Обогащенный тромбоцитами плазменный лизат для лечения заболеваний глазной поверхности

Резюме

Лизаты тромбоцитов представляют собой новое средство для лечения заболеваний глазной поверхности. Здесь мы предлагаем способ приготовления, дозирования, хранения и характеристики лизата тромбоцитов, собранного у доноров тромбоцитов.

Аннотация

Различные заболевания глазной поверхности лечатся глазными каплями, полученными из крови. Их применение введено в клиническую практику из-за содержания в них метаболита и фактора роста, что способствует регенерации поверхности глаза. Глазные капли на основе крови могут быть приготовлены из разных источников (например, донорство цельной крови или афереза тромбоцитов), а также с различными протоколами (например, различные разведения и циклы замораживания / оттаивания). Эта изменчивость препятствует стандартизации клинических протоколов и, следовательно, оценке их клинической эффективности. Детализация методологических процедур и обмен ими могут способствовать определению общих руководящих принципов. В последние годы аллогенные продукты распространяются в качестве альтернативы аутологичным методам лечения, поскольку они гарантируют более высокие стандарты эффективности; среди них глазные капли, богатые тромбоцитами лизат плазмы (PRP-L), готовятся с помощью простых производственных процедур. В отделении трансфузионной медицины в AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, Италия, PRP-L получают из донорства тромбоцитарного афереза. Этот продукт первоначально разбавляют до 0,3 х 10⁹ тромбоцитов/мл (начиная со средней концентрации 1 х 10⁹ тромбоцитов/мл) в 0,9% NaCl. Разбавленные тромбоциты замораживают/размораживают и, впоследствии, центрифугируют для удаления мусора. Конечный объем расщепляют на 1,45 мл аликвот и хранят при −80 °C. Перед выдачей пациентам глазные капли проверяются на стерильность. Пациенты могут хранить лизаты тромбоцитов при −15 °C в течение 1 месяца. Состав фактора роста также оценивается по случайно выбранным аликвотам, а средние значения сообщаются здесь.

Введение

Продукты, полученные из крови, широко используются в уходе за ранами¹, челюстно-лицевой и ортопедической хирургии, а также для лечения различных заболеваний глазной поверхности², таких как болезнь сухого глаза (DED)³. При DED гомеостаз слезной пленки нарушается вследствие аномального функционирования различных факторов, участвующих в образовании разрыва и целостности поверхности глаза ^4,5.

DED характеризуется неоднородностью причин и^{тяжести 6,7,8} и может быть следствием различных факторов, таких как старение, пол⁹, контактные линзы, актуальные или системные лекарства¹⁰ или ранее существовавшие состояния, такие как синдром Шегрена¹⁰. Несмотря на легкие симптомы, DED поражает миллионы людей во всем мире, влияя на качество их жизни и систему здравоохранения, а также⁶.

Сообщалось о многих методах лечения этой патологии, но до сих пор нет единого мнения о наиболее эффективном решении¹². На сегодняшний день искусственные слезы являются первым направлением терапии, направленной на восстановление водного состава слезной пленки, хотя эти заменители не содержат основных биологически активных растворенных веществ природных слез ^6,11. Продукты на основе тромбоцитов считаются действительной альтернативой ^12,13 искусственным слезам, хотя их клиническая эффективность, рекомендации по применению и методы приготовления все еще являются предметом споров 3.

Продукты на основе крови имеют схожий состав с точки зрения метаболитов¹⁴, белков, липидов, витаминов, ионов, факторов роста (ГФ), антиоксидантных соединений¹¹ и осмолярности (300 мОсм/л)¹¹. Благодаря синергетической активности своих компонентов они способствуют регенерации эпителия роговицы, ингибируют высвобождение воспалительных цитокинов, увеличивают количество бокаловидных клеток и экспрессию муцинов в конъюнктиве ^2,3.

До сих пор гетерогенность в офтальмологических продуктах на основе крови была задокументирована в литературе; эти продукты могут быть классифицированы в соответствии с происхождением доноров крови, то есть аутологичными или аллогенными, а также источником крови, то есть периферической кровью, пуповинной кровью, сывороткой или тромбоцитами.

