Lysat plasmatique riche en plaquettes pour le traitement des maladies de la surface oculaire

Résumé

Les lysats plaquettaires représentent un outil émergent pour le traitement des maladies de la surface oculaire. Ici, nous proposons une méthode pour la préparation, la distribution, le stockage et la caractérisation du lysat plaquettaire prélevé sur des donneurs de plaquettes.

Résumé

Diverses maladies de la surface oculaire sont traitées avec des gouttes oculaires dérivées du sang. Leur utilisation a été introduite dans la pratique clinique en raison de leur teneur en métabolites et en facteurs de croissance, ce qui favorise la régénération de la surface oculaire. Les gouttes ophtalmiques à base de sang peuvent être préparées à partir de différentes sources (c.-à-d. don de sang total ou d’aphérèse plaquettaire), ainsi qu’avec différents protocoles (p. ex. différentes dilutions et cycles de congélation et de décongélation). Cette variabilité entrave la standardisation des protocoles cliniques et, par conséquent, l’évaluation de leur efficacité clinique. Le détail et le partage des procédures méthodologiques peuvent contribuer à la définition de lignes directrices communes. Au cours des dernières années, les produits allogéniques se sont diffusés comme alternative aux traitements autologues car ils garantissent des normes d’efficacité plus élevées; parmi eux, les gouttes ophtalmiques au lysat plasma riche en plaquettes (PRP-L) sont préparées selon des procédures de fabrication simples. Dans l’unité de médecine transfusionnelle de l’AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, en Italie, le PRP-L est obtenu par don d’aphérèse plaquettaire. Ce produit est initialement dilué à 0,3 x 10 9 plaquettes/mL (à partir d’une concentration moyenne de 1 x 10 9 plaquettes/mL) dans^0,9% de NaCl. Les plaquettes diluées sont congelées/décongelées et, par la suite, centrifugées pour éliminer les débris. Le volume final est divisé en aliquotes de 1,45 mL et stocké à −80 °C. Avant d’être délivrés aux patients, les gouttes oculaires sont testées pour la stérilité. Les patients peuvent conserver les lysats plaquettaires à -15 °C jusqu’à 1 mois. La composition du facteur de croissance est également évaluée à partir d’aliquotes choisies au hasard, et les valeurs moyennes sont rapportées ici.

Introduction

Les produits dérivés du sang sont largement utilisés dans le soin des plaies¹, la chirurgie maxillo-faciale et orthopédique et pour le traitement de différentes maladies de la surface oculaire² telles que la sécheresse oculaire (DED)³. Dans la DED, l’homéostasie du film lacrymal est altérée en raison du fonctionnement anormal de différents facteurs impliqués dans la production de larmes et l’intégrité de la surface oculaire ^4,5.

La DED est caractérisée par une hétérogénéité dans les causes et la gravité ^6,7,8 et peut être une conséquence de différents facteurs comme le vieillissement, le sexe⁹, les lentilles de contact, les médicaments topiques ou systémiques 10^, ou des conditions préexistantes comme le syndrome de Gougerot-Sjögren ¹⁰. Malgré des symptômes bénins, la DED affecte des millions de personnes dans le monde, ce qui a un impact sur leur qualité de vie et sur le système de santé⁶.

De nombreux traitements ont été rapportés pour cette pathologie, mais il n’y a toujours pas de consensus sur la solution la plus efficace¹². À ce jour, les larmes artificielles sont la première ligne de traitement visant à restaurer la composition aqueuse du film lacrymal, bien que ces substituts ne contiennent pas les principaux solutés biologiquement actifs des larmes naturelles ^6,11. Les produits à base de plaquettes sont considérés comme une alternative valable^12,13 aux larmes artificielles^, bien que leur efficacité clinique, leurs recommandations d’utilisation et leurs méthodes de préparation fassent encore l’objet de débats³.

Les produits sanguins partagent avec les larmes une composition similaire en termes de métabolites¹⁴, protéines, lipides, vitamines, ions, facteurs de croissance (GF), composés antioxydants 11 et osmolarité (300 mOsm/L)¹¹. Grâce à l’activité synergique de leurs composants, ils favorisent la régénération de l’épithélium cornéen, inhibent la libération de cytokines inflammatoires et augmentent le nombre de cellules caliciformes et l’expression des mucines dans la conjonctive ^2,3.

