi farklı oküler yüzey hastalıklarının² tedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. DED'de, gözyaşı filmi homeostazı, gözyaşı üretimi ve oküler yüzey bütünlüğünde rol oynayan farklı faktörlerin anormal işleyişinin bir sonucu olarak bozulur ^4,5.

DED, nedenler ve şiddet 6,7,8'de heterojenlik ile karakterizedir ve yaşlanma, cinsiyet⁹, kontakt lensler, topikal veya sistemik ilaçlar 10 veya Sjögren^{sendromu 10} gibi önceden var olan durumlar gibi farklı faktörlerin bir sonucu olabilir. Hafif semptomlara sahip olmasına rağmen, DED dünya çapında milyonlarca insanı etkileyerek yaşam kalitelerini ve sağlık sistemlerini de etkilemektedir⁶.

Bu patoloji için birçok tedavi bildirilmiştir, ancak en etkili çözüm¹² üzerinde hala bir fikir birliği yoktur. Bugüne kadar, yapay gözyaşları, gözyaşı filminin sulu bileşimini restore etmeyi amaçlayan ilk tedavi hattıdır, ancak bu ikameler, doğal gözyaşlarının ana biyolojik olarak aktif solutlarını içermez ^6,11. Trombosit bazlı ürünler suni gözyaşlarına^12,13 oranında geçerli bir alternatif olarak kabul edilir^, ancak klinik etkinlikleri, kullanım önerileri ve preparat yöntemleri hala tartışma konusudur³.

Kan bazlı ürünler, metabolitler¹⁴, proteinler, lipitler, vitaminler, iyonlar, büyüme faktörleri (GF'ler), antioksidan bileşikler¹¹ ve ozmolarite (300 mOsm / L) ¹¹ açısından gözyaşları ile benzer bir bileşimi paylaşır. Bileşenlerinin sinerjik aktivitesi sayesinde, kornea epitelinin yenilenmesini teşvik eder, enflamatuar sitokinlerin salınımını inhibe eder ve kadeh hücrelerinin sayısını ve konjonktiva ^2,3'teki müsinlerin ekspresyonunu arttırır.

Şimdiye kadar, oftalmik kan bazlı ürünlerdeki heterojenlik literatürde belgelenmiştir; Bu ürünler kan bağışçılarının kökenine, yani otolog veya allojenik olana ve ayrıca kan kaynağına, yani periferik kan, kordon kanı, serum veya trombositlere göre sınıflandırılabilir.

Otolog ürünler en yaygın³ olmasına rağmen, allojenik ürünler artık tercih edilen seçenek haline gelmektedir, çünkü daha yüksek etkinlik ve güvenlik standartları 15 ve maliyetlerde önemli bir azalma sağlamaktadır^16,17. Önceki çalışmalar, otoimmün ve / veya sistemik hastalıkları olan hastalardan elde edilen kan bazlı ürünlerin değişmiş kalite ve işlevsellik gösterebileceğini kanıtlamıştır 6,16,17. Serum bazlı göz damlalarının en yaygın olmasına rağmen, trombosit bazlı ürünler son zamanlarda geçerli bir alternatif olarak onaylanmaktadır, çünkü önemli etkinlik seviyelerini korurken kolayca hazırlanabilirler ^3,11. Şu anda mevcut trombosit bazlı ürünler, trombositten zengin plazma (PRP), trombositten zengin plazma lizatı (PRP-L) ve büyüme faktörleri bakımından zengin plazma (PRGF)³ olarak ayrılabilir.

Bunlar arasında PRP-L, uzun ömürlü dondurulmuş bir ürün olma avantajına sahiptir. PRP-L, aferez, kabarık paltolar ve hatta süresi dolan trombositlerden (PLT'ler)^18,19 hazırlanabilir ve bu da israflarını değerli bir şekilde azaltır. Alikotlar, -80 ° C'de kan transfüzyon merkezlerinde veya hatta hastaların evlerinde -15 ° C'de daha kısa süreler için aylarca saklanabilir.