Хотя аутологичные продукты были наиболее распространенными³, аллогенные в настоящее время становятся предпочтительным выбором, поскольку они обеспечивают более высокие стандарты эффективности и безопасности¹⁵, а также значительное снижение затрат^16,17. Предыдущие исследования, действительно, доказали, что продукты на основе крови, полученные от пациентов с аутоиммунными и/или системными заболеваниями, могут демонстрировать измененное качество и функциональность ^6,16,17. Несмотря на то, что глазные капли на основе сыворотки являются наиболее распространенными, продукты на основе тромбоцитов в последнее время утверждаются в качестве действительной альтернативы, поскольку их можно легко приготовить, сохраняя при этом значительный уровень эффективности ^3,11. Доступные в настоящее время продукты на основе тромбоцитов можно разделить на обогащенную тромбоцитами плазму (PRP), обогащенную тромбоцитами плазменный лизат (PRP-L) и плазму, богатую факторами роста (PRGF)³.

Среди них PRP-L имеет то преимущество, что является замороженным продуктом с длительным сроком службы. PRP-L может быть получен из афереза, баффи-шерсти или даже из истекающих тромбоцитов (PLTs)^18,19, что значительно снижает их потери. Аликвоты могут храниться в течение нескольких месяцев в центрах переливания крови при -80 ° C или даже в домах пациентов при -15 ° C в течение более коротких периодов времени.

PRP-L сильно обогащены ГФ, которые, как было доказано, стимулируют регенерацию поверхности глаза 12,20,21. Тем не менее, есть только несколько сообщений о клинических исследованиях в этой области, и все они использовали аутологичные источники ^3,22. PRP-L по-прежнему нуждается в дальнейшей валидации и характеристике, прежде чем его можно будет регулярно использовать для лечения заболеваний глазной поверхности, поскольку нет стандартизированных руководящих принципов для его приготовления, дозирования и хранения³.

Здесь используется подробный протокол для производства PRP-L, используемого в отделении трансфузионной медицины в AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, Италия, и диспенсации пациентам с DED. Мы стремимся помочь научному сообществу разработать стандартные методы приготовления, которые могут повысить однородность и согласованность во всемирных исследованиях и клинических подходах.

протокол

PRP-L, используемый для количественной оценки факторов роста, был собран в рамках более широкого исследования по характеристике продуктов PRP для регенеративных целей, проведенного в AUSL-IRCCS di Reggio Emilia и одобренного Этическим комитетом Area Vasta Emilia Nord 10 января 2019 года (протокол No 2019/0003319). Доноры дали свое информированное согласие в соответствии с Хельсинкской декларацией. Для сбора агрегированных анонимных данных индекса глазных поверхностных заболеваний (OSDI) не требовалось никакого этического одобрения, который обычно используется клиницистами для мониторинга симптомов синдрома сухого глаза. На рисунке 1A показан контур используемого протокола, в то время как на рисунках на рисунке 1B показаны основные этапы процедуры.

1. Коллекция обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP)

1. PRP аферез
   1. Для этого протокола выбирают доноров тромбоцитов согласно итальянским законам: донорам тромбоцитов должно быть 18-65 лет, с нормальным давлением и показателями анализа крови и количеством тромбоцитов не менее 180 х 10⁹ тромбоцитов/л²³. Правомочные доноры не могут принимать антиагрегантные или антикоагулянтные препараты в течение 1 недели до донорства.
   2. Выполняют плазмо-тромбоцитарный аферез с использованием автоматизированной системы забора крови, в соответствии с инструкциями производителей и национальным законодательством²³, для получения 1 единицы однодонорской плазмы, богатой тромбоцитами (PRP). Собирают PRP в растворе антикоагулянта аденина цитрата декстрозы А (ACD-A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тромбоцитарный аферез проводится с непрерывной процедурой; время сбора находится в диапазоне от 40 мин до 90 мин. Количество ACD, доставленного донорам, и время процедур зависят от характеристик донора, например, гематокрита и иглы.
2. Характеристики блоков PRP
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий этап обычно выполняется автоматически автоматизированной системой сбора крови во время процедуры плазма-тромбоцит-аферез. Пожалуйста, ознакомьтесь с инструкцией производителя.
   1. Повторно суспендировать собранные аферезом блоки PRP в достаточном количестве консервирующего раствора с минимальным количеством остаточной плазмы, необходимой для поддержания рН > 6,4 в течение всего времени хранения, до среднего конечного объема 180 мл нетто раствора антикоагулянта (около 40 мл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Согласно итальянскому законодательству, контроль качества должен оценивать, что количество тромбоцитов (PLT) составляет не менее 2,0 х 10¹¹ PLT / единица, в то время как остаточные лейкоциты должны быть менее 1 х 10⁶ клеток / единица.
   2. Храните лейкодерный и облученный PRP в течение максимум 5 дней при температуре 22 °C ± 2 °C на тромбоцитарном шейкере перед дальнейшими манипуляциями²³.
3. Разбавление PRP
   1. Непосредственно перед началом разведения PRP выполните подсчет PLT с помощью гемоцитометра, используя образец, собранный из основного мешка через пронзительный шип.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие шаги по стерильности под капотом биологической опасности класса II. Носите средства индивидуальной защиты (лабораторное пальто, перчатки и защитные очки) во время процедуры.
   2. Разбавляют PRP достаточным количеством стерильного 0,9% NaCl до конечной концентрации 0,32 х 10⁹ ± 0,03 х 10⁹ PLTs/мл, что имитирует среднюю концентрацию PLT в периферической крови.
   3. Используя колющий шип для мешков с кровью, разделите разбавленный PRP на пустые мешки для сбора по 300 мл, чтобы достичь чистого объема 190 мл / мешок.
   4. Используйте аликвоту остаточного разбавленного PRP (обычно 1 мл) для проведения контроля качества, оценивая возможные микробные загрязнения. Выполните анализ стерильности в соответствии с инструкциями производителя в микробиологической лаборатории (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используют культуральные флаконы, специфичные для аэробных культур крови, которые способны выполнять качественную культивацию и восстановление аэробных микроорганизмов (в основном бактерий и дрожжей) из небольших объемов образцов крови.
   5. Храните разбавленные мешки PRP при температуре −80 °C в течение максимум 2 месяцев перед размораживанием.

2. Препарат лизата плазмы, богатого тромбоцитами (PRP-L)

1. Таяние
   1. Перед началом процедуры оттаивания убедитесь, что теплая ванна установлена при температуре 37 °C. Положите мешки PRP в теплую ванну и подождите, пока полностью не разморозитесь.
2. Коллекция PRP-L
   1. Центрифугируйте мешки PRP по 3000 х г в течение 30 мин при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги должны быть выполнены в стерильности под капюшоном биологической опасности класса II.
   2. Используя пронзительный шип трансферного мешка, соедините центрифугированный мешок с пустым стерильным мешком для переноса 300 мл. Осторожно перенесите супернатант PRP-L, избегая мусора, в новый мешок. По возможности используйте пресс для пакетов.
   3. Запечатайте соединительную трубку блока PRP-L с помощью запайщика мешков.
3. Аликвотация PRP-L
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пусковой блок, содержащий 190 мл PRP (см. шаг 1.3.3.), достаточен для заполнения двух наборов глазных капель (подробную информацию о конкретных медицинских устройствах, используемых для применения и сохранения глазных капель из компонентов крови, см. в Таблице материалов). Наборы глазных капель должны открываться под капюшоном класса II, при этом все пузырьки струны расположены над предварительно соединенным шприцем, а центральная стрелка запорного крана направлена влево, чтобы исключить антибактериальный фильтр.
   1. Соберите 30-60 мл PRP-L стерильным шприцем и свяжите шприц с соединением Luer/lock на линии розлива.
   2. Согласно инструкции производителя, поверните запорный кран на половину оборота, чтобы открыть линию между PRP-L-содержащим шприцем и предварительно соединенным шприцем. Заполните предварительно подключенный шприц PRP-L.
   3. Отсоедините шприц PRP-L, закройте крышку трубки соединения luer/lock и поверните запорный кран в исходное положение. Используйте шприц для набора глазных капель, чтобы заполнить флаконы PRP-L.
   4. Повторите процедуру, описанную в шагах 2.3.1.-2.3.3. до тех пор, пока не будут заполнены все флаконы аппликатора. Убедитесь, что каждый аппликатор правильно заполнен, а затем индивидуально запечатайте их с помощью запайщика пакетов.
   5. Повторите процедуру с новым набором глазных капель.
   6. Используйте небольшую аликвоту остаточной разбавленной PRP-L для оценки возможного микробного загрязнения (см. этап 1.3.4.).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если жидкость случайно попадает в антибактериальный фильтр на конце струны, всасывающий шприц может противостоять сопротивлению, препятствуя наполнению. Чтобы продолжить цикл заполнения, поднимите конец струны примерно на 5/6 аликвот от антибактериального гидрофобного фильтра на конце струны. В таком положении используйте новый стерильный шприц (объемом 30 мл), который уже заполнен воздухом. Подключите женский люер/замок антибактериального фильтра и нажмите сильно и многократно на плунжер шприца, чтобы удалить все остатки компонента крови и сделать мембрану антибактериального фильтра свободной от жидкости. Снимите шприц и заполните оставшиеся флаконы.
4. Хранение PRP-L
   1. Правильно маркируйте каждый аппликатор и положите их в полиэтиленовый пакет. Также пометьте пластиковый пакет, позаботившись о том, чтобы подчеркнуть группу крови донора.
   2. Хранить при температуре −80 °C в течение максимум 24 месяцев до назначения пациента, в соответствии с итальянским законом²³ и руководящими принципами²⁴.

3. Диспенсация PRP-L

1. Выполнять назначение пациенту предпочтительно путем сопоставления группы крови PRP-L. Доставьте флаконы с аппликатором PRP-L, используя холодную коробку, и убедитесь, что каждый флакон аппликатора содержит 1,45 мл PRP-L, что соответствует примерно 45 каплям. Проинструктируйте пациента о том, что флаконы-аппликаторы могут храниться на дому у пациентов до 1 месяца при температуре −15 °C.

Результаты

Обоснование использования глазных капель сывороточного происхождения (которые являются продуктом на основе крови, наиболее часто используемым для лечения заболеваний поверхности глаза) заключается в содержании в них ГФ, которые почти полностью получены из циркулирующих тромбоцитов...

Обсуждение

В последние годы увеличилось клиническое применение препаратов на основе тромбоцитов при патологиях глазной поверхности, но их диффузии препятствует отсутствие научной достоверности. Это в основном вызвано широкой неоднородностью донорских источников и протоколов подготовки, кото?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
CompoSeal Mobilea II	Fresenius Kabi, Germany		bag sealer
HeraSafe hood	Heraeus Instruments, Germany		Class II biohazard hood
MCS+ 9000 Mobile Platelet Collection System	Haemonetics, Italy		automated plasma and multicomponent collection equipment for donating platelet, red cell, plasma, or combination blood components
Platelet shaker, PF396i	Helmer, USA		Platelet shaker
Raycell X-ray Blood Irradiator	MDS Nordion, Canada		X-ray Blood Irradiator
ROTIXA 50RS	Hettich Zentrifugen, Germany		High speed entrifuge
Sysmex XS-1000i	Sysmex Europe GMBH, Germany		haemocytometer for platelet count
Warm bath, WB-M15	Falc Instruments, Italy		Warm bath
Materials
ACD-A anticoagulant solution A	Fenwal Inc., USA	DIN 00788139	anticoagulant solution for platelet apheresis (1000 ml)
BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials	BD Biosciences, USA	BD 442020	Sterility assay
BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials	BD Biosciences, USA	442020	At least 2 vials for sterility assay
BD Luer Lok Syringe	BD Plastipack, USA	300865	At least 4 sterile syringes (50 ml)
Bio-Plex Human Cancer Panel 1	BioRad Laboratories, USA	171AC500M	Standard panel for PDGF isoforms assessment
Bio-Plex Human Cancer Panel 2	BioRad Laboratories, USA	171AC600M	Standard panel for EGF assessment
Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader	BioRad Laboratories, USA	Magpix	This instrument allows multiple immunoassays using functionalized magnetic beads.
Bio-Plex Pro TGF-b Assay	BioRad Laboratories, USA	10024984	Set and standards for TGFb isoforms assessment
BioRet	ARIES s.r.l., Italy	A2DH0020	At least 4 piercing spike for blood bags
Blood collection tube	BD Vacutainer, USA	367835	1 tube, necessary to perform platelet counts
Eye drops kit. COL Medical Device for the application and preservation of eye drops from haemocomponents	Biomed Device s.r.l., Italy	COLC50	Eye drops kit. At least 2 kits for each PRP unit collected
Human Cancer PDGF-AB/BB Set 1x96well	BioRad Laboratories, USA	171BC511	Set for PDGF isoforms assessment
Human Cancer2 EGF Set 1x96well	BioRad Laboratories, USA	171BC603M	Set for EGF assessment
NaCl 0.9% sterile solution	Baxter S.p.A., Italy	B05BB01	1000 ml
OSDI Questionnaire	Allergan Inc., USA	OSDI	Ocular Surface Disease Index Questionnaire
Piercing spike	BioRet ARIES s.r.l., Italy	BS051004	Spike
Platelet Additive Solution A+ T-PAS+	TERUMO BCT Inc., Italy	40842	preservative solution for platelet concentrates (1000 ml)
Software Excel	Microsoft, USA	Excel	Data analysis software
Teruflex Transfer bag 1000 ml	TERUMO BCT Inc., Italy	BB*T100BM	1 for PRP dilution
Teruflex Transfer bag 300 ml	TERUMO BCT Inc., Italy	BB*030CM	At least 6 for each PRP unit collected