Lisato plasmatico ricco di piastrine per il trattamento delle malattie della superficie oculare

Riepilogo

I lisati piastrinici rappresentano uno strumento emergente per il trattamento delle malattie della superficie oculare. Qui, proponiamo un metodo per la preparazione, la dispensazione, la conservazione e la caratterizzazione del lisato piastrinico raccolto da donatori di piastrine.

Abstract

Varie malattie della superficie oculare sono trattate con colliri derivati dal sangue. Il loro uso è stato introdotto nella pratica clinica a causa del loro contenuto di metaboliti e fattori di crescita, che promuove la rigenerazione della superficie oculare. I colliri a base di sangue possono essere preparati da diverse fonti (ad esempio, donazione di sangue intero o aferesi piastrinica), nonché con protocolli diversi (ad esempio, diverse diluizioni e cicli di congelamento / scongelamento). Questa variabilità ostacola la standardizzazione dei protocolli clinici e, di conseguenza, la valutazione della loro efficacia clinica. La definizione dettagliata e la condivisione delle procedure metodologiche possono contribuire alla definizione di orientamenti comuni. Negli ultimi anni si sono diffusi i prodotti allogenici come alternativa ai trattamenti autologhi in quanto garantiscono standard di efficacia più elevati; tra questi, i colliri a lisato plasmatico ricco di piastrine (PRP-L) sono preparati con semplici procedure di produzione. Nell'unità di medicina trasfusionale dell'AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, Italia, il PRP-L è ottenuto dalla donazione di aferesi piastrinica. Questo prodotto viene inizialmente diluito a 0,3 x 10 9 piastrine/ml (a partire da una concentrazione media di 1 x 10 9 piastrine/ml) in^0,9% NaCl. Le piastrine diluite vengono congelate/scongelate e, successivamente, centrifugate per eliminare i detriti. Il volume finale viene suddiviso in aliquote da 1,45 ml e conservato a -80 °C. Prima di essere dispensato ai pazienti, i colliri vengono testati per la sterilità. I pazienti possono conservare lisati piastrinici a -15 °C fino a 1 mese. Anche la composizione del fattore di crescita è valutata da aliquote selezionate casualmente e i valori medi sono riportati qui.

Introduzione

I prodotti derivati dal sangue sono ampiamente utilizzati nella cura delle ferite¹, nella chirurgia maxillo-facciale e ortopedica e per il trattamento di diverse malattie della superficie oculare² come la malattia dell'occhio secco (DED)³. Nella DED, l'omeostasi del film lacrimale è compromessa come conseguenza del funzionamento anomalo di diversi fattori coinvolti nella produzione lacrimale e nell'integrità della superficie oculare ^4,5.

La DED è caratterizzata da eterogeneità nelle cause e nella gravità ^6,7,8 e può essere una conseguenza di diversi fattori come l'invecchiamento, il sesso 9, le lenti a contatto^, i farmaci topici o sistemici 10 o condizioni preesistenti come la sindrome di Sjögren ¹⁰. Nonostante abbia sintomi lievi, la DED colpisce milioni di persone in tutto il mondo, influenzando anche la loro qualità della vita e il sistema sanitario⁶.

Sono stati riportati molti trattamenti per questa patologia, ma non c'è ancora consenso sulla soluzione più efficace¹². Ad oggi, le lacrime artificiali sono la prima linea di terapia volta a ripristinare la composizione acquosa del film lacrimale, sebbene questi sostituti non contengano i principali soluti biologicamente attivi delle lacrime naturali ^6,11. I prodotti a base piastrinica sono considerati una valida alternativa^12,13 alle lacrime artificiali^, sebbene la loro efficacia clinica, le raccomandazioni per l'uso e i metodi di preparazione siano ancora oggetto di dibattito³.

I prodotti a base di sangue condividono con le lacrime una composizione simile in termini di metaboliti¹⁴, proteine, lipidi, vitamine, ioni, fattori di crescita (GF), composti antiossidanti 11 e osmolarità (300 mOsm/L)¹¹. Attraverso l'attività sinergica dei loro componenti, promuovono la rigenerazione dell'epitelio corneale, inibiscono il rilascio di citochine infiammatorie e aumentano il numero di cellule caliciformi e l'espressione di mucine nella congiuntiva ^2,3.