PRP-L, göz yüzeyi rejenerasyonunu uyardığı kanıtlanmış GF'lerde oldukça zenginleştirilmiştir^12,20,21. Bununla birlikte, bu alanda bildirilen çok az sayıda klinik çalışma vardır ve hepsinde otolog kaynaklar^{kullanılmıştır 3,22}. PRP-L, göz yüzeyi hastalıklarının tedavisinde rutin olarak kullanılmadan önce hala daha fazla doğrulama ve karakterizasyona ihtiyaç duymaktadır, çünkü hazırlanması, dağıtılması ve depolanması için standartlaştırılmış bir kılavuz yoktur³.

Burada, İtalya'nın AUSL-IRCCS di Reggio Emilia kentindeki Transfüzyon Tıbbı Ünitesinde kullanılan PRP-L'nin üretimi ve DED'li hastalara dağıtılması için ayrıntılı bir protokol paylaşılmaktadır. Bilimsel topluluğun, dünya çapındaki çalışmalarda ve klinik yaklaşımlarda homojenliği ve tutarlılığı artırabilecek standart hazırlama yöntemleri geliştirmesine yardımcı olmayı amaçlıyoruz.

Protokol

Büyüme faktörlerinin nicel değerlendirmesi için kullanılan PRP-L, AUSL-IRCCS di Reggio Emilia'da yürütülen ve 10 Ocak 2019 tarihinde Vasta Emilia Nord Etik Komitesi tarafından onaylanan PRP ürünlerinin rejeneratif amaçlar için karakterizasyonu üzerine daha geniş bir çalışmada toplanmıştır (protokol numarası 2019/0003319). Bağışçılar, Helsinki Deklarasyonu'na göre bilgilendirilmiş onaylarını verdiler. Klinisyenler tarafından kuru göz sendromu semptomlarını izlemek için rutin olarak kullanılan Oküler Yüzey Hastalığı İndeksi (OSDI) anketinin toplu, anonim verilerinin toplanması için etik onay gerekli değildi. Şekil 1A , izlenen protokolün bir taslağını gösterirken, Şekil 1B'deki resimler prosedürün ana adımlarını göstermektedir.