Jusqu’à présent, l’hétérogénéité des produits ophtalmiques à base de sang a été documentée dans la littérature; Ces produits peuvent être classés selon l’origine du donneur de sang, c’est-à-dire autologue ou allogénique, ainsi que la source de sang, c’est-à-dire le sang périphérique, le sang de cordon, le sérum ou les plaquettes.

Bien que les produits autologues aient été les plus répandus³, les produits allogéniques deviennent maintenant le choix préféré, car ils garantissent des normes d’efficacité et de sécurité plus élevées 15, ainsi qu’une réduction significative des coûts^16,17. Des études antérieures ont en effet prouvé que les produits sanguins obtenus à partir de patients atteints de maladies auto-immunes et/ou systémiques peuvent présenter une altération de la qualité et de la fonctionnalité 6,16,17. Malgré le fait que les gouttes ophtalmiques à base de sérum soient les plus répandues, les produits à base de plaquettes se sont récemment affirmés comme une alternative valable, car ils peuvent être facilement préparés tout en maintenant des niveaux d’efficacité^{significatifs 3,11}. Les produits à base de plaquettes actuellement disponibles peuvent être divisés en plasma riche en plaquettes (PRP), en lysat de plasma riche en plaquettes (PRP-L) et en plasma riche en facteurs de croissance (PRGF)³.

Parmi eux, le PRP-L a l’avantage d’être un produit surgelé longue conservation. Le PRP-L peut être préparé à partir d’aphérèse, de couches leucocytaires ou même de plaquettes expirant (PLT)^18,19, ce qui réduit précieusement leur gaspillage. Les aliquotes peuvent être conservées pendant des mois dans les centres de transfusion sanguine à -80 °C ou même au domicile des patients à -15 °C pendant des périodes plus courtes.

Les PRP-L sont hautement enrichis en GF, dont il a été prouvé qu’ils stimulent la régénération de la surface oculaire 12,20,21. Néanmoins, il n’y a que peu d’études cliniques rapportées dans ce domaine, et toutes ont utilisé des sources autologues ^3,22. Le PRP-L doit encore faire l’objet d’une validation et d’une caractérisation plus poussées avant de pouvoir être utilisé systématiquement pour le traitement des maladies de la surface oculaire, car il n’existe pas de lignes directrices normalisées pour sa préparation, sa distribution et son entreposage³.

Ici, un protocole détaillé est partagé pour la production de PRP-L utilisé à l’unité de médecine transfusionnelle de l’AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, en Italie, et la dispensation aux patients atteints de DED. Notre objectif est d’aider la communauté scientifique à développer des méthodes de préparation standard, qui peuvent augmenter l’homogénéité et la cohérence des études et des approches cliniques mondiales.

Protocole

Le PRP-L utilisé pour l’évaluation quantitative des facteurs de croissance a été recueilli dans le cadre d’une étude plus large sur la caractérisation des produits PRP à des fins régénératives, réalisée à l’AUSL-IRCCS di Reggio Emilia et approuvée par le comité d’éthique Area Vasta Emilia Nord le 10 janvier 2019 (protocole numéro 2019/0003319). Les donateurs ont donné leur consentement éclairé conformément à la Déclaration d’Helsinki. Aucune approbation éthique n’était nécessaire pour recueillir les données agrégées et anonymes du questionnaire sur l’indice des maladies de la surface oculaire (IDSO), qui est couramment utilisé par les cliniciens pour surveiller les symptômes du syndrome de l’œil sec. La figure 1A montre un aperçu du protocole suivi, tandis que les images de la figure 1B illustrent les principales étapes de la procédure.

1. Collecte de plasma riche en plaquettes (PRP)

1. Aphérèse PRP
   1. Pour ce protocole, sélectionnez les donneurs de plaquettes conformément aux lois italiennes: les donneurs de plaquettes doivent être âgés de 18 à 65 ans, avec des paramètres normaux de pression et de numération globulaire et une numération plaquettaire d’au moins 180 x 10⁹ plaquettes / L²³. Les donneurs admissibles ne peuvent pas prendre d’antiplaquettaires ou d’anticoagulants dans la semaine précédant le don.
   2. Effectuer plasma-plaquettes-aphérèse à l’aide d’un système automatisé de prélèvement sanguin, conformément aux instructions des fabricants et aux lois nationales²³, pour obtenir 1 unité de plasma riche en plaquettes (PRP) à donneur unique. Recueillir le PRP dans la solution anticoagulante de citrate d’adénine Dextrose Solution A (ACD-A).
      NOTE: L’aphérèse plaquettaire est réalisée avec une procédure continue; Le temps de collecte est compris entre 40 min et 90 min. La quantité de DCA administrée aux donneurs et la durée des interventions dépendent des caractéristiques du donneur, p. ex. hématocrite et jauge d’aiguille.
2. Caractéristiques des unités PRP
   REMARQUE: L’étape suivante est généralement effectuée automatiquement par le système automatisé de prélèvement sanguin pendant la procédure plasma-plaquet-aphérèse. Veuillez consulter le manuel d’instructions du fabricant.
   1. Resuspendre les unités PRP recueillies par aphérèse dans une quantité adéquate de solution de conservation avec la quantité minimale de plasma résiduel, nécessaire pour maintenir un pH > 6,4 pendant toute la durée de stockage, jusqu’à un volume final moyen de 180 mL net de la solution anticoagulante (environ 40 mL).
      NOTE: Selon la loi italienne, les contrôles de qualité doivent évaluer que la numération plaquettaire (PLT) est d’au moins 2,0 x 10¹¹ PLT / unité, tandis que les leucocytes résiduels doivent être inférieurs à 1 x 10⁶ cellules / unité.
   2. Conserver le PRP leucodéplé et irradié pendant 5 jours au maximum à 22 °C ± 2 °C sur un agitateur plaquettaire avant toute nouvelle manipulation²³.
3. Dilution du PRP
   1. Immédiatement avant de commencer la dilution du PRP, effectuer une numération PLT avec un hémocytomètre en utilisant l’échantillon prélevé dans le sac principal à travers une pointe perforante.
      NOTE: Effectuer les étapes suivantes de la stérilité sous une cagoule de classe II pour les risques biologiques. Portez un équipement de protection individuelle (blouse de laboratoire, gants et lunettes de protection) pendant la procédure.
   2. Diluer le PRP avec une quantité adéquate de NaCl stérile à 0,9 % jusqu’à une concentration finale de 0,32 x 10 9^± 0,03 x 10⁹ PLT/mL, ce qui simule la concentration moyenne de PLT dans le sang périphérique.
   3. Profitant d’un pic perçant pour les poches de sang, divisez le PRP dilué en sacs de collecte vides de 300 ml pour atteindre un volume net de 190 mL/sac.
   4. Utiliser une partie aliquote de PRP dilué résiduel (habituellement 1 mL) pour effectuer des contrôles de qualité évaluant les contaminations microbiennes possibles. Effectuer un essai de stérilité en suivant les instructions du fabricant dans un laboratoire de microbiologie (voir le tableau des matériaux).
      REMARQUE : Utilisez des flacons de culture spécifiques aux hémocultures aérobies, qui sont capables d’effectuer la culture qualitative et la récupération de micro-organismes aérobies (principalement des bactéries et des levures) à partir d’échantillons de sang de petit volume.
   5. Conservez les sacs de PRP dilués à −80 °C pendant un maximum de 2 mois avant la décongélation.