Finora, l'eterogeneità nei prodotti oftalmici a base di sangue è stata documentata in letteratura; Questi prodotti possono essere classificati in base all'origine dei donatori di sangue, cioè autologhi o allogenici, nonché alla fonte di sangue, cioè sangue periferico, sangue del cordone ombelicale, siero o piastrine.

Sebbene i prodotti autologhi fossero i più diffusi³, quelli allogenici stanno diventando la scelta preferita, poiché garantiscono standard di efficacia e sicurezza più elevati 15, insieme a una significativa riduzione dei costi^16,17. Studi precedenti, infatti, hanno dimostrato che i prodotti a base di sangue ottenuti da pazienti con malattie autoimmuni e/o sistemiche possono mostrare qualità e funzionalità alterate 6,16,17. Nonostante i colliri a base sierica siano i più diffusi, i prodotti a base piastrinica si stanno recentemente affermando come una valida alternativa, in quanto possono essere facilmente preparati mantenendo livelli significativi di efficacia ^3,11. I prodotti a base piastrinica attualmente disponibili possono essere suddivisi in plasma ricco di piastrine (PRP), lisato plasmatico ricco di piastrine (PRP-L) e plasma ricco di fattori di crescita (PRGF)³.

Tra questi, PRP-L ha il vantaggio di essere un prodotto congelato a lunga conservazione. Il PRP-L può essere preparato da aferesi, buffy-coat, o anche da piastrine in scadenza (PLT)^18,19, riducendo preziosamente il loro spreco. Le aliquote possono essere conservate per mesi nei centri trasfusionali a -80 °C o anche a casa dei pazienti a -15 °C per periodi più brevi.

I PRP-L sono altamente arricchiti in GF, che hanno dimostrato di stimolare la rigenerazione della superficie oculare 12,20,21. Tuttavia, ci sono solo pochi studi clinici segnalati in questo settore, e tutti hanno utilizzato fonti autologhe ^3,22. PRP-L ha ancora bisogno di ulteriore convalida e caratterizzazione prima che possa essere utilizzato di routine per il trattamento delle malattie della superficie oculare, poiché non esistono linee guida standardizzate per la sua preparazione, dispensazione e conservazione³.

Qui viene condiviso un protocollo dettagliato per la produzione di PRP-L utilizzato presso l'Unità di Medicina Trasfusionale dell'AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, Italia, e la dispensazione ai pazienti con DED. Miriamo ad aiutare la comunità scientifica a sviluppare metodi standard di preparazione, che possono aumentare l'omogeneità e la coerenza negli studi e negli approcci clinici in tutto il mondo.

Protocollo

I PRP-L utilizzati per la valutazione quantitativa dei fattori di crescita sono stati raccolti nell'ambito di uno studio più ampio sulla caratterizzazione dei prodotti PRP a scopo rigenerativo, condotto presso l'AUSL-IRCCS di Reggio Emilia e approvato dal Comitato Etico Area Vasta Emilia Nord il 10 gennaio 2019 (protocollo numero 2019/0003319). I donatori hanno dato il loro consenso informato secondo la Dichiarazione di Helsinki. Non è stata necessaria alcuna approvazione etica per raccogliere i dati aggregati e anonimi del questionario OSDI (Ocular Surface Disease Index), che viene abitualmente utilizzato dai medici per monitorare i sintomi della sindrome dell'occhio secco. La Figura 1A mostra una struttura del protocollo seguito, mentre le immagini nella Figura 1B illustrano i passaggi principali della procedura.