1. Trombositten zengin plazma (PRP) toplama

1. PRP aferezi
   1. Bu protokol için, İtalyan yasalarına göre trombosit donörlerini seçin: trombosit donörleri, normal basınç ve kan sayımı parametreleri ve trombosit sayısı 180 x 10⁹ trombosit / L^23'ten az olmayan 18-65 yaşları arasında olmalıdır. Uygun donörler, bağıştan önceki 1 hafta içinde antiplatelet veya antikoagülan ilaçlar alamazlar.
   2. 1 birim tek donörlü trombositten zengin plazma (PRP) elde etmek için üreticilerin talimatlarına ve ulusal yasalara^{göre 23} numaralı otomatik bir kan toplama sistemi kullanarak plazma-trombosit-aferez gerçekleştirin. PRP'yi Adenin Sitrat Dekstroz Çözeltisi A (ACD-A) antikoagülan çözeltisinde toplayın.
      NOT: Trombosit-aferez sürekli bir prosedürle gerçekleştirilir; toplama süresi 40 dakika ile 90 dakika arasında değişmektedir. Donörlere verilen ACD miktarı ve prosedürlerin zamanı, hematokrit ve iğne göstergesi gibi donör özelliklerine bağlıdır.
2. PRP ünitelerinin özellikleri
   NOT: Aşağıdaki adım genellikle plazma-trombosit-aferez prosedürü sırasında otomatik kan toplama sistemi tarafından otomatik olarak gerçekleştirilir. Lütfen üreticinin kullanım kılavuzuna bakın.
   1. Aferez tarafından toplanan PRP ünitelerini, tüm depolama süresi boyunca pH > 6.4'ü korumak için gerekli olan minimum miktarda artık plazma ile yeterli miktarda koruyucu çözelti içinde, antikoagülan çözeltinin ortalama 180 mL'lik net nihai hacmine (yaklaşık 40 mL) kadar askıya alın.
      NOT: İtalyan yasalarına göre, kalite kontrolleri trombosit (PLT) sayısının en az 2.0 x 10 11 PLT / birim olduğunu, artık lökositlerin ise 1 x^{10 6} hücre/birimden az olması gerektiğini değerlendirmelidir.
   2. Lökodelenmiş ve ışınlanmış PRP'yi, daha fazla manipülasyon yapmadan önce bir trombosit çalkalayıcıda 22 °C ± 2 °C'de maksimum 5 gün saklayın²³.
3. PRP seyreltme
   1. PRP seyreltmeye başlamadan hemen önce, delici bir başak yoluyla ana torbadan toplanan numuneyi kullanarak hemositometre ile bir PLT sayımı yapın.
      NOT: Sterilitede sonraki adımları sınıf II biyolojik tehlike başlığı altında gerçekleştirin. İşlem sırasında kişisel koruma ekipmanı (laboratuvar önlüğü, eldiven ve gözlük) giyin.
   2. PRP'yi, periferik kandaki ortalama PLT konsantrasyonunu simüle eden 0.32 x 10⁹ ± 0.03 x 10 9 PLT/mL nihai konsantrasyona kadar yeterli miktarda steril%^0.9 NaCl ile seyreltin.
   3. Kan torbaları için delici bir ani artıştan yararlanarak, seyreltilmiş PRP'yi 300 mL boş toplama torbalarına bölerek net 190 mL/torba hacmine ulaşın.
   4. Olası mikrobiyal kontaminasyonları değerlendiren kalite kontrolleri yapmak için artık seyreltilmiş PRP'nin (genellikle 1 mL) bir aliquotunu kullanın. Bir mikrobiyoloji laboratuvarında üreticinin talimatlarını izleyerek bir sterilite testi yapın (bkz.
      NOT: Küçük hacimli kan örneklerinden aerobik mikroorganizmaların (esas olarak bakteri ve maya) kalitatif kültürünü ve geri kazanımını gerçekleştirebilen aerobik kan kültürlerine özgü kültür şişelerini kullanın.
   5. Seyreltilmiş PRP torbalarını çözülmeden önce en fazla 2 ay boyunca -80 ° C'de saklayın.