2. Préparation de lysat plasmatique riche en plaquettes (PRP-L)

1. Décongélation
   1. Avant de commencer la procédure de décongélation, assurez-vous qu’un bain chaud est réglé à 37 °C. Mettez les sacs PRP dans le bain chaud et attendez jusqu’à ce qu’ils soient complètement décongelés.
2. Collecte PRP-L
   1. Centrifuger les sacs PRP à 3000 x g pendant 30 min à température ambiante.
      NOTE: Les étapes suivantes doivent être effectuées en stérilité sous une hotte de classe II pour risque biologique.
   2. En exploitant la pointe perforante du sac de transfert, connectez le sac centrifugé avec un sac de transfert stérile vide de 300 mL. Transférez soigneusement le surnageant PRP-L, tout en évitant les débris, dans le nouveau sac. Dans la mesure du possible, utilisez une presse à sac.
   3. Scellez le tube de connexion de l’unité PRP-L avec un scellant à sacs.
3. PRP-L aliquote
   REMARQUE : Une unité de départ contenant 190 ml de PRP (voir l’étape 1.3.3.) est suffisante pour remplir deux trousses de gouttes ophtalmiques (pour plus de détails sur les dispositifs médicaux spécifiques utilisés pour l’application et la conservation des gouttes ophtalmiques à partir de composants sanguins, voir le tableau des matériaux). Les trousses de gouttes ophtalmiques doivent être ouvertes sous une hotte de classe II avec les flacons entiers placés au-dessus de la seringue préconnectée et la flèche centrale du robinet d’arrêt pointant vers la gauche pour exclure le filtre antibactérien.
   1. Prélever 30 à 60 ml de PRP-L avec une seringue stérile et relier la seringue au raccord Luer/lock sur la ligne de remplissage.
   2. Selon les instructions du fabricant, tournez le robinet d’arrêt d’un demi-tour pour ouvrir la ligne entre la seringue contenant du PRP-L et la seringue préconnectée. Remplissez la seringue préconnectée avec du PRP-L.
   3. Débranchez la seringue PRP-L, fermez le capuchon du tube de la connexion luer/lock et faites pivoter le robinet d’arrêt dans sa position d’origine. Utilisez la seringue du kit de gouttes ophtalmiques pour remplir les flacons de PRP-L.
   4. Répétez la procédure des étapes 2.3.1.-2.3.3. jusqu’à ce que tous les flacons applicateurs soient remplis. Assurez-vous que chaque applicateur est correctement rempli, puis scellez-les individuellement avec un scellant à sacs.
   5. Répétez la procédure avec un nouveau kit de gouttes ophtalmiques.
   6. Utiliser une petite partie aliquote de PRP-L dilué résiduel pour évaluer la contamination microbienne possible (voir étape 1.3.4.).
      REMARQUE: Si le liquide atteint accidentellement le filtre antibactérien à l’extrémité de la chaîne, la seringue d’aspiration peut s’opposer à la résistance, entravant le remplissage. Pour continuer le cycle de remplissage, soulevez la section d’extrémité de la ficelle pour environ 5/6 aliquotes du filtre hydrophobe antibactérien à l’extrémité de la ficelle. Dans cette position, utilisez une nouvelle seringue stérile (d’un volume de 30 mL) qui a déjà été remplie d’air. Connectez le luer/lock femelle du filtre antibactérien et appuyez fort et à plusieurs reprises sur le piston de la seringue pour éliminer tous les résidus de composants sanguins et libérer la membrane du filtre antibactérien du liquide. Retirez la seringue et remplissez les flacons restants.
4. Stockage PRP-L
   1. Étiquetez correctement chaque applicateur et mettez-les dans un sac en plastique. Étiquetez également le sac en plastique, en prenant soin de mettre en évidence le groupe sanguin du donneur.
   2. Conserver à −80 °C pendant un maximum de 24 mois avant l’affectation du patient, conformément à la loi italienne²³ et aux directives²⁴.

3. Dispense de PRP-L

1. Effectuer l’assignation du patient de préférence en faisant correspondre le groupe sanguin PRP-L. Livrer les flacons applicateurs de PRP-L à l’aide d’une glacière et s’assurer que chaque flacon d’applicateur contient 1,45 mL de PRP-L, ce qui correspond à environ 45 gouttes. Informez le patient que les flacons applicateurs peuvent être conservés au domicile du patient jusqu’à 1 mois à -15 °C.

Résultats

La raison d’être de l’utilisation de gouttes ophtalmiques dérivées du sérum (qui est le produit sanguin le plus fréquemment utilisé pour le traitement des maladies de la surface oculaire) réside dans leur teneur en GF, qui sont presque entièrement dérivés des plaquettes circulantes. Le PRP contient un nombre significativement plus élevé de plaquettes (et, par conséquent, de GF dérivés des plaquettes) par rapport au sérum sanguin périphérique, allant de 0,15 x 10 9-0,45 x 10⁹ PLT/mL.^<...

Discussion

Ces dernières années, l’utilisation clinique de produits à base de plaquettes pour les pathologies de surface oculaire a augmenté, mais leur diffusion est entravée par le manque de robustesse scientifique. Cela est principalement dû à la grande hétérogénéité des sources de donneurs et des protocoles de préparation, qui ne sont souvent pas entièrement divulgués ou ne sont pas spécifiquement conçus aux fins pour lesquelles ils sont dispensés. En particulier, les informations sur les produits à base de ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
CompoSeal Mobilea II	Fresenius Kabi, Germany		bag sealer
HeraSafe hood	Heraeus Instruments, Germany		Class II biohazard hood
MCS+ 9000 Mobile Platelet Collection System	Haemonetics, Italy		automated plasma and multicomponent collection equipment for donating platelet, red cell, plasma, or combination blood components
Platelet shaker, PF396i	Helmer, USA		Platelet shaker
Raycell X-ray Blood Irradiator	MDS Nordion, Canada		X-ray Blood Irradiator
ROTIXA 50RS	Hettich Zentrifugen, Germany		High speed entrifuge
Sysmex XS-1000i	Sysmex Europe GMBH, Germany		haemocytometer for platelet count
Warm bath, WB-M15	Falc Instruments, Italy		Warm bath
Materials
ACD-A anticoagulant solution A	Fenwal Inc., USA	DIN 00788139	anticoagulant solution for platelet apheresis (1000 ml)
BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials	BD Biosciences, USA	BD 442020	Sterility assay
BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials	BD Biosciences, USA	442020	At least 2 vials for sterility assay
BD Luer Lok Syringe	BD Plastipack, USA	300865	At least 4 sterile syringes (50 ml)
Bio-Plex Human Cancer Panel 1	BioRad Laboratories, USA	171AC500M	Standard panel for PDGF isoforms assessment
Bio-Plex Human Cancer Panel 2	BioRad Laboratories, USA	171AC600M	Standard panel for EGF assessment
Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader	BioRad Laboratories, USA	Magpix	This instrument allows multiple immunoassays using functionalized magnetic beads.
Bio-Plex Pro TGF-b Assay	BioRad Laboratories, USA	10024984	Set and standards for TGFb isoforms assessment
BioRet	ARIES s.r.l., Italy	A2DH0020	At least 4 piercing spike for blood bags
Blood collection tube	BD Vacutainer, USA	367835	1 tube, necessary to perform platelet counts
Eye drops kit. COL Medical Device for the application and preservation of eye drops from haemocomponents	Biomed Device s.r.l., Italy	COLC50	Eye drops kit. At least 2 kits for each PRP unit collected
Human Cancer PDGF-AB/BB Set 1x96well	BioRad Laboratories, USA	171BC511	Set for PDGF isoforms assessment
Human Cancer2 EGF Set 1x96well	BioRad Laboratories, USA	171BC603M	Set for EGF assessment
NaCl 0.9% sterile solution	Baxter S.p.A., Italy	B05BB01	1000 ml
OSDI Questionnaire	Allergan Inc., USA	OSDI	Ocular Surface Disease Index Questionnaire
Piercing spike	BioRet ARIES s.r.l., Italy	BS051004	Spike
Platelet Additive Solution A+ T-PAS+	TERUMO BCT Inc., Italy	40842	preservative solution for platelet concentrates (1000 ml)
Software Excel	Microsoft, USA	Excel	Data analysis software
Teruflex Transfer bag 1000 ml	TERUMO BCT Inc., Italy	BB*T100BM	1 for PRP dilution
Teruflex Transfer bag 300 ml	TERUMO BCT Inc., Italy	BB*030CM	At least 6 for each PRP unit collected