1. Raccolta di plasma ricco di piastrine (PRP)

1. Aferesi PRP
   1. Per questo protocollo, selezionare i donatori piastrinici secondo le leggi italiane: i donatori piastrinici devono avere 18-65 anni, con parametri normali di pressione ed emocromo e una conta piastrinica non inferiore a 180 x 10⁹ piastrine/L²³. I donatori idonei non possono assumere farmaci antiaggreganti piastrinici o anticoagulanti entro 1 settimana prima della donazione.
   2. Eseguire l'aferesi plasma-piastrinica utilizzando un sistema automatizzato di raccolta del sangue, secondo le istruzioni dei produttori e le leggi nazionali²³, per ottenere 1 unità di plasma ricco di piastrine (PRP) monodonatore. Raccogliere PRP in adenina citrato destrosio soluzione A (ACD-A) soluzione anticoagulante.
      NOTA: L'aferesi piastrinica viene condotta con una procedura continua; Il tempo di raccolta è compreso tra 40 min e 90 min. La quantità di ACD consegnata ai donatori e il tempo delle procedure dipendono dalle caratteristiche del donatore, ad esempio ematocrito e calibro dell'ago.
2. Caratteristiche delle unità PRP
   NOTA: Il passaggio successivo viene solitamente eseguito automaticamente dal sistema automatico di raccolta del sangue durante la procedura di aferesi plasma-piastrinica. Si prega di consultare il manuale di istruzioni del produttore.
   1. Risospendere le unità PRP raccolte per aferesi in una quantità adeguata di soluzione conservante con la minima quantità di plasma residuo, necessaria per mantenere il pH > 6,4 durante l'intero tempo di conservazione, ad un volume finale medio di 180 mL netti della soluzione anticoagulante (circa 40 ml).
      NOTA: Secondo la legge italiana, i controlli di qualità devono valutare che la conta piastrinica (PLT) sia di almeno 2,0 x 10 11 PLT / unità, mentre i leucociti residui devono essere inferiori a 1 x^{10 6} cellule / unità.
   2. Conservare il PRP leucodepletato e irradiato per un massimo di 5 giorni a 22 °C ± 2 °C su uno shaker piastrinico prima di un'ulteriore manipolazione²³.
3. Diluizione PRP
   1. Immediatamente prima di iniziare la diluizione del PRP, eseguire un conteggio PLT con un emocitometro utilizzando il campione raccolto dalla sacca principale attraverso una punta perforante.
      NOTA: Eseguire le fasi successive della sterilità sotto una cappa a rischio biologico di classe II. Indossare dispositivi di protezione individuale (camice da laboratorio, guanti e occhiali protettivi) durante la procedura.
   2. Diluire il PRP con una quantità adeguata di NaCl sterile allo 0,9% fino a una concentrazione finale di 0,32 x 10 9 ± 0,03 x 10⁹ PLT/ml, che simula la concentrazione media di PLT nel sangue periferico.
   3. Approfittando di un picco penetrante per sacche di sangue, dividere il PRP diluito in sacche di raccolta vuote da 300 ml per raggiungere un volume netto di 190 ml / sacchetto.
   4. Utilizzare un'aliquota di PRP diluito residuo (di solito 1 ml) per eseguire controlli di qualità che valutino possibili contaminazioni microbiche. Eseguire un test di sterilità seguendo le istruzioni del produttore in un laboratorio di microbiologia (vedere Tabella dei materiali).
      NOTA: Utilizzare flaconcini di coltura specifici per emocolture aerobiche, che sono in grado di eseguire la coltura qualitativa e il recupero di microrganismi aerobici (principalmente batteri e lieviti) da campioni di sangue di piccolo volume.
   5. Conservare i sacchetti di PRP diluiti a -80 °C per un massimo di 2 mesi prima dello scongelamento.