2. Trombositten zengin plazma lizat (PRP-L) preparatı

1. Çözdürme
   1. Çözme prosedürüne başlamadan önce, ılık bir banyonun 37 ° C'ye ayarlandığından emin olun. PRP torbalarını ılık banyoya koyun ve tamamen çözülene kadar bekleyin.
2. PRP-L koleksiyonu
   1. PRP torbalarını oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 3000 x g'de santrifüj yapın.
      NOT: Sonraki adımlar, sınıf II biyolojik tehlike başlığı altında sterilitede gerçekleştirilmelidir.
   2. Transfer torbasının delici çivisinden yararlanarak, santrifüjlü torbayı boş steril 300 mL transfer torbasına bağlayın. PRP-L süpernatını dikkatli bir şekilde, döküntülerden kaçınırken yeni torbaya aktarın. Mümkün olduğunda, bir torba presi kullanın.
   3. PRP-L ünitesinin bağlantı borusunu bir torba sızdırmazlık elemanı ile kapatın.
3. PRP-L aliquotetion
   NOT: 190 mL PRP içeren bir başlangıç ünitesi (bkz. adım 1.3.3.) iki göz damlası kitini doldurmak için yeterlidir (göz damlalarının kan bileşenlerinden uygulanması ve korunması için kullanılan spesifik tıbbi cihazlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız). Göz damlası kitleri, anti-bakteriyel filtreyi dışlamak için önceden bağlanmış şırınganın üzerine yerleştirilmiş tüm ip şişeleri ve stopcock'un merkezi oku sola dönük olarak sınıf II bir başlık altında açılmalıdır.
   1. Steril bir şırınga ile 30-60 mL PRP-L toplayın ve şırıngayı dolum hattındaki Luer/lock bağlantısına bağlayın.
   2. Üreticinin talimatlarına göre, PRP-L içeren şırınga ile önceden bağlanmış şırınga arasındaki çizgiyi açmak için stopcock'u bir dönüşün yarısı kadar çevirin. Önceden bağlanmış şırıngayı PRP-L ile doldurun.
   3. PRP-L şırıngasının bağlantısını kesin, luer/lock bağlantısının tüp kapağını kapatın ve stopcock'u orijinal konumuna döndürün. Şişeleri PRP-L ile doldurmak için göz damlası kiti şırıngasını kullanın.
   4. 2.3.1.-2.3.3 arasındaki adımları izleyin. tüm aplikatör şişeleri dolana kadar. Her aplikatörün uygun şekilde doldurulduğundan emin olun, ardından bunları ayrı ayrı bir torba kapatıcı ile kapatın.
   5. Prosedürü yeni bir göz damlası kiti ile tekrarlayın.
   6. Olası mikrobiyal kontaminasyonu değerlendirmek için küçük bir artık seyreltilmiş PRP-L aliquot kullanın (bkz. adım 1.3.4.).
      NOT: Sıvı yanlışlıkla ipin sonundaki anti-bakteriyel filtreye ulaşırsa, emme şırıngası dirence karşı çıkabilir ve dolguyu engelleyebilir. Doldurma döngüsüne devam etmek için, dizenin sonundaki anti-bakteriyel hidrofobik filtreden yaklaşık 5/6 alikot için dizenin uç bölümünü kaldırın. Bu pozisyonda, zaten hava ile doldurulmuş yeni bir steril şırınga (30 mL hacimli) kullanın. Anti-bakteriyel filtrenin dişi luer'ini / kilidini bağlayın ve kan bileşeninin tüm kalıntılarını gidermek ve anti-bakteriyel filtrenin zarını sıvıdan arındırmak için şırınganın pistonuna sert ve tekrar tekrar bastırın. Şırıngayı çıkarın ve kalan şişeleri doldurun.
4. PRP-L depolama
   1. Her aplikatörü uygun şekilde etiketleyin ve plastik bir torbaya koyun. Plastik torbayı da etiketleyin, donörün kan grubunu vurgulamaya özen gösterin.
   2. İtalyan yasaları^{23 ve kılavuz} 24'e göre, hasta atanmasından en fazla 24 ay önce −80 ° C'de saklayın.

3. PRP-L dağıtımı

1. Hasta atamasını tercihen PRP-L kan grubunu eşleştirerek gerçekleştirin. PRP-L aplikatör şişelerini serin bir kutu kullanarak teslim edin ve her aplikatör şişesinin yaklaşık 45 damlaya karşılık gelen 1,45 mL PRP-L içerdiğinden emin olun. Hastaya, aplikatör şişelerinin hastaların evlerinde -15 ° C'de 1 aya kadar saklanabileceğini söyleyin.

Sonuçlar

Serum kaynaklı göz damlalarının (göz yüzeyi hastalıklarının tedavisinde en sık kullanılan kan bazlı üründür) kullanımının mantığı, neredeyse tamamen dolaşımdaki trombositlerden elde edilen GF'lerin içeriğinde yatmaktadır. PRP, periferik kan serumuna kıyasla 0.15 x 10 9-0.45 x 10^{9 PLT} / mL arasında değişen anlamlı derecede daha fazla trombosit (ve sonuç olarak trombosit kaynaklı GF'ler) içerir. İtalyan yasalarına göre, PRP ünitelerindeki trombosit sayısı en az ...

Tartışmalar

Son yıllarda, trombosit bazlı ürünlerin oküler yüzey patolojileri için klinik kullanımı artmıştır, ancak bilimsel sağlamlık eksikliği nedeniyle difüzyonları engellenmektedir. Bunun temel nedeni, donör kaynaklarındaki ve hazırlama protokollerindeki geniş heterojenliktir, bunlar genellikle tam olarak açıklanmayan veya dağıtıldıkları amaç için özel olarak tasarlanmamıştır. Özellikle aferez tarafından toplanan trombosit bazlı ürünler hakkında bilgi halen eksiktir. Bu nedenle bu çalı?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
CompoSeal Mobilea II	Fresenius Kabi, Germany		bag sealer
HeraSafe hood	Heraeus Instruments, Germany		Class II biohazard hood
MCS+ 9000 Mobile Platelet Collection System	Haemonetics, Italy		automated plasma and multicomponent collection equipment for donating platelet, red cell, plasma, or combination blood components
Platelet shaker, PF396i	Helmer, USA		Platelet shaker
Raycell X-ray Blood Irradiator	MDS Nordion, Canada		X-ray Blood Irradiator
ROTIXA 50RS	Hettich Zentrifugen, Germany		High speed entrifuge
Sysmex XS-1000i	Sysmex Europe GMBH, Germany		haemocytometer for platelet count
Warm bath, WB-M15	Falc Instruments, Italy		Warm bath
Materials
ACD-A anticoagulant solution A	Fenwal Inc., USA	DIN 00788139	anticoagulant solution for platelet apheresis (1000 ml)
BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials	BD Biosciences, USA	BD 442020	Sterility assay
BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials	BD Biosciences, USA	442020	At least 2 vials for sterility assay
BD Luer Lok Syringe	BD Plastipack, USA	300865	At least 4 sterile syringes (50 ml)
Bio-Plex Human Cancer Panel 1	BioRad Laboratories, USA	171AC500M	Standard panel for PDGF isoforms assessment
Bio-Plex Human Cancer Panel 2	BioRad Laboratories, USA	171AC600M	Standard panel for EGF assessment
Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader	BioRad Laboratories, USA	Magpix	This instrument allows multiple immunoassays using functionalized magnetic beads.
Bio-Plex Pro TGF-b Assay	BioRad Laboratories, USA	10024984	Set and standards for TGFb isoforms assessment
BioRet	ARIES s.r.l., Italy	A2DH0020	At least 4 piercing spike for blood bags
Blood collection tube	BD Vacutainer, USA	367835	1 tube, necessary to perform platelet counts
Eye drops kit. COL Medical Device for the application and preservation of eye drops from haemocomponents	Biomed Device s.r.l., Italy	COLC50	Eye drops kit. At least 2 kits for each PRP unit collected
Human Cancer PDGF-AB/BB Set 1x96well	BioRad Laboratories, USA	171BC511	Set for PDGF isoforms assessment
Human Cancer2 EGF Set 1x96well	BioRad Laboratories, USA	171BC603M	Set for EGF assessment
NaCl 0.9% sterile solution	Baxter S.p.A., Italy	B05BB01	1000 ml
OSDI Questionnaire	Allergan Inc., USA	OSDI	Ocular Surface Disease Index Questionnaire
Piercing spike	BioRet ARIES s.r.l., Italy	BS051004	Spike
Platelet Additive Solution A+ T-PAS+	TERUMO BCT Inc., Italy	40842	preservative solution for platelet concentrates (1000 ml)
Software Excel	Microsoft, USA	Excel	Data analysis software
Teruflex Transfer bag 1000 ml	TERUMO BCT Inc., Italy	BB*T100BM	1 for PRP dilution
Teruflex Transfer bag 300 ml	TERUMO BCT Inc., Italy	BB*030CM	At least 6 for each PRP unit collected