2. Preparazione del lisato plasmatico ricco di piastrine (PRP-L)

1. Scongelamento
   1. Prima di iniziare la procedura di scongelamento, assicurarsi che un bagno caldo sia impostato a 37 °C. Metti i sacchetti PRP nel bagno caldo e attendi fino a completo scongelamento.
2. Collezione PRP-L
   1. Centrifugare i sacchetti di PRP a 3000 x g per 30 minuti a temperatura ambiente.
      NOTA: I passaggi successivi devono essere eseguiti in sterilità sotto una cappa a rischio biologico di classe II.
   2. Sfruttando la punta perforante della sacca di trasferimento, collegare la sacca centrifugata con una sacca di trasferimento sterile vuota da 300 ml. Con attenzione, trasferire il surnatante PRP-L, evitando detriti, nella nuova borsa. Quando possibile, utilizzare una pressa per sacchetti.
   3. Sigillare il tubo di collegamento dell'unità PRP-L con un sigillatore per sacchetti.
3. Aliquota PRP-L
   NOTA: Un'unità di partenza contenente 190 mL di PRP (vedere punto 1.3.3.) è sufficiente per riempire due kit di colliri (per i dettagli sui dispositivi medici specifici utilizzati per l'applicazione e la conservazione dei colliri da emocomponenti, vedere la Tabella dei materiali). I kit di colliri devono essere aperti sotto un cappuccio di classe II con i flaconcini interi posizionati sopra la siringa precollegata e la freccia centrale del rubinetto rivolta verso sinistra per escludere il filtro antibatterico.
   1. Raccogliere 30-60 ml di PRP-L con una siringa sterile e collegare la siringa alla connessione Luer/lock sulla linea di riempimento.
   2. Secondo le istruzioni del produttore, ruotare il rubinetto di mezzo giro per aprire la linea tra la siringa contenente PRP-L e la siringa precollegata. Riempire la siringa precollegata con PRP-L.
   3. Scollegare la siringa PRP-L, chiudere il cappuccio del tubo della connessione luer/lock e ruotare il rubinetto di arresto nella posizione originale. Utilizzare la siringa del kit collirio per riempire i flaconcini con PRP-L.
   4. Ripetere la procedura dai passaggi 2.3.1.-2.3.3. fino a riempire tutti i flaconcini dell'applicatore. Assicurarsi che ogni applicatore sia riempito correttamente, quindi sigillarli individualmente con un sigillante per sacchetti.
   5. Ripetere la procedura con un nuovo kit di collirio.
   6. Utilizzare una piccola aliquota di PRP-L diluito residuo per valutare la possibile contaminazione microbica (vedere punto 1.3.4.).
      NOTA: Se il liquido raggiunge accidentalmente il filtro antibatterico all'estremità della stringa, la siringa di aspirazione può opporre resistenza, ostacolando il riempimento. Per continuare il ciclo di riempimento, sollevare la sezione terminale della corda per circa 5/6 aliquote dal filtro idrofobo antibatterico all'estremità della corda. In questa posizione, utilizzare una nuova siringa sterile (di 30 mL di volume) che è già stata riempita d'aria. Collegare il luer/lock femmina del filtro antibatterico e premere con forza e ripetutamente sullo stantuffo della siringa per rimuovere tutti i residui di emocomponenti e rendere la membrana del filtro antibatterico libera dal liquido. Rimuovere la siringa e riempire i flaconcini rimanenti.
4. Archiviazione PRP-L
   1. Etichettare correttamente ogni applicatore e metterli in un sacchetto di plastica. Etichettare anche il sacchetto di plastica, avendo cura di evidenziare il gruppo sanguigno del donatore.
   2. Conservare a -80 °C per un massimo di 24 mesi prima dell'assegnazione del paziente, secondo la legge²³ e le linee guida²⁴.

3. Dispensa PRP-L

1. Eseguire l'assegnazione del paziente preferibilmente abbinando il gruppo sanguigno PRP-L. Fornire i flaconcini dell'applicatore PRP-L utilizzando una scatola frigorifera e assicurarsi che ogni flaconcino dell'applicatore contenga 1,45 ml di PRP-L, che corrisponde a circa 45 gocce. Informare il paziente che i flaconcini dell'applicatore possono essere conservati a casa dei pazienti fino a 1 mese a -15 °C.

Risultati

Il razionale per l'uso di colliri derivati dal siero (che è il prodotto a base di sangue più frequentemente utilizzato per il trattamento delle malattie della superficie oculare) risiede nel loro contenuto di GF, che sono quasi completamente derivati dalle piastrine circolanti. Il PRP contiene un numero significativamente più elevato di piastrine (e, di conseguenza, di GF derivate dalle piastrine) rispetto al siero del sangue periferico, compreso tra 0,15 x 10 9-0,45 x 10⁹ PLT / ml. Secondo le le...

Discussione

Negli ultimi anni è aumentato l'uso clinico di prodotti a base piastrinica per le patologie della superficie oculare, ma la loro diffusione è ostacolata dalla mancanza di robustezza scientifica. Ciò è causato principalmente dall'ampia eterogeneità delle fonti dei donatori e dei protocolli di preparazione, che spesso non sono completamente divulgati o non specificamente progettati per lo scopo per il quale sono dispensati. In particolare, mancano ancora informazioni sui prodotti a base piastrinica raccolti per aferes...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
CompoSeal Mobilea II	Fresenius Kabi, Germany		bag sealer
HeraSafe hood	Heraeus Instruments, Germany		Class II biohazard hood
MCS+ 9000 Mobile Platelet Collection System	Haemonetics, Italy		automated plasma and multicomponent collection equipment for donating platelet, red cell, plasma, or combination blood components
Platelet shaker, PF396i	Helmer, USA		Platelet shaker
Raycell X-ray Blood Irradiator	MDS Nordion, Canada		X-ray Blood Irradiator
ROTIXA 50RS	Hettich Zentrifugen, Germany		High speed entrifuge
Sysmex XS-1000i	Sysmex Europe GMBH, Germany		haemocytometer for platelet count
Warm bath, WB-M15	Falc Instruments, Italy		Warm bath
Materials
ACD-A anticoagulant solution A	Fenwal Inc., USA	DIN 00788139	anticoagulant solution for platelet apheresis (1000 ml)
BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials	BD Biosciences, USA	BD 442020	Sterility assay
BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials	BD Biosciences, USA	442020	At least 2 vials for sterility assay
BD Luer Lok Syringe	BD Plastipack, USA	300865	At least 4 sterile syringes (50 ml)
Bio-Plex Human Cancer Panel 1	BioRad Laboratories, USA	171AC500M	Standard panel for PDGF isoforms assessment
Bio-Plex Human Cancer Panel 2	BioRad Laboratories, USA	171AC600M	Standard panel for EGF assessment
Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader	BioRad Laboratories, USA	Magpix	This instrument allows multiple immunoassays using functionalized magnetic beads.
Bio-Plex Pro TGF-b Assay	BioRad Laboratories, USA	10024984	Set and standards for TGFb isoforms assessment
BioRet	ARIES s.r.l., Italy	A2DH0020	At least 4 piercing spike for blood bags
Blood collection tube	BD Vacutainer, USA	367835	1 tube, necessary to perform platelet counts
Eye drops kit. COL Medical Device for the application and preservation of eye drops from haemocomponents	Biomed Device s.r.l., Italy	COLC50	Eye drops kit. At least 2 kits for each PRP unit collected
Human Cancer PDGF-AB/BB Set 1x96well	BioRad Laboratories, USA	171BC511	Set for PDGF isoforms assessment
Human Cancer2 EGF Set 1x96well	BioRad Laboratories, USA	171BC603M	Set for EGF assessment
NaCl 0.9% sterile solution	Baxter S.p.A., Italy	B05BB01	1000 ml
OSDI Questionnaire	Allergan Inc., USA	OSDI	Ocular Surface Disease Index Questionnaire
Piercing spike	BioRet ARIES s.r.l., Italy	BS051004	Spike
Platelet Additive Solution A+ T-PAS+	TERUMO BCT Inc., Italy	40842	preservative solution for platelet concentrates (1000 ml)
Software Excel	Microsoft, USA	Excel	Data analysis software
Teruflex Transfer bag 1000 ml	TERUMO BCT Inc., Italy	BB*T100BM	1 for PRP dilution
Teruflex Transfer bag 300 ml	TERUMO BCT Inc., Italy	BB*030CM	At least 6 for each PRP unit